專利名稱：非靶位點胺基被保護的肽,其制備方法以及使用該肽制備特異性地結(jié)合的peg肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將至少一個PEG(聚乙二醇)特異性地結(jié)合到具有至少兩個支鏈胺基的合成肽的靶位點胺基的方法，本發(fā)明還進一步涉及非靶位點胺基被選擇性地保護的合成肽及其生產(chǎn)方法，以及將PEG特異性地結(jié)合到合成肽的靶位點并通過離子交換色譜法進行純化的方法。
背景技術(shù)：
將PEG結(jié)合到肽和蛋白質(zhì)的技術(shù)基于Davis和Abuchowski的研究(Abuchowski A.等，J.Biol.Chem.，252，3571-3581，1977；Abuchowski A.等，J Biol.Chem.，252，3582-3586，1977)。PEG是一種具有H(OCH2CH2)nOH結(jié)構(gòu)的親水性、生物相容性且無害的聚合物，并已知當結(jié)合到肽和蛋白質(zhì)時，其以與糖蛋白中的糖鏈相同的方式通過位阻抑制酶促代謝，由于結(jié)合有PEG的肽和蛋白質(zhì)的分子尺寸增加而減少腎小球的濾過，從而增加生理活性的持續(xù)時間。多肽和PEG之間的共價結(jié)合公開于USP No.4179337中，并且據(jù)記載以PEG修飾蛋白質(zhì)和酶可導致免疫原性和抗原性下降及在血液內(nèi)的半衰期增加。
為使PEG共價鍵合到多肽上，必須進行將PEG的末端羥基轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)性官能基的“活化”過程。作為“經(jīng)活化的PEG”，可列舉烷基化劑如PEG醛、PEG環(huán)氧化物和PEG tresylate、酰化劑如PEG酯，且典型實例為PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯。聚乙二醇-N-琥珀酰亞胺碳酸酯及其生產(chǎn)方法從Abuchowski等，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)和USP No.512614等獲知?？墒褂梅肿臃秶?,000-40,000的PEG以及如甲氧基化的PEG和支化PEG等各種PEG。支化PEG可用R(-PEG-OH)m結(jié)構(gòu)代表[其中，R定義為中心基團如季戊四醇或丙三醇，m定義為范圍在3-100內(nèi)的支鏈數(shù)]。羥基可用于化學修飾。還采用其它具有(CH3O-PEG-)pR-X(WO96/21469)結(jié)構(gòu)的支化PEG[其中，p為2至3，R代表中心基團如賴氨酸和丙三醇，X定義為用于活化的官能團如羧基]。另一支化PEG的側(cè)鏈PEG具有的官能團如羧基是在PEG骨架上，而不是在PEG鏈的末端。所有這些支化PEG都可通過前述“活化”過程使用。
通常，在將“經(jīng)活化的”PEG結(jié)合到肽胺基上的反應(yīng)中，PEG非特異性地鍵合于一個或更多個胺基上，因此該技術(shù)的核心就在于將PEG分子特異性地結(jié)合到特定位置的胺基上的方法。然而，如果肽的氨基酸序列中包含至少一個賴氨酸，由于其中存在兩個或更多個胺基，因此很難將PEG特異性結(jié)合到特定位點的胺基上。如果根據(jù)一般的方法將PEG結(jié)合到肽上則會產(chǎn)生多種結(jié)合物，從具有一個結(jié)合PEG的結(jié)合物到具有和胺的數(shù)目一樣多的多重結(jié)合PEG的結(jié)合物，甚至當結(jié)合物僅含有一個PEG時(單PEG結(jié)合物)，也會形成PEG結(jié)合位點互不相同的位置異構(gòu)體。通常，肽的PEG結(jié)合物的活性和酶促代謝根據(jù)結(jié)合PEG的數(shù)目及其結(jié)合位點的不同而不同，因此產(chǎn)生這種含有多種結(jié)合物的混合物的方法由于活性成分收率很低且又是混合物的原因是不利的。從混合物中分離純化特定異構(gòu)體是很復雜的，且收率低、成本高。為彌補這些缺點，已提出多種位點特異性聚乙二醇化的方法，然而，還未開發(fā)出將PEG特異性結(jié)合到特定位置的胺基上的有效方法。
Chem.Pharm.Bull.39(12)3373-3375(1991)報道了與纖連蛋白相關(guān)的三肽(Arg-Gly-Asp)和氨基聚乙二醇的結(jié)合物及其活性。其中，提出一種通過將氨基PEG結(jié)合到以二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)/1-羥基苯并三唑(HOBt)活化的天冬氨酸而制備PEG結(jié)合物的方法。然而，該方法的缺陷在于它僅能用于C-端的修飾，并且在肽的C-端活化期間，可能出現(xiàn)相鄰氨基酸的外消旋化。這種外消旋化可能出現(xiàn)于除甘氨酸之外的所有氨基酸中，結(jié)果導致肽活性的下降。
用合成樹脂將單甲氧基聚乙二醇(mPEG)或聚乙烯醇(PVA)結(jié)合到肽上的方法發(fā)表于Journal of Protein Chemistry 10(6)623-627(1991)。因為從該方法僅能得到其中單一聚合物結(jié)合到肽N-端的結(jié)合物，因此其不能提供將PEG結(jié)合到能最大化聚乙二醇化效果的位置上的方法(最大化肽活性的持續(xù)時間并且最小化酶促代謝)。
PCT專利申請No.PCT/US94/06953(1994)提供在肽合成過程中引入PEG的制備位點特異性PEG肽的方法。更確切地說，它提供一種制備PEG結(jié)合肽的方法，其中在序列到達靶位置的賴氨酸以前結(jié)合肽是部分合成的，然后結(jié)合PEG，最后合成肽的剩余部分得到完整的PEG肽；一種通過使用其中Nα-氨基用Fmoc(9-芴基甲氧羰基)保護且其支鏈胺基與PEG結(jié)合的賴氨酸作為靶位點賴氨酸制備PEG肽的方法；一種其中單獨合成具有PEG結(jié)合到靶位點胺基上的肽片段以及其余的肽片段再使之結(jié)合生成完整的PEG結(jié)合肽的方法。不過，由于先前結(jié)合的PEG對后續(xù)合成步驟的影響，這些方法可能帶來不希望的結(jié)果。例如，如果在肽合成期間引入PEG并繼續(xù)合成剩余部分，可能會產(chǎn)生氨基酸序列缺少至少一個氨基酸的肽，而這種肽可能對活體有害且?guī)缀醪豢赡芗兓?。因此，該方法作為制備用作藥物的PEG結(jié)合肽的方法是不可取的。
PCT專利申請No.PCT/EP98/07748提供多種方法用于在有機溶劑中將PEG結(jié)合到GRF的胺基上并通過凝膠色譜和反相色譜純化所得的Lys(PEG)12-GRF、Lys(PEG)21-GRF、Lys(PEG)12，21-GRF以及[Nα-PEG-Try1，Lys(PEG)12，21]-GRF的混合物。然而，該方法在Nα、Lys12和Lys21的胺基之間無特異性。所述專利同樣也提供[Lys(Alloc)12，21]-GRF(1-29)與[Nα-異丙基-Try1，Lys(Alloc)12]-GRF(1-29)的合成方法以及用它們進行的特異性聚乙二醇化方法，然而，就[Lys(Alloc)12，21]-GRF(1-29)而言，PEG僅能結(jié)合于Nα-胺基，而不能提供如上述專利所述的最有效的Lys21-PEG結(jié)合物的制備方法。此外，如果使用[Nα-異丙基-Try1，Lys(Alloc)12]-GRF(1-29)制備PEG結(jié)合物，那么所形成的不是GRF(1-29)-NH2的PEG結(jié)合物，而是[Nα-異丙基-Try1]-GRF(1-29)-NH2的PEG結(jié)合物，即[Nα-異丙基-Try1，Lys(PEG)21]-GRF(1-29)。因此，該方法不能為具有N-端胺基的初始肽GRF(1-29)-NH2提供完全特異性的聚乙二醇化。
本發(fā)明的發(fā)明者旨在開發(fā)通過形成其中PEG僅結(jié)合到靶位點胺基上的最終產(chǎn)物同時避免生成PEG結(jié)合到非靶位點胺基上的雜質(zhì)產(chǎn)物的特異性聚乙二醇化方法，從而通過該方法可以明顯提高產(chǎn)物收率并降低分離純化最終產(chǎn)物所需的努力和費用。
本發(fā)明提供制備特異性PEG結(jié)合肽的方法，其中通過使PEG完全選擇性地僅結(jié)合于靶位點胺基而使PEG結(jié)合的效果最大化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及非靶位點胺基被選擇性地保護的合成肽，其制備方法以及將PEG特異性地結(jié)合到合成肽的靶位點的方法。更詳細而言，本發(fā)明涉及(A)制備非靶位點胺基被選擇性地保護的肽的方法，其包括用不同的可在不同的解封閉條件下除去的保護基{如，ivDde[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環(huán)己基)-3-甲基丁基]或Mtt(4-甲基一三苯甲基)和Boc(叔丁氧羰基)}分別封閉靶位點胺基和非靶位點胺基，以及用Fmoc或Nsc保護Nα-胺基，從而合成肽，(B)由所述方法制備的非靶位點胺基被選擇性地保護的肽，以及(C)制備特異性結(jié)合PEG的肽的方法，其中PEG特異性地結(jié)合到靶位點胺基上，其包括(1)將所述肽與經(jīng)活化的PEG反應(yīng)，以及(2)在酸-堿解封閉條件下除去所述步驟(1)中獲得的化合物中的胺基封閉基團。
本發(fā)明還涉及制備非靶位點胺基被選擇性地保護的肽的方法，其另外還包含用最終胺基保護基(final amine protecting group)取代如上所述合成的肽的非靶位點胺基包括Nα-胺基的保護基的步驟。
作為最終胺基保護基，可以使用至少Fmoc、Nsc、Dde、ivDde以及堿性條件下可除去的其它保護基中之一，或可使用至少Boc以及酸性條件下可除去的其它保護基中之一。
一種合成肽的一般方法是重復下列反應(yīng)將Nα-胺基被保護的C-端氨基酸的羧基結(jié)合到樹脂上，在堿性條件下實施胺基的解封閉，并根據(jù)序列結(jié)合下一個Nα-胺基被保護的氨基酸，這樣達到N-端氨基酸。如果在氨基酸序列中包含帶支鏈胺基的賴氨酸，則可使用其中支鏈胺基用酸性條件可脫去的Boc保護且Nα-胺基用堿性條件可脫去的Fmoc或Nsc[4-硝基苯基磺?；已趸驶鵠保護的賴氨酸，從而使支鏈胺基在用于結(jié)合后續(xù)的氨基酸的Nα-胺基解封閉的條件下不會被脫封閉。然而，當肽含有至少兩個支鏈胺基時，由于支鏈胺基難以區(qū)別，故難以合成完全被選擇性地保護的肽。在合成含有至少兩個支鏈胺基的肽時，本發(fā)明的發(fā)明者合成了以下被選擇性地保護的肽，其中各支鏈胺基可基于使用Fmoc或Nsc作為Nα-胺基保護基并使用兩種可在不同條件下被除去的胺基保護基即Boc和ivDde或Mtt作為支鏈胺基保護基的酸-堿解封閉處理而簡單地加以區(qū)分，且基于這一點，開發(fā)出完全特異性的聚乙二醇化方法，從而完成了本發(fā)明。區(qū)分非靶位點支鏈胺基和N-端胺基及分別使用不同的保護基的原因是在肽的合成中只有N-端胺基應(yīng)該選擇性地參與反應(yīng)。根據(jù)聚乙二醇化條件下必須具有的穩(wěn)定性，在肽合成最后一步中可用其他保護基取代非靶位點胺基。因為該方法僅通過改變酸堿條件就能夠合成被選擇性地保護的肽，所以與基于還原反應(yīng)或烯丙基取代的方法相比，其優(yōu)勢在于反應(yīng)簡單、經(jīng)濟，所得肽的純度高。
例如，作為本發(fā)明特定的具體實施方案，可列舉下列方法。
在其中靶位點支鏈胺基用Boc保護而非靶位點支鏈胺基用ivDde保護的方法中，在引入靶位點賴氨酸的步驟中，使用其中Nα-胺基以Fmoc或Nsc保護而支鏈胺基以Boc保護的賴氨酸合成肽，且在引入其它位點的賴氨酸的步驟中，使用其中Nα-氨基以Fmoc或Nsc保護而支鏈胺基以ivDde保護的賴氨酸用于肽的合成。在合成過程中，在Fmoc或Nsc的解封閉條件如1％DBU(1，8-二氮雜雙環(huán)[5，4，0]十一碳-7-烯)-20％哌啶/DMF(N，N-二甲基甲酰胺)下，ivDde沒有被除去。就合成的肽-樹脂(以Boc保護靶位點支鏈胺基，以ivDde保護非靶位點支鏈胺基，以Fmoc或Nsc保護N-端胺基)而言，在于非靶位點支鏈胺基上的ivDde以及于N-端胺基上的Fmoc被除去后，用Fmoc或Nsc保護由此得到的游離胺基{例如，通過與Fmoc-Osu(9-芴基甲氧羰基一琥珀酰胺)或Nsc-Osu反應(yīng)}。此時，例如可通過用2％肼溶液處理實施所述解封閉反應(yīng)。用裂解溶液(例如，三異丙基硅烷(TIS)∶水∶三氟乙酸(TFA)＝2.5∶2.5∶95)處理該肽-樹脂，將肽自樹脂分離，同時除去靶位點胺基上的Boc，從而獲得非靶位點胺基被Fmoc或Nsc保護的肽。
在其中靶位點支鏈胺基用Boc保護而非靶位點胺基用Mtt保護的方法中，在引入靶位點賴氨酸的步驟中，使用其中以Fmoc或Nsc保護Nα-胺基并以Boc保護支鏈胺基的賴氨酸合成肽，在于其它位點引入賴氨酸的步驟中，使用其中以Fmoc或Nsc保護Nα-胺基且以Mtt保護支鏈胺基的賴氨酸合成肽。在合成過程中，在用于除去Fmoc或Nsc的堿性條件下Mtt沒有被除去。使這樣合成的肽-樹脂(以Boc保護靶位點支鏈胺基，以Mtt保護非靶位點支鏈胺基，以Fmoc或Nsc保護N-端胺基)除去非靶位點支鏈胺基上的Mtt。例如可通過以1％TFA/MC(二氯甲烷)處理實施所述解封閉。此時，靶位點處的胺基保護基Boc未被除去。將該肽-樹脂(以Boc保護靶位點支鏈胺基，以Fmoc或Nsc保護N-端胺基，且暴露非靶位點支鏈胺基)與Fmoc-Osu或Nsc-Osu反應(yīng)以用Fmoc或Nsc保護非靶位點支鏈胺基，然后通過裂解溶液(例如，TIS∶水∶TFA＝2.5∶2.5∶95)除去靶位點處的胺基保護基Boc，得到被選擇性地保護的肽(靶位點胺基暴露而非靶位點胺基以Fmoc或Nsc保護)。
其中以Boc保護非靶位點胺基的肽可通過以ivDde保護靶位點胺基并以Boc保護非靶位點胺基的方法制備。在引入靶位點賴氨酸的步驟中，使用其中以Fmoc或Nsc保護Nα-胺基并以ivDde保護支鏈胺基的賴氨酸合成肽，而在引入其它位點賴氨酸的步驟中，使用其中以Fmoc或Nsc保護Nα-胺基并以Boc保護支鏈胺基的賴氨酸用于肽的合成。在合成期間，在Fmoc或Nsc的解封閉條件例如1％DUB-20％哌啶/DMF下，ivDde沒有被除去。對于合成的肽-樹脂(以ivDde保護靶位點支鏈胺基，以Boc保護非靶位點支鏈胺基，以Fmoc或Nsc保護N-端胺基)而言，除去N-端胺基保護基Fmoc(例如，通過1％DBU-20％哌啶的DMF溶液處理)，然后用裂解溶液(例如，TIS∶水∶TFA＝2.5∶2.5∶95)處理以分離樹脂和肽。此時，靶位點的支鏈胺基保護基Boc被除去。該肽(以ivDde保護靶位點支鏈胺基，非靶位點支鏈胺基及N-端胺基暴露)暴露的胺基用Boc保護，并除去靶位點胺基上的ivDde，從而得到其中以Boc保護非靶位點胺基的肽。此時，可例如通過與Boc2O(二叔丁基碳酸氫酯)反應(yīng)實施該保護，并可例如通過以2％肼溶液處理實施所述解封閉。
以Boc保護非靶位點胺基的肽可通過以Mtt保護靶位點胺基并以Boc保護非靶位點胺基的方法來制備。在該方法中，可使用對酸極為敏感的樹脂如2-CLTR(2-氯三苯甲基樹脂)，且由于潮濕會降低收率和純度因此必需留意。在該方法中，在引入靶位點賴氨酸的步驟中，使用以Fmoc或Nsc保護Nα-胺基并以Mtt保護支鏈胺基的賴氨酸用于肽的合成，而在引入其它位點賴氨酸的步驟中，使用以Fmoc或Nsc保護Nα-胺基并以Boc保護支鏈胺基的賴氨酸用于肽的合成。在合成期間，在用于除去Fmoc或Nsc的堿性條件下，Mtt沒有被除去。這樣在合成的肽-樹脂(以Mtt保護靶位點支鏈胺基，以Boc保護非靶位點支鏈胺基，以Fmoc或Nsc保護N-端胺基)中，除去N-端胺基保護基Fmoc或Nsc，并用Boc保護N-端暴露的Nα-胺基。例如，所述解封閉可通過以1％DBU-20％哌啶在DMF中的溶液處理而實施，且所述保護可通過與Boc2O反應(yīng)進行。將這樣合成的肽-樹脂(以Mtt保護靶位點支鏈胺基，以Boc保護非靶位點胺基且C-端結(jié)合至樹脂)用TFA/MC處理以分離樹脂和肽，除去靶位點胺基保護基Mtt，從而獲得以Boc保護非靶位點胺基的肽。所獲得的被保護的肽處于如下狀態(tài)中，其中非靶位點胺基以Boc保護，除胺基以外的活性基團即羥基或羧基受到保護，且這些保護基將在聚乙二醇化后通過裂解溶液(例如，TIS∶水∶TFA＝2.5∶2.5∶95)除去Boc期間的某時刻被除去。
除所述方法外，本發(fā)明可衍生出多種方法，而這些方法也包含于本發(fā)明中。
此外，根據(jù)本發(fā)明合成的肽可直接用于聚乙二醇化，或者若有必要，在經(jīng)過附加的用最終胺基保護基保護非靶位點胺基包括的Nα-胺基的步驟后，應(yīng)用于聚乙二醇化中。此時，最終胺基保護基可以是至少一種選自以下組中的保護基Fmoc、Nsc、Dde[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環(huán)己基)乙基]、ivDde或其它在堿性條件下可除去的保護基，或至少一種選自以下組中的保護基Boc或其它在酸性條件下可除去的保護基。
本發(fā)明還包括通過將肽分成兩個或更多個片段分別合成以提高肽合成效率，并將這些片段縮合以產(chǎn)生其中非靶位點胺基得以保護的肽的方法。甚至在這種情況下，胺基的保護一解封閉都與前述相同，然而，由于在片段的縮合期間可能發(fā)生外消旋作用，因而該方法可有效地用于氨基酸序列中包含縮合時不會外消旋化的Gly或Pro的肽，并可更有效地用于難以合成或純化的肽。在該方法中，例如，肽的合成是通過將肽分成兩個片段來實施，即一條從N-端到Gly或Pro的片段，以及另一條從隨后的氨基酸到C-端的片段，且這兩條片段經(jīng)縮合形成肽。用于合成具有N-端區(qū)域的片段的樹脂應(yīng)該對酸極為敏感，從而可使用TRT系列樹脂，片段合成一經(jīng)完成，就于酸性條件下從樹脂上分離該片段而同時仍保留其它保護基?？墒褂贸Ｒ?guī)樹脂合成含C-端區(qū)域的片段，并在結(jié)合于樹脂時與N-端片段縮合，然后從樹脂上分離，或者用酸敏感型樹脂合成C-端片段，從樹脂上分離下來而保留保護基，然后在溶液相中與N-端片段進行縮合。如果使用酸敏感型樹脂且以Mtt作為支鏈胺基保護基合成片段，然后從樹脂上分離，則該分離可在下列條件下實施以使Mtt不被除去，AcOH∶TFE(2，2，2-三氟乙醇)∶MC(1∶1∶8)或TFE∶MC(2∶8)。如果N-端片段種的非靶位點支鏈胺基是用ivDde保護，在縮合完成后從樹脂上分離具有完整序列的肽之前，可用Fmoc或Nsc取代保護基。另外，如果靶位點胺基出現(xiàn)在N-端片段上，則應(yīng)該在不會除去Boc的條件下實施從樹脂上的分離。通過使用與連續(xù)合成中相同的方法來合成C-端片段。
作為可在本發(fā)明中使用的肽的合成方法，只要與本發(fā)明兼容，就無特殊限制，但優(yōu)選使用固相肽合成法。
作為本發(fā)明可適用的肽，只要是具有至少兩個支鏈胺基的肽就無特殊限制。本發(fā)明將有效用于需要通過將PEG結(jié)合到其特定位點以延長生物半衰期或降低免疫原性或抗原性的肽類。可列舉降鈣素或GRF(1-29)為實例。
具有經(jīng)保護的非靶位點胺基的肽使得能夠完全特異性地將肽聚乙二醇化。將以Fmoc、Nsc、Boc或其它在聚乙二醇化條件下穩(wěn)定的胺基保護基保護非靶位點胺基的肽與經(jīng)活化的PEG反應(yīng)導致PEG僅特異性地結(jié)合于靶位點處的胺基，且該反應(yīng)幾乎可以根據(jù)其當量比和反應(yīng)條件完成。對這種經(jīng)保護的肽-PEG結(jié)合物(將PEG結(jié)合到靶位點胺基而非靶位點胺基被保護基保護)實施解封閉{例如，5％哌啶/DMF條件用于Fmoc或Nsc保護基，裂解溶液(TIS∶水∶TFA＝2.5∶2.5∶95)用于Boc保護基}導致生成其中PEG特異性地結(jié)合于靶位點胺基的肽。
因此，本發(fā)明的另一個具體實施方案為制備其中PEG特異性地結(jié)合到靶位點胺基上的特異性PEG結(jié)合肽的方法，其包括(1)使其中非靶位點胺基被選擇性地保護的肽與PEG反應(yīng)，以及(2)在酸-堿解封閉條件下除去如此得到的化合物的胺基保護基。
經(jīng)證實，所述反應(yīng)混合物不含其它肽衍生物，且經(jīng)離子交換色譜除去未結(jié)合的PEG及被釋放的保護基，并經(jīng)反相樹脂(例如，Sep-Pak柱)脫鹽并經(jīng)冷凍干燥可以獲得高純度、特異性結(jié)合的PEG肽。
能與根據(jù)本發(fā)明制備的非靶位點胺基被選擇性保護的肽相結(jié)合的經(jīng)活化的PEG無特殊的限制，并包括上述所有的PEG，但優(yōu)選為線性或支化的羥基或甲氧基型烷基化或酰化的分子量為1,000-40,000的PEG，更優(yōu)選地，可使用至少一種選自以下組中的物質(zhì)單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺氨基甲酸酯以及單甲氧基聚乙二醇tresylate。
本發(fā)明的特異性地結(jié)合的PEG-肽可配制成包含治療有效量的肽的藥物劑型?？墒褂萌缱⑸鋭⑤斠?、儲庫型注射劑、吸入劑等劑型，并且可以添加緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、增稠劑、防腐劑、著色劑和矯味劑。


圖1為實施例20(B)中Lys18-PEG 2K-鮭魚降鈣素和比較例1(A)中單PEG 2K-鮭魚降鈣素的反相色譜圖。
圖2為鮭魚降鈣素(A)和實施例20(B)中Lys18-PEG 2K-鮭魚降鈣素的Lys-C酶處理片段的MALDI-TOF質(zhì)譜圖。
圖3為鮭魚降鈣素(A)和實施例20(B)中Lys18-PEG 2K-鮭魚降鈣素的MALDI-TOF質(zhì)譜圖。
圖4為GRF(1-29)(A)和實施例23(B)中Lys21-PEG 5K-GRF(1-29)的反相色譜圖。
圖5為實施例23中Lys21-PEG 5K-GRF(1-29)的MALDI-TOF質(zhì)譜圖。
圖6為GRF(1-29)(A)以及實施例23中Lys21-PEG 5K-GRF(1-29)(B)的Lys-C酶處理片段的MALDI-TOF質(zhì)譜圖。
具體實施方案以下通過實施例舉例說明本發(fā)明的詳細方法。然而，這些實施例并非意圖限制本發(fā)明的范圍。
實施例本發(fā)明實施例中使用的縮略語含義如下。
Ac＝乙?；?、Ac2O＝乙酸酐、AcCN＝乙腈、AcOH＝乙酸、Bop＝苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻、Clt＝2-氯三苯甲基、DCM＝二氯甲烷、DIC＝1，3-二異丙基碳二亞胺、DIPEA＝N，N-二異丙基乙胺、DMSO＝二甲基亞砜、EDT＝1，2-乙二硫醇、EtOAc＝乙酸乙酯、HBTU＝N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲基氨基)亞甲基]-N-甲基甲烷六氟磷酸銨N-氧化物、HOBt＝1-羥基苯并三唑、Pbf＝2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?、Pmc＝2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基、PyBop＝苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷基)六氟磷酸鏻、SPPS＝固相肽合成、TBTU＝N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲氨基)亞甲基]-N-甲基甲烷四氟硼酸銨N-氧化物、tBu＝叔丁基、TEA＝三乙胺，以及Trt＝三苯甲基。
實施例1.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，11-二Fmoc-鮭魚降鈣素的連續(xù)合成結(jié)構(gòu)Fmoc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫鍵)[表1]

根據(jù)以下反應(yīng)順序合成肽。
反應(yīng)順序Nsc-Pro、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Pro、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-His(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Glu(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Nsc-Cys(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Cys(trt)將2.0g結(jié)合-酰胺樹脂投入50ml肽反應(yīng)器中，倒入20ml DCM，放置30min使樹脂充分膨脹。以過濾除去溶液。加入20ml解封閉溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)，反應(yīng)5min(該過程重復2次)以除去Fmoc，再用20ml DMF洗滌5至7次。除去剩余哌啶和二苯并富烯，并用氯醌試驗確證[該試驗可用于測定Nsc或Fmoc相關(guān)的加合物及殘留哌啶是否被完全除去。通過將一滴飽和氯醌的甲苯溶液滴加到大約1ml丙酮中制得該試液?？赏ㄟ^將一滴洗滌液滴加到氯醌試液中檢測DMF洗滌。藍色或紫色是仲胺存在的陽性標志]。
為引入降血鈣素的C-端氨基酸，將Pro、Nsc-Pro-OH(1.5當量)、Bop(1.5當量)、HOBt(1.5當量)以及DIPEA(1.5當量)溶于4ml DMF和8ml DCM中，然后投入含有樹脂的所述反應(yīng)器中。將該反應(yīng)液再用8ml DCM洗滌、加入至反應(yīng)器中、另外加入DIPEA(1.5當量)、用適當?shù)臄嚢杵鲾嚢璨⒃?5℃-40℃下反應(yīng)1h。通過Kaiser試驗確定反應(yīng)終點[取2-10mg樹脂樣品并用乙醇洗滌，用定性的茚三酮試驗檢查反應(yīng)是否完全。向樣品中加入2滴80％苯酚溶液、2滴0.02mM KCN的吡啶溶液和2滴5％的茚三酮乙醇溶液。將樣品置于約120℃的加熱塊中4至6分鐘。藍色或紫色為存在游離胺基的陽性標記]，如果反應(yīng)未完成，則使該反應(yīng)液再反應(yīng)30分鐘至1小時。反應(yīng)完成時，濾除反應(yīng)液、用3×20mlDMF洗滌、與解封閉溶液(2×20ml)反應(yīng)，每次5分鐘，并用DMF徹底洗滌。
氨基酸的連續(xù)引入是按照上述方法進行的，且該反應(yīng)從降血鈣素的C-端Pro32開始，依次進行，當引入被保護的氨基酸后，使用解封閉溶液反復實施Nsc或Fmoc的除去。當引入Nsc-Cys(Trt)后，將該肽與3×20ml 2％的肼溶液反應(yīng)10-30分鐘以除去ivDde和Nsc，然后過濾樹脂，用4×20ml DMF、4×20ml DCM、及4×20ml DMF充分洗滌。將溶于20mlDMF中的Fmoc-Osu(5.0當量)投入反應(yīng)器中，徹底混合1至2h使Fmoc被分別引入至1位與11位的胺基上。通過Kaiser試驗檢測反應(yīng)進程，當確定反應(yīng)完成時，濾除去反應(yīng)液，用4×20ml DMF和4×20ml DCM充分洗滌，氮氣流下干燥得8.5g結(jié)合肽的樹脂。
1，7二硫鍵可通過I2氧化生成。將如上述得到的肽樹脂投入至150ml可過濾的肽反應(yīng)器中，倒入50ml DMF并保持平衡30分鐘。再將0.1 MI2在50ml DMF中的溶液加入至反應(yīng)器中，充分混合2小時以實施氧化。反應(yīng)進行用HPLC監(jiān)控，反應(yīng)完成時，過濾并用5×50ml DMF和5×50ml抗壞血酸洗滌，每次5分鐘，以完全除去殘留的I2。此外，用3×20ml DMF、3×20ml DCM、3×20ml MeOH以及3×20ml庚烷洗滌該肽樹脂，氮氣下干燥，真空干燥6小時得8.1g干燥的結(jié)合肽的樹脂。
將所述干燥的樹脂與80ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常溫下反應(yīng)1.5小時，除去樹脂并將所得肽用約10ml TFA洗滌。收集洗液和濾液并加入至500ml乙醚中，經(jīng)離心沉淀所形成的漂浮物，此外還通過離心用3×200ml乙醚洗滌。沉淀物在氮氣下干燥得4.8g干燥的肽混合物，該混合物經(jīng)制備HPLC純化，經(jīng)冷凍干燥得896mg 1，11-二Fmoc-鮭魚降鈣素。該實施例中制備的肽的靶位點是Lys18的胺基。
Vydac protein&peptide-C18，20×250mm，5μ，300ATFA緩沖的AcCN及水梯度[肽的分析條件1]
儀器Waters Alliance流速1.0ml/min梯度0-45min，B 0-100％(A0.1％TFA的水溶液，B0.1％TFA的AcCN溶液)色譜柱Nova-Pak-C18，3.9mm×150mm，5μ，100A[質(zhì)譜分析條件]儀器Voyager DE-STR Maldi Tof Mass(透視(perspective))操作模式反射式提取模式(Extraction mode)延時的極性正極基質(zhì)α-氰基-4-羥基苯乙烯酸Maldi Tof；3877.43，(M+1＝3877.44)HPLC；98％以上(肽分析條件1)實施例2.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，18-二Fmoc-鮭魚降鈣素的連續(xù)合成結(jié)構(gòu)Fmoc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Fmoc)-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫鍵)[表2]


反應(yīng)順序Nsc-Pro、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Pro、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-His(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Glu(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Nsc-Cys(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Cys(trt)如實施例1所述，按照上述表格以及氨基酸的反應(yīng)順序?qū)嵤┓磻?yīng)。在實施除去ivDde和引入二Fmoc以及碘氧化時，結(jié)合肽的樹脂為8.2g，并用實施例1中所述的TFA-裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)處理及用制備HPLC純化得892mg 1，18-二Fmoc-鮭魚降鈣素。
Maldi Tof；3877.33，(M+1＝3877.44)HPLC；97％以上(肽分析條件1)
實施例3.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的11，18-二Fmoc-鮭魚降鈣素的連續(xù)合成結(jié)構(gòu)H-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Fmoc)-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫鍵)[表3]

反應(yīng)順序Nsc-Pro、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Pro、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-His(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Glu(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Nsc-Cys(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Boc-Cys(trt)。
如實施例1所述，按照上表以及氨基酸的反應(yīng)順序?qū)嵤┓磻?yīng)。在實施ivDde的除去和二Fmoc的引入以及碘氧化時，結(jié)合肽的樹脂為8.2g，并用實施例1中所述的TFA-裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)處理及用制備HPLC純化得890mg 11，18-二Fmoc-鮭魚降鈣素。
Maldi Tof；3877.23，(M+1＝3877.44)HPLC；98％以上(肽分析條件1)實施例4.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，12-二Fmoc-GRF(1-29)的連續(xù)合成結(jié)構(gòu)Fmoc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Fmoc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2[表4]


反應(yīng)順序Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Nsc-Tyr(tBu)將2.0g結(jié)合-酰胺樹脂投入50ml肽反應(yīng)器中，倒入20ml DCM，放置30分鐘使樹脂充分膨脹。經(jīng)過濾除去溶液。加入20ml解封閉溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)，反應(yīng)5分鐘以除去Fmoc(該過程重復2次)，再用20ml DMF洗滌5-7次。除去剩余的哌啶和二苯并富烯，并通過氯醌試驗確證。
將Arg、Nsc-Arg(Pbf)-OH(1.5當量)、Bop(1.5當量)、HOBt(1.5當量)以及DIPEA(1.5當量)溶于2ml DMF和8ml DCM中并投入至包含樹脂的反應(yīng)器中，以引入GRF(1-29)的C-端氨基酸。將該反應(yīng)液再用8ml DCM洗滌并倒入反應(yīng)器中，再加入DIPEA(1.5當量)，用適當?shù)臄嚢杵鲾嚢璨⒂?5℃-40℃下反應(yīng)1小時。通過Kaiser試驗確定反應(yīng)終點，如果反應(yīng)未完成，使反應(yīng)液再反應(yīng)30分鐘至1小時。反應(yīng)完成時，經(jīng)過濾除去反應(yīng)液，用3×20ml DMF洗滌，與解封閉溶液(2×20ml)反應(yīng)，每次5分鐘，并用DMF徹底洗滌。
以如上所述的方法進行氨基酸的連續(xù)引入，反應(yīng)從GRF(1-29)的C-端Arg開始并依次進行，當引入被保護的氨基酸后，反復使用解封閉溶液除去Nsc或Fmoc。當引入Nsc-Tyr(tBU)后，與3×20ml 2％的肼溶液反應(yīng)，每次10-30分鐘以除去ivDde和Nsc，然后過濾樹脂，并用4×20mlDMF、4×20ml DCM和4×20ml DMF充分洗滌。將溶于20ml DMF的Fmoc-Osu(5.0當量)投入反應(yīng)器中，徹底混合1至2小時使Fmoc被分別引入至1位與12位的胺基上。通過Kaiser試驗檢查反應(yīng)進程，當確定反應(yīng)完全時，經(jīng)過濾除去反應(yīng)液，用4×20ml DMF和4×20ml DCM充分洗滌，氮氣流下干燥得8.5g結(jié)合肽的樹脂。
取出所述干燥樹脂1g并與10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常溫下反應(yīng)1.5小時，再與TMS-Br和EDT反應(yīng)15分鐘。經(jīng)過濾除去樹脂，并用2ml TFA洗滌該樹脂。收集洗液和濾液并加入至100ml乙醚中，經(jīng)離心以沉淀所形成的漂浮物，此外還通過離心用3×50ml乙醚洗滌。沉淀物在氮氣下干燥得690mg干燥的肽混合物，該混合物經(jīng)制備HPLC純化、冷凍干燥得116mg 1，12-二Fmoc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3803.39，(M+1＝3803.46)HPLC；96％以上(肽分析條件1)實施例5.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，21-二Fmoc-GRF(1-29)的連續(xù)合成結(jié)構(gòu)Fmoc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys(Fmoc)-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2[表5]


反應(yīng)順序Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Ath(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Nsc-Tyr(tBu)如實施例4所述，用上表給出的試劑和溶劑實施反應(yīng)。按照如實施例4所述的方法，可在以2％肼的DMF溶液除去ivDde后通過使用Fmoc-Osu(3.37g在20ml DMF中的溶液)實施二Fmoc的引入，且在反應(yīng)后，得7.9g干燥樹脂。取出1g如此得到的肽樹脂與10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)混合并反應(yīng)1.5h，加入另外的EDT(0.130ml)以及TMS-Br(0.157ml)至反應(yīng)液中并再攪拌15分鐘。反應(yīng)液經(jīng)如實施例4中所述的乙醚處理得710mg肽混合物，通過制備HPLC純化，得86mg 1，21-二Fmoc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3803.59，(M+1＝3803.46)HPLC；98％以上(肽分析條件1)
實施例6.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的12，21-二Fmoc-GRF(1-29)的連續(xù)合成結(jié)構(gòu)H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Fmoc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys(Fmoc)-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2[表6]

反應(yīng)順序Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Boc-Tyr(tBu)如實施例4所述，用上表給出的試劑和溶劑實施反應(yīng)。按照如實施例4所述的方法，可在以2％肼的DMF溶液除去ivDde后通過使用Fmoc-Osu(3.37g在20ml DMF中的溶液)實施二Fmoc的引入，且在反應(yīng)后，得到8.4g干燥樹脂。取出1g如此得到的肽樹脂與10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)混合并反應(yīng)1.5h，并加入另外的EDT(0.130ml)以及TMS-Br(0.157ml)至反應(yīng)液中并再次攪拌15分鐘。反應(yīng)液經(jīng)如實施例4所述的乙醚處理得710mg肽混合物，通過制備HPLC純化得86mg 12，21-二Fmoc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3803.59，(M+1＝3803.46)HPLC；96％以上(肽分析條件1)實施例7.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，12-二Nsc-GRF(1-29)的連續(xù)合成結(jié)構(gòu)Nsc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Nsc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2[表7]


反應(yīng)順序Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Nsc-Tyr(tBu)如實施例4所述，用上表給出的試劑和溶劑進行合成。按照如實施例4所述的方法，可在以2％肼的DMF溶液除去ivDde后通過使用Nsc-Osu(3.72g在20ml DMF中的溶液)實施二Nsc的引入，且在反應(yīng)后，得到8.1g干燥樹脂。取出1g如此得到的肽樹脂與10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)混合并反應(yīng)1.5h，將另外的EDT(0.130ml)以及TMS-Br(0.157ml)加入至反應(yīng)液中并再次攪拌15分鐘。反應(yīng)液經(jīng)如實施例4中所述的乙醚處理得700mg肽混合物，通過制備HPLC純化得136mg 1，12-二Nsc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3874.46，(M+1＝3874.39)HPLC；98％以上(肽分析條件1)實施例8.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，12-二(ivDde)-GRF(1-29)的連續(xù)合成結(jié)構(gòu)ivDde-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(ivDde)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2[表8]

反應(yīng)順序Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Nsc-Tyr(tBu)如實施例4所述，用上表給出的試劑和溶劑進行合成。在與Nsc-Tyr(tBu)反應(yīng)并除去Nsc后，通過與2-異戊酰基雙甲酮(1.0g在20ml DMF中的溶液)反應(yīng)12小時實現(xiàn)將ivDde引入N-端，反應(yīng)結(jié)果得8.1g干燥樹脂。取出1g肽樹脂與10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)混合并反應(yīng)1.5h，將另外的EDT(0.130ml)和TMS-Br(0.157ml)加入至反應(yīng)液中并再次攪拌15分鐘。該反應(yīng)液經(jīng)如實施例4中所述的乙醚處理得680 mg肽混合物，通過制備HPLC純化得97mg 1，12-二ivDde-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3771.39，(M+1＝3771.55)HPLC；94％以上(肽分析條件1)實施例9.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，12-二Boc-GRF(1-29)的連續(xù)合成實施例9-1.21-Nsc-GRF(1-29)的合成結(jié)構(gòu)H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys(Nsc)-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2[表9]


反應(yīng)順序Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Boc-Tyr(tBu)如實施例4所述，用上表給出的試劑和溶劑進行合成。按照如實施例4所述的方法，可在以2％肼的DMF溶液除去ivDde后通過使用Nsc-Osu(3.72g在20ml DMF中的溶液)完成Nsc的引入，反應(yīng)后，得7.5g干燥樹脂。將如此得到的肽樹脂與80ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)混合并反應(yīng)1.5h，將另外的EDT(1.26ml)以及TMS-Br(1.04ml)加入至反應(yīng)液中并再次攪拌15分鐘。反應(yīng)液經(jīng)如實施例4中所述的乙醚處理得4.1g肽混合物，通過制備HPLC純化得520mg 21-Nsc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3616.39，(M+1＝3616.17)HPLC；98％以上(肽分析條件1)實施例9-2.1，12-二Boc-GRF(1-29)的合成結(jié)構(gòu)Boc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Boc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2

將360mg合成的21-Nsc-GRF(1-29)與5ml DMF投入具有磁力攪拌器的25ml單頸反應(yīng)器中并溶解。通過使用氮氣使該反應(yīng)物被置于隔絕空氣的環(huán)境中，以冰浴使溫度降至0-5℃，0-5℃下向反應(yīng)液中逐滴加入Boc2O(1g/5ml DMF)，維持該溫度約10分鐘，移除冰浴使溫度緩慢升至常溫。維持攪拌3-4小時，每小時收集樣品用HPLC(肽分析條件1)監(jiān)控反應(yīng)進程。反應(yīng)完成時，邊攪拌邊向反應(yīng)液中逐滴加入10ml 5％Na2CO3以免產(chǎn)生沉淀。反應(yīng)進行大約30分鐘并用HPLC檢測Nsc的去除進程。將反應(yīng)液濃縮至1/4體積，用150ml己烷洗滌得到粘性油狀物。向該油狀物中倒入20ml MTBE并放置12小時以形成沉淀，該沉淀經(jīng)離心分離。再用2×20ml MTBE洗滌并在氮氣下干燥得330mg 1，12-二Boc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3559.21，(M+1＝3559.20)HPLC；92％以上(肽分析條件1)實施例10.使用Dde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，12-二(Dde)-GRF(1-29)的連續(xù)合成結(jié)構(gòu)Dde-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Dde)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2

反應(yīng)順序Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(Dde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Nsc-Tyr(tBu)如實施例4所述，用上表給出的試劑和溶劑進行合成。在與Nsc-Tyr(tBu)反應(yīng)并除去Nsc后，可通過與2-乙酰基雙甲酮(1.0g在20ml DMF中的溶液)反應(yīng)6小時以將Dde引入至N-端，反映后得8.8g干燥樹脂。取出1g該肽樹脂并與10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)反應(yīng)1.5h，將另外的EDT(0.130ml)和TMS-Br(0.157ml)加入至反應(yīng)液中并再攪拌15分鐘。該反應(yīng)液經(jīng)如實施例4中所述的乙醚處理得590mg肽混合物，通過制備HPLC純化得104mg 1，12-二Dde-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3687.69，(M+1＝3687.55)HPLC；95％以上(肽分析條件1)實施例11.使用Mtt作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，11-二Fmoc-鮭魚降鈣素的連續(xù)合成結(jié)構(gòu)Fmoc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫鍵)[表12]


反應(yīng)順序Nsc-Pro、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Pro、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-His(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Glu(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(Mtt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Nsc-Cys(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Fmoc-Cys(trt)將2.0g結(jié)合-酰胺樹脂投入50ml肽反應(yīng)器中，倒入20ml DCM，放置30分鐘使樹脂充分膨脹，經(jīng)過濾除去溶液。通過與2×20ml解封閉溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)反應(yīng)，每次5分鐘以除去Fmoc，并用20ml DMF洗滌5-7次。除去剩余哌啶和二苯并富烯，并通過氯醌試驗確證。
將Pro、Nsc-Pro-OH(1.5當量)、Bop(1.5當量)、HOBt(1.5當量)和DIPEA(1.5當量)溶于4ml DMF和8ml DCM中并投入至包含樹脂的反應(yīng)器中以引入降血鈣素的C-端氨基酸。將該反應(yīng)液再用8ml DCM洗滌并加入至反應(yīng)器中，加入另外的DIPEA(1.5當量)，用適當?shù)臄嚢杵鲾嚢璨⒂?5℃-40℃反應(yīng)約1小時。通過Kaiser試驗確定反應(yīng)終點，如果反應(yīng)未完成，使反應(yīng)液再反應(yīng)30分鐘至1小時。反應(yīng)完成時，經(jīng)過濾除去反應(yīng)液，用3×20ml DMF洗滌，與解封閉溶液(2×20ml)反應(yīng)，每次5分鐘并用DMF徹底洗滌。
氨基酸的連續(xù)引入如上述方法進行，且反應(yīng)從降鈣素C-端Pro32開始并依次進行，按順序重復偶聯(lián)反應(yīng)與解封閉。上述重復的反應(yīng)，偶聯(lián)反應(yīng)與解封閉可通過自動化儀器進行。最后，在將Fmoc-Cys(Trt)引入至N-端后，用DCM洗滌樹脂。將該樹脂與3×20ml 1％TFA溶液反應(yīng)，每次10-30分鐘，以除去11位的Mtt。通過基于反應(yīng)液相對于空白對照對UV和TFA煙霧的反應(yīng)活性的TLC分析可確證Mtt的除去。反應(yīng)完成時，將樹脂過濾并用4×20ml DMF、4×20ml DCM以及4×20ml DMF充分洗滌。將溶于20ml DMF中的Fmoc-OSu(5.0當量)投入反應(yīng)器中，徹底混合1-2小時以使Fmoc被引入至11位的Lys。通過Kaiser試驗檢測反應(yīng)進程，當確定反應(yīng)完成時，過濾除去反應(yīng)液，用4×20ml DMF和4×20mlDCM充分洗滌，并在氮氣流下干燥得8.5g結(jié)合肽的樹脂。
1，7二硫鍵可通過I2氧化生成。將如上述得到的肽樹脂投入至150ml可過濾的肽反應(yīng)器中，倒入50ml DMF并保持平衡30分鐘。將另外的0.1M I2在50ml DMF中的溶液加入至反應(yīng)器中，充分混合2小時以進行氧化。反應(yīng)進程用HPLC監(jiān)控，反應(yīng)完成時，過濾并用5×50ml DMF和5×50ml抗壞血酸洗滌，每次5分鐘，以完全除去殘留的I2。此外，將所得產(chǎn)物用3×20ml DMF、3×20ml DCM、3×20ml MeOH以及3×20ml庚烷洗滌，在氮氣下干燥，真空干燥6小時得8.1g干燥的結(jié)合肽的樹脂。
將該干燥樹脂與80ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常溫下反應(yīng)1.5小時，除去樹脂并用約10ml TFA洗滌。收集洗液和濾液并加入至500ml乙醚中，離心使形成的沉淀物得以沉淀，再次離心并用3×200ml乙醚洗滌。將沉淀物在氮氣下干燥得4.8g干燥的肽混合物，該混合物經(jīng)制備HPLC純化、冷凍干燥得896mg 1，11-二Fmoc-鮭魚降鈣素。
Maldi Tof；3877.43，(M+1＝3877.44)HPLC；98％以上(肽分析條件1)實施例12.使用Mtt作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，12-二Fmoc-GRF(1-29)的連續(xù)合成結(jié)構(gòu)Fmoc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Fmoc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2[表13]

反應(yīng)順序Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Gly、Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(Mtt)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Fmoc-Tyr(tBu)
將2.0g結(jié)合-酰胺樹脂投入50ml肽反應(yīng)器中，倒入20ml DCM，放置30分鐘使樹脂充分膨脹。經(jīng)過濾除去溶液。通過與2×20ml解封閉溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)反應(yīng)以除去Fmoc，每次5分鐘，并用20ml DMF洗滌5-7次。剩余哌啶和二苯并富烯的除去通過氯醌試驗確證。
將Arg、Nsc-Arg(Pbf)-OH(1.5當量)、Bop(1.5當量)、HOBt(1.5當量)以及DIPEA(1.5當量)溶于4ml DMF和8ml DCM中，并投入至包含樹脂的反應(yīng)器中，以引入GRF(1-29)的C-端氨基酸。將該反應(yīng)液再用8ml DCM洗滌并加入反應(yīng)器中，加入另外的DIPEA(1.5當量)，用適當?shù)臄嚢杵鲝氐讛嚢璨⒂?5℃-40℃下反應(yīng)1小時。通過Kaiser試驗確定反應(yīng)終點，如果反應(yīng)未完成，使反應(yīng)液再反應(yīng)30分鐘至1小時。反應(yīng)完成時，經(jīng)過濾除去反應(yīng)液，用3×20ml DMF洗滌，與解封閉溶液(2×20ml)反應(yīng)每次5分鐘，并用DMF徹底洗滌。
氨基酸的連續(xù)引入如上述方法進行，反應(yīng)從GRF(1-29)C-端Arg開始并依次進行，且按順序重復偶聯(lián)反應(yīng)與解封閉。上述重復的反應(yīng)，偶聯(lián)反應(yīng)與解封閉可使用自動化儀器實施。在Fmoc-Tyr(tBU)被引入至N-端后，用DCM洗滌該樹脂并于20ml DCM中浸泡15分鐘。除去DCM后，將樹脂與3×20ml 1％TFA溶液每次反應(yīng)10-30分鐘以除去12位的Mtt。通過基于反應(yīng)液相對于空白對照的UV和TFA煙霧反應(yīng)活性的TLC分析確證Mtt的除去。反應(yīng)完成時，將樹脂過濾，并用4×20ml DMF、4×20ml DCM和4×20ml DMF充分洗滌。將溶于20ml DMF的Fmoc-OSu(5.0當量)投入反應(yīng)器中，徹底混合1-2小時使Fmoc被引入至12位的Lys。通過Kaiser試驗檢查反應(yīng)進程，當確定反應(yīng)完成時，經(jīng)過濾除去反應(yīng)液，用4×20ml DMF和4×20ml DCM充分洗滌，在氮氣流下干燥得到8.5g結(jié)合肽的樹脂。
取出1g干燥的樹脂并與10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常溫下反應(yīng)1.5小時，再與TMS-Br和EDT反應(yīng)15分鐘。經(jīng)過濾除去樹脂，并用2ml TFA洗滌樹脂。收集洗液和濾液并加入至100ml乙醚中，經(jīng)離心沉淀所形成的漂浮物，再次離心并用3×50ml乙醚洗滌。將沉淀物在氮氣下干燥得690mg干燥的肽混合物，該混合物經(jīng)制備HPLC純化、冷凍干燥得116mg 1，12-二Fmoc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3803.39，(M+1＝3803.46)HPLC；96％以上(肽分析條件1)實施例13.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，11-二Fmoc-鮭魚降鈣素的片段縮合合成實施例13-1.Nsc-Gly-2-ClTrt-樹脂的合成[表14]

將10g 2-CLTR樹脂投入至250ml肽反應(yīng)器中，倒入100ml DCM，使樹脂充分膨脹30分鐘，然后經(jīng)過濾除去溶液。將Nsc-Gly-OH(3.32g)與DIPEA(5.22ml)溶于100ml DCM中，將該溶液投入至包含樹脂的反應(yīng)器中，在常溫下混合約1小時以使反應(yīng)進行。經(jīng)過濾除去反應(yīng)液，用100ml DCM洗滌，與80ml DCM∶MeOH∶DIPEA(17∶2∶1)反應(yīng)20分鐘從而通過以MeOH取代除去樹脂的活性基團。在用4×100ml DCM洗滌后，在氮氣下干燥得13.1g Nsc-Gly-CLTR{UV-光譜分析(儀器BioRad Smart Spec 3000，Nsc的消光系數(shù)300nm處2000cm-1M-1；容量0.61mmol/g)}。
實施例13-2.Nsc-AAsCt(1-10)-OH的合成結(jié)構(gòu)Nsc-Cys1-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys7-Val-Leu-Gly10-OH(1，7-二硫鍵)[表15]

將8.2g上述合成的Nsc-Gly-2-CLTR(容量0.61mmol/g)投入至200ml肽反應(yīng)器中，倒入50ml DCM并放置30分鐘使反應(yīng)混合物達到平衡。經(jīng)過濾除去DCM，并與2×50ml解封閉溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)每次反應(yīng)5分鐘，再用5×50ml DMF徹底洗滌。根據(jù)肽的序列，用上表中所列試劑從C-端開始如實施例1所述重復進行偶聯(lián)與解封閉。反應(yīng)順序為Leu、Val、Cys(Trt)、Thr(tBu)、Ser(tBu)、Leu、Asn(Trt)、Ser(tBu)和Cys(Trt)，并且在Nsc-Cys(Trt)-OH縮合后，不除去Nsc以用于后續(xù)反應(yīng)。
1，7二硫鍵可通過I2氧化生成。將上述所得的肽樹脂投入至800ml可過濾的肽反應(yīng)器中，倒入250ml DCM，并保持平衡30分鐘。將另外的0.1M I2在250ml DCM中的溶液加入至反應(yīng)器中，充分混合2小時以進行氧化，反應(yīng)進程用HPLC監(jiān)控(肽分析條件2)，反應(yīng)完成時過濾并用5×100ml DMF洗滌，每次10min，以完全除去殘留的I2。此外，將該反應(yīng)產(chǎn)物用3×100ml DMF、3×100ml DCM、3×100ml MeOH以及3×100ml庚烷洗滌，在氮氣下干燥，真空干燥6小時得16.9g干燥的結(jié)合肽的樹脂。
在溫和的酸性條件下釋放該肽并保留保護基，用150ml 1％TFA在DCM中的溶液處理該肽2分鐘并過濾，并將所得溶液用100ml 0.5％TFA的DCM溶液處理1分鐘，立即用與TFA消耗量等量的吡啶中和該溶液。溶液經(jīng)真空濃縮至1/4體積，以50ml乙醇處理，并經(jīng)再次濃縮至終體積約為50ml。向該溶液中加入水(100ml)生成沉淀，并通過離心分離沉淀，用2×50ml水洗滌沉淀。該沉淀經(jīng)真空充分干燥得6.8gNsc-AAsCt(1-10)-OH(HPLC純度93％)。
儀器Waters Alliance流速1.0ml/min梯度0-50min，B 40-100％(A0.1％TFA水溶液，B0.1％TFA的AcCN溶液)色譜柱Nova-Pak-C18，3.9mm×150mm，5μ，100AMaldi Tof；1663.23，(M+1＝1662.09)HPLC；93％以上(肽分析條件2)實施例13-3.11-Nα-Fmoc-11-ivDde-18-Boc-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂的合成結(jié)構(gòu)Fmoc-Lys(ivDde)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-結(jié)合酰胺樹脂[表16]

將2.0g結(jié)合酰胺樹脂投入肽反應(yīng)器中，倒入20ml DCM并放置30分鐘使反應(yīng)達到平衡。通過與2×20ml解封閉溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)每次反應(yīng)5min脫去連接在樹脂上的Fmoc，并用5×20ml DMF徹底洗滌樹脂。根據(jù)肽的序列，用上表中所列試劑從C-端開始如實施例1所述重復實施縮合與解封閉。反應(yīng)順序為Pro、Thr(tBu)、Gly、Ser(tBu)、Gly、Thr(tBu)、Asn(Trt)、Thr(tBu)、Arg(Pbf)、Pro、Tyr(tBu)、Thr(tBu)、Gln(Trt)、Leu、Lys(Boc)、His(Trt)、Leu、Glu(tBu)、Gln(Trt)、Ser(tBu)、Leu和Lys(ivDde)。在實施Fmoc-Lys(ivDde)-OH的縮合而保留Fmoc后，用4×20ml DMF和4×20ml DCM洗滌樹脂，在氮氣下干燥得6.5g結(jié)合肽的樹脂(UV光譜分析；容量0.14mmol/g)。
實施例13-4.基于Nsc-AAsCt(1-10)-OH與Fmoc-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂的縮合合成1，11-二Fmoc-鮭魚降鈣素結(jié)構(gòu)Fmoc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫鍵)

將如上所述制備的Fmoc-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂(3.85g)投入肽反應(yīng)器中，使之于30ml DCM中充分膨脹。除去反應(yīng)器中的溶液，用2×20ml解封閉溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)每次處理5分鐘以除去Fmoc，并用20ml DMF充分洗滌7-9次同時用氯醌試驗檢測殘留物的除去。
將上述制備的片段Nsc-AAsCt(1-10)-OH(1.25g)溶于4ml DMF中，投入HOBt(0.108g)與DIPEA(0.160ml)，使用冰浴將反應(yīng)液的溫度降至0-5℃。在氮氣下，向反應(yīng)液中投入Bop(0.332g)，充分混合10分鐘，同時維持溫度于0-5℃。將該反應(yīng)液倒入含有樹脂的肽反應(yīng)器中，震蕩混合10分鐘，并加入DIPEA(0.100ml)。反應(yīng)在常溫下進行約12小時并基于Kaiser試驗以及分析型HPLC(肽分析條件1)確定反應(yīng)進程。反應(yīng)完成時，用3×20ml DMF洗滌樹脂，用2％肼3×20ml處理10-30分鐘以除去對堿不穩(wěn)定的Nsc和ivDde。用TLC分析確證ivDde的除去，其中該經(jīng)處理溶液和2％肼溶液分別點于TLC板上并比較它們的UV吸收度。脫除完成時將樹脂過濾并用4×20ml DMF、4×20ml DCM、3×20mlDMF洗滌，并加入Fmoc-Osu(3.37g在20ml DMF中的溶液)反應(yīng)2小時以引入二Fmoc。通過定性Kaiser試驗檢測Fmoc的引入，并將該樹脂用4×20ml DMF及4×20ml DCM洗滌，在氮氣下干燥得4.3g結(jié)合肽的樹脂。
將通過使如上所述得到的樹脂與40ml TFA裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常溫下反應(yīng)約2小時所得的反應(yīng)液過濾，然后加入至300ml冷的乙醚中以生成肽沉淀。該沉淀經(jīng)離心分離，再用2×100ml乙醚洗滌并干燥得2.6g肽混合物。該肽混合物經(jīng)制備HPLC純化、濃縮、并用冷凍干燥器干燥得1036mg 1，11-二Fmoc-鮭魚降鈣素。
Maldi Tof； 3877.41，(M+1＝3877.44)HPLC；98％以上(肽分析條件1)實施例14.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，11-二Nsc-鮭魚降鈣素的片段縮合合成結(jié)構(gòu)Nsc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Nsc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫鍵)

根據(jù)實施例13的方法，通過使用實施例13中制備的Fmoc-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂(3.57g)和Nsc-AAsCt(1-10)-OH以及上表中所列的溶劑和試劑實施片段的縮合，而通過與Nsc-OSu(3.72g在20ml DMF中的溶液)反應(yīng)引入二Nsc得到4.8g結(jié)合肽的樹脂。將由所述結(jié)合肽的樹脂與TFA裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)所得的肽混合物分離并純化得到1228mg 1，11-二Nsc-鮭魚降鈣素。
Maldi Tof；3947.40，(M+1＝3947.38)HPLC；98％以上(肽分析條件1)
實施例15.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，18-二Fmoc-鮭魚降鈣素的片段縮合合成實施例15-1.11-Nα-Nsc-11-Boc-18-ivDde-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂的合成結(jié)構(gòu)Nsc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(ivDde)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-結(jié)合酰胺樹脂[表19]

反應(yīng)順序Nsc-Pro、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Pro、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-His(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Glu(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)按照與實施例13中合成Fmoc-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂相同的方法進行合成，結(jié)果得到6.8g充分干燥的樹脂，且通過UV光譜分析確定樹脂的肽容量為0.13mmol/g(UV-光譜分析；容量0.13mmol/g)。
實施例15-2.基于Nsc-AAsCt(1-10)-OH與Nsc-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂的縮合合成1，18-二Fmoc-鮭魚降鈣素結(jié)構(gòu)Fmoc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Fmoc)-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫鍵)[表20]

按照與實施例13相同的方法，使用如上所述制備的Nsc-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂(3.85g)與實施例13中合成的Nsc-AAsCt(1-10)-OH(1.2g)及上表中所列的溶劑和試劑實施片段的縮合，使用Fmoc-OSu引入二Fmoc得到4.2g結(jié)合肽的樹脂。將由所述結(jié)合肽的樹脂和TFA裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)反應(yīng)所得的肽混合物分離并純化得949mg 1，18-二Fmoc鮭魚降鈣素。
Maldi Tof；3877.41，(M+1＝3877.44)HPLC；98％以上(肽分析條件1)實施例16.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，18-二Nsc-鮭魚降鈣素的片段縮合合成結(jié)構(gòu)Nsc-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Nsc)-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫鍵)[表21]


按照實施例13中的方法，使用實施例15中制備的Nsc-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂(3.858)、實施例13中制備的Nsc-AAsCt(1-10)-OH(1.2g)以及上表中所列的溶劑和試劑實施片段的縮合，使用Nsc-OSu(3.72g在20ml DMF中的溶液)引入二Nsc得4.2g結(jié)合肽的樹脂。將由所述結(jié)合肽的樹脂和TFA裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)反應(yīng)所得的肽混合物分離并純化得941mg 1，18-二Nsc鮭魚降鈣素。
Maldi Tof；3947.41，(M+1＝3947.38)HPLC；98％以上(肽分析條件1)實施例17.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的11，18-二Fmoc-鮭魚降鈣素的片段縮合合成實施例17-1.11-Nα-Fmoc-11，18-二(ivDde)-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂的合成結(jié)構(gòu)Fmoc-Lys(ivDde)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)-Lys(ivDde)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-結(jié)合酰胺樹脂[表22]


反應(yīng)順序Nsc-Pro、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Gly、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Pro、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-His(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Glu(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Ser(tBu)、Nsc-Leu、Fmoc-Lys(ivDde)。
按照實施例13中的方法進行合成，結(jié)果得到6.1g充分干燥的樹脂，并且通過UV光譜分析確定樹脂的肽容量為0.15mmol/g(UV-光譜分析；容量0.13mmol/g)。
實施例17-2.通過縮合Nsc-AAsCt(1-10)-OH與Nsc-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂合成11，18-二Fmoc-鮭魚降鈣素結(jié)構(gòu)H-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Fmoc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Fmoc)-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫鍵)[表23]


按照實施例13中的方法，使用之前合成的Fmoc-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂(3.33g)與實施例13中制備的Nsc-AAsCt(1-10)-OH(1.2g)和上表中所列的溶劑和試劑實施片段的縮合?？s合后，通過與2×20ml解封閉溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)每次反應(yīng)5分鐘除去Nsc，用4×20ml DMF洗滌，與過量的Boc2O(0.55g在20ml DMF中的溶液)反應(yīng)以使用Boc保護N-末端，并用5×20ml DMF徹底洗滌。然后，將反應(yīng)產(chǎn)物用3×20ml 2％肼處理10-30分鐘以除去對堿不穩(wěn)定的ivDde，并通過基于將反應(yīng)液和2％肼的UV吸收度進行對比的TLC分析確證ivDde的除去。ivDde的除去完成時，將樹脂過濾并用4×20ml DMF、4×20ml DCM、4×20ml DMF洗滌，加入Fmoc-OSu(3.37g在20ml DMF中的溶液)并反應(yīng)2小時以引入二Fmoc。通過定性Kaiser試驗檢測二Fmoc的引入，將樹脂用4×20ml DMF和4×20ml DCM洗滌，在氮氣下干燥得4.5g結(jié)合肽的樹脂。
將通過上述所得樹脂與40ml TFA裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常溫下反應(yīng)約2小時所得的反應(yīng)液過濾，加入至300ml冷的乙醚中以生成肽沉淀。該沉淀經(jīng)離心分離，再用2×100ml乙醚洗滌并干燥得2.6g肽混合物。該肽混合物經(jīng)制備HPLC純化、濃縮、冷凍干燥得769mg 11，18-二Fmoc-鮭魚降鈣素。
Maldi Tof；3877.41，(M+1＝3877.44)HPLC；98％以上(肽分析條件1)實施例18.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的11，18-二Nsc-鮭魚降鈣素的片段縮合合成結(jié)構(gòu)H-Cys1-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys7-Val-Leu-Gly10-Lys(Nsc)-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys(Nsc)-Leu-Gln20-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly30-Thr-Pro-NH2(1，7-二硫鍵)[表24]


按照實施例13的方法，使用實施例17中合成的Fmoc-AAsCt(11-32)-結(jié)合酰胺樹脂(3.33g)與實施例13中制備的Nsc-AAsCt(1-10)-OH(1.2g)和上表中所列的溶劑和試劑實施片段的縮合。如實施例17所述引入Boc(0.55g在20ml DMF中的溶液)，除去ivDde，并使用Nsc-OSu(3.72g在20ml DMF中的溶液)引入二Nsc得到4.3g結(jié)合肽的樹脂。將所述結(jié)合肽的樹脂和TFA裂解溶液反應(yīng)所得的肽混合物分離并純化得942mg1，18-二Nsc鮭魚降鈣素。
Maldi Tof；3947.39，(M+1＝3947.38)HPLC；98％以上(肽分析條件1)實施例19.使用ivDde作為非靶位點支鏈胺基保護基的1，12-二Fmoc-GRF(1-29)的片段縮合合成實施例19-1.Nsc-AAGRF(1-15)-OH的合成結(jié)構(gòu)Nsc-Tyr(tBu)-Ala-Asp(tBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(Trt)-Tyr10(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(ivDde)-Val-Leu-Gly-OH

反應(yīng)順序Nsc-Leu、Nsc-Val、Fmoc-Lys(ivDde)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Tyr(tBu)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Asn(Trt)、Nsc-Thr(tBu)、Nsc-Phe、Nsc-Ile、Nsc-Ala、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Ala、Nsc-Tyr(tBu)將實施例13中合成的Nsc-Gly-2-CLTR投入200ml肽反應(yīng)器中，倒入50ml DCM并放置使樹脂充分膨脹。經(jīng)過濾除去DCM，并用2×50ml解封閉溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)每次處理5分鐘以除去Nsc。然后，用DMF充分洗滌5-7次所得混合物以用于下一步反應(yīng)。如實施例1所述，按照上述反應(yīng)順序使用被Nsc或Fmoc保護的氨基酸(1.5當量)、HOBt(1.5當量)、Bop(1.5當量)以及DIPEA(3.0當量)實施偶聯(lián)反應(yīng)。通過Kaiser試驗檢測反應(yīng)并通過氯醌試驗確證洗液中胺的存在。
將如此得到的結(jié)合肽的樹脂在肽可從2-CTRL樹脂上分離下來其它保護基仍被保留的條件下即，100ml DCM∶TFE∶AcOH(8∶1∶1)的條件下處理3小時，然后經(jīng)過濾分離反應(yīng)液并用2×100ml DCM洗滌樹脂。收集反應(yīng)液及洗液并濃縮至1/4體積，用100ml乙醇及100ml水稀釋并于冰箱中放置12小時。如此所得的固體經(jīng)過濾并干燥得12.6gNsc-AAGRF(1-15)-OH。
Maldi Tof；3144.09，(M+1＝3143.95)HPLC；92％以上(肽分析條件2)實施例19-2.Nsc-AAGRF(16-29)-結(jié)合酰胺樹脂的合成結(jié)構(gòu)Nsc-Gln(Trt)-Leu-Ser(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(tBu)-Ile-Met-Ser(Trt)-Arg(Pbf)-結(jié)合酰胺樹脂[表26]

反應(yīng)順序Nsc-Arg(pbf)、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Met、Nsc-Ile、Nsc-Asp(tBu)、Nsc-Gln(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Leu、Nsc-Lys(Boc)、Nsc-Arg(Pbf)、Nsc-Ala、Nsc-Ser(Trt)、Nsc-Leu、Nsc-Gln(Trt)如實施例1所述，根據(jù)所述反應(yīng)順序，使用2.0g結(jié)合酰胺樹脂與上表中所列的試劑和溶劑實施偶聯(lián)與解封閉。通過Kaiser試驗檢測偶聯(lián)并通過氯醌試驗確證洗液中殘留的副反應(yīng)物(side reactant)。最后得6.5g結(jié)合肽的樹脂，基于UV分析的反應(yīng)容量經(jīng)確定為0.12mmol/g。
實施例19-3.通過縮合Nsc-AAGRF(1-15)-OH與Nsc-AAGRF(16-29)-結(jié)合酰胺樹脂合成1，12-二Fmoc-GRF(1-29)結(jié)構(gòu)Fmoc-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys(Fmoc)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2[表27]

將上述合成的Nsc-AAGRF(16-29)-結(jié)合酰胺樹脂(4.17g)置于適宜的的肽反應(yīng)器中。向該反應(yīng)器中倒入30ml DCM并使樹脂充分膨脹，經(jīng)過濾除去溶液，用2×20ml解封閉溶液(1％DBU-20％哌啶的DMF溶液)每次處理5分鐘以除去Nsc。將樹脂用DMF徹底洗滌，將之前制備的Nsc-AAGRF(1-15)-OH(2.36g)溶于10ml DMSO并投入反應(yīng)器中。將上表所列的HOBt、DIPEA、Bop等加入至反應(yīng)液中并反應(yīng)12小時。通過HPLC每2小時檢查反應(yīng)進程，當確證反應(yīng)完成時，將反應(yīng)液用DMF徹底洗滌。
片段縮合完成后，將樹脂用2％肼的DMF溶液(3×20ml)每次處理20分鐘以除去ivDde與Nsc。通過如實施例4中所述的TLC分析確證ivDde的除去，并將所得產(chǎn)物用清洗溶劑徹底洗滌。通過以Fmoc-OSu(3.37g在20ml DMF中的溶液)處理2小時將Fmoc引入1位與12位，充分洗滌，經(jīng)真空干燥得4.3g結(jié)合肽的樹脂。
取1g所述干燥的樹脂并與10ml裂解溶液(2.5∶2.5∶95＝TIS∶水∶TFA)在常溫下反應(yīng)約90分鐘，再與TMS-Br及EDT反應(yīng)15分鐘。經(jīng)過濾除去樹脂，將樹脂用2ml TFA洗滌。收集洗液和濾液并加入至100ml乙醚中，經(jīng)離心以使所形成的沉淀物得以沉淀，再次離心并用3×50ml乙醚洗滌。該沉淀物經(jīng)氮氣干燥得654mg干燥的肽混合物，該混合物經(jīng)制備HPLC純化、冷凍干燥得141mg 1，12-二Fmoc-GRF(1-29)。
Maldi Tof；3803.49，(M+1＝3803.46)HPLC；97％以上(肽分析條件1)實施例20.用1，11-二Fmoc-鮭魚降鈣素制備Lys18-PEG 2K-鮭魚降鈣素將10mg當量的1，11-二Fmoc鮭魚降鈣素溶于1ml DMF中，加入0.2％TEA后，加入5當量的聚乙二醇2,000琥珀酰亞胺丙酸酯并于45℃下反應(yīng)1小時。加入50μl哌啶并反應(yīng)5分鐘以除去Fmoc，然后通過加入500μl10％三氟乙酸/乙腈酸化。將該反應(yīng)液用20mM乙酸鈉緩沖液(pH4.5)稀釋10倍并于下述條件下用離子交換色譜純化。加入流出液并使之附著于C-18 Sep-Pak柱，用20ml蒸餾水洗滌，用5ml 70％乙腈洗脫。在氮氣下蒸發(fā)流出液中的乙腈并冷凍干燥。
當如試驗例1所述測定時，所述樣品的反相色譜圖(圖1-B)呈現(xiàn)單峰，除單PEG 2K鮭魚降鈣素外，未反應(yīng)的鮭魚降鈣素、二PEG 2K鮭魚降鈣素、三PEG 2K鮭魚降鈣素等未能通過MALDI-TOF質(zhì)譜檢測出來(圖2)。此外，如試驗例1所述測得的Lys-C酶處理片段的MALDI-TOF質(zhì)譜僅出現(xiàn)與碎片Lys18-PEG 2K-GRF(1-29)對應(yīng)的峰(圖3-B)。當樣品溶于蒸餾水中并如試驗例1所述的基于反相色譜相對于鮭魚降鈣素標準品測定時，收率為87.6％。
色譜柱TSK SP-5PW(55×200mm，15μm)(強陽離子交換介質(zhì))洗脫液洗脫液A20mM乙酸鈉(pH4.5)洗脫液B300mM氯化鈉/20mM乙酸鈉(pH4.5)洗脫液C1M氯化鈉/20mM乙酸鈉(pH4.5)00-10min100％A10-40min0％A→100％B40-50min100％C流速3ml/min檢測UV215nm比較例1.使用鮭魚降鈣素制備單-PEG 2K-鮭魚降鈣素將鮭魚降鈣素10mg溶于5ml的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中，加入1.5當量的聚乙二醇2,000琥珀酰亞胺丙酸酯，并于常溫反應(yīng)20分鐘，然后加入50μl 1M甘氨酸溶液并放置30分鐘以完成反應(yīng)。用分子排阻色譜將該反應(yīng)液分成5份以分離單PEG結(jié)合物。收集流出液并使之附著于C-18 Sep-Pak柱，用20ml蒸餾水洗滌，并用5ml 70％乙腈洗脫。在氮氣下蒸發(fā)流出液中的乙腈并冷凍干燥。
當如試驗例1所述測定時，該樣品的反相色譜圖呈現(xiàn)分別指示Cys1-Nα-PEG 2K-鮭魚降鈣素、Lys11-PEG 2K-鮭魚降鈣素和Lys18-PEG 2K-鮭魚降鈣素的三個峰(圖1-A)，且峰面積之比大約為1∶1∶1。將樣品溶于蒸餾水并如試驗例1所述基于反相色譜圖相對于鮭魚降鈣素標準品測定，得到收率為28.4％。
色譜柱Superose 12 HR 10/30(Amersham pharmacia)洗脫液10mM PBS(pH7.4)流速0.4ml/min檢測UV 215nm試驗例1.Lys18-PEG 2K-鮭魚降鈣素的鑒定試驗例1-1.基于反相色譜的異構(gòu)體的鑒定及測定按照Pharm.Res.，16(6)，813-818，1999中所述的方法，在下列條件下用反相色譜比較實施例20和比較例1中獲得的樣品。實施例20的樣品顯示代表Lys18-PEG 2K-鮭魚降鈣素的單峰(圖1-B)，而比較例1的樣品顯示比例為1∶1∶1的對應(yīng)于Cys1-Nα-PEG 2K-鮭魚降鈣素、Lys11-PEG 2K-鮭魚降鈣素以及Lys18-PEG 2K-鮭魚降鈣素的多個峰(圖1-A)。當換算為Lys18-PEG 2K-鮭魚降鈣素峰面積與鮭魚降鈣素標準品峰面積的比時，實施例20的收率為87.6％。在比較例1中，當基于三種不同位置的異構(gòu)體的總峰面積與鮭魚降鈣素標準品峰面積的比計算時，單PEG結(jié)合物的總收率為28.4％，而Lys18-PEG 2K-鮭魚降鈣素(峰2)的收率為10.2％。
色譜柱Lichrospher 100 RP-8(4mm ID×250mm L，5μm，Merck)流動相洗脫液A0.1％TFA/D.W.
洗脫液B0.1％TFA/AcCN
00-30min 36％B→44％B流速1ml/min檢測UV 215nm試驗例1-2.以MALDI-TOF質(zhì)譜分析鑒定副反應(yīng)物和異構(gòu)體在下列MALDI-TOF質(zhì)譜分析條件下，實施例20的樣品僅出現(xiàn)一個對應(yīng)于單PEG 2K-鮭魚降鈣素的峰，而未反應(yīng)的鮭魚降鈣素、二PEG2K鮭魚降鈣素、三PEG 2K鮭魚降鈣素等都均未出現(xiàn)(圖2)。使用Lys-C酶處理得自實施例20的樣品所得片段的MALDI-TOF質(zhì)譜圖與以同樣方法處理的鮭魚降鈣素標準品的對比見圖3。通過將10μl樣品與5μl 5mM含有Lys-C酶(0.1μg/ml)的tris緩沖液(pH8.5)于37℃下反應(yīng)1小時，并與基質(zhì)溶液以1∶2的比例混合制備以Lys-C酶處理的樣品。經(jīng)以Lys-C酶處理的鮭魚降鈣素片段的MALDI-TOF質(zhì)譜圖(圖3-A)確證各峰對應(yīng)于Pro1-Gly10片段，Lys11-His17片段以及Lys18-pro32片段，而以Lys-C酶處理的實施例20樣品的片段的MALDI-TOF質(zhì)譜圖(圖3-B)僅顯示對應(yīng)于Pro1-Gly10片段和結(jié)合PEG的Lys11-pro32片段，而未檢測到Lys11-His17片段和Lys18-pro32片段的峰?；诖私Y(jié)果可以確證，實施例20中的樣品是PEG僅結(jié)合于Lys18位置的Lys18-單-PEG 2K-鮭魚降鈣素。
離子選擇正離子基質(zhì)溶液α-氰基-4-羥基肉桂酸飽和溶液(0.1％TFA/50％AcCN/DW)模式線性樣品∶基質(zhì)＝1∶2加速電壓25kV實施例21.使用1，11-二Fmoc-鮭魚降鈣素制備Lys18-PEG 1K-鮭魚降鈣素、Lys18-PEG 5K-鮭魚降鈣素以及Lys18-PEG 10K-鮭魚降鈣素按照實施例20種所述的方法，使用1，11-二Fmoc-鮭魚降鈣素與聚乙二醇1,000琥珀酰亞胺丙酸酯、聚乙二醇5,000琥珀酰亞胺丙酸酯及聚乙二醇10,000琥珀酰亞胺丙酸酯制備Lys18-PEG 1K-鮭魚降鈣素、Lys18-PEG 5K-鮭魚降鈣素和Lys18-PEG 10K-鮭魚降鈣素。當用實施例1所述程序測定各樣品時，其產(chǎn)率分別為86.9％、81.5％及82.7％，并且除Lys18-PEG結(jié)合物外，未檢測到其它肽衍生物或異構(gòu)體。
實施例22.使用1，11-二Nsc-鮭魚降鈣素制備Lys18-PEG 2K-鮭魚降鈣素將10mg當量的1，11-二Nsc-鮭魚降鈣素溶于1ml DMF中并加入0.2％TEA，然后加入5當量的聚乙二醇2,000琥珀酰亞胺丙酸酯并于45℃下反應(yīng)1小時。加入100μl哌啶并反應(yīng)5分鐘以除去Nsc，然后用500μl 10％三氟乙酸/乙腈酸化。在與實施例20中相同的條件下純化該反應(yīng)液，并以試驗例1中所述的方法相對鮭魚降鈣素計算得到收率為84.8％。此外，對于如試驗例1所述獲得的經(jīng)Lys-C酶處理的片段的反相色譜和MALDI-TOF質(zhì)譜圖而言，除Lys18-pEG 2K-鮭魚降鈣素外，未檢測到其它肽衍生物或異構(gòu)體。
實施例23.使用1，12-二Fmoc-GRF(1-29)制備Lys21-PEG 5K-GRF(1-29)將10mg當量的1，12-二Fmoc-GRF(1-29)溶于1ml DMF中并加入0.2％TEA，然后加入5當量的聚乙二醇5,000琥珀酰亞胺丙酸酯并于45℃下反應(yīng)1小時。加入50μl哌啶并反應(yīng)5分鐘以除去Fmoc，然后用500μl10％三氟乙酸/乙腈酸化。用與實施例20中相同的條件純化該反應(yīng)液得結(jié)合PEG的肽。當如試驗例2所述測定該樣品時，樣品的反相色譜圖(圖4-B)僅出現(xiàn)一單峰，且其MALDI-TOF質(zhì)譜圖也只出現(xiàn)對應(yīng)于單PEG5K-GRF(1-29)的峰，而未檢測到未反應(yīng)的GRF(1-29)、二PEG 5K-GRF(1-29)以及三PEG 5K-GRF(1-29)(圖5)。此外，如試驗例2所述獲得的以Lys-C酶處理的片段的MALDI-TOF質(zhì)譜圖僅顯示對應(yīng)于Lys21-PEG5K-GRF(1-29)片段的峰(圖6-B)。當樣品溶解于蒸餾水并經(jīng)基于如試驗例2所述的反相色譜相對于GRF(1-29)標準品進行分析時，其收率為91.2％。
試驗例2.Lys21-PEG 5K-GRF(1-29)的鑒定根據(jù)在下列條件得到的反相色譜圖，實施例23的樣品顯示對應(yīng)于單PEG 5K-GRF(1-29)的單峰(圖4-B)，而未出現(xiàn)對應(yīng)于未反應(yīng)的GRF(1-29)的峰(圖4-A)或其它峰。此外，以如試驗例1所述的方法得到的MALDI-TOF質(zhì)譜圖除單PEG 5K-GRF(1-29)外未顯示其他肽衍生的峰(圖5)。此外，以如試驗例1所述的方法得到的以Lys-C酶處理的片段的MALDI-TOF質(zhì)譜圖(圖6-B)也僅出現(xiàn)Try1-Arg11片段或結(jié)合有PEG 5K的Lys21-Arg29片段的峰，而未能檢測出在經(jīng)同樣方法處理的GRF(1-29)的MALDI-TOF質(zhì)譜圖(圖6-A)鑒定的Lys12-Arg20片段或Lys21-Arg29片段。基于此結(jié)果可以確證，實施例23的樣品是PEG僅結(jié)合到Lys21位置的Lys21-單-PEG 5K-GRF(1-29)。
色譜柱Lichrospher 100 RP-8(4mm ID×250mmL，5μm，Merck)流動相洗脫液A0.1％TFA/D.W.
洗脫液B0.1％TFA/AcCN00-15min34％B→55％B流速1ml/min檢測UV 215nm實施例24.使用1，12-二Nsc-GRF(1-29)制備Lys21-PEG 1K-GRF(1-29)將10mg當量的1，12-二Nsc-GRF(1-29)溶于1ml DMF中并加入0.2％TEA，然后加入5當量的聚乙二醇1,000琥珀酰亞胺丙酸酯并于45℃下反應(yīng)1小時。加入100μl哌啶并反應(yīng)5分鐘以除去Nsc，然后用500μl 10％三氟乙酸/乙腈酸化。在與實施例20相同的條件下純化該反應(yīng)液，并如試驗例2所述相對于GRF(1-29)標準品進行反相色譜分析，得收率為92.8％。此外，如試驗例1所述得到的MALDI-TOF質(zhì)譜圖僅顯示對應(yīng)于單-PEG 1K-GRF(1-29)的峰，而經(jīng)Lys-C酶處理的片段的MALDI-TOF質(zhì)譜圖也僅顯示對應(yīng)于Lys21-PEG 1K-GRF(1-29)片段的峰。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明僅僅通過改變酸-堿條件便能合成非靶位點胺基被選擇性地保護的肽。因此，在與常規(guī)的生產(chǎn)其中PEG特異性地結(jié)合于靶位點胺基的結(jié)合PEG的肽的方法相比時，本發(fā)明具有以下優(yōu)點終產(chǎn)物能以更高的收率獲得，不需要復雜的分離純化，因而本發(fā)明提供了經(jīng)濟的方法，能防止生成常規(guī)工藝中不可避免的副產(chǎn)物，因此本發(fā)明的產(chǎn)物更適于臨床使用。因此，當本發(fā)明的結(jié)合PEG的肽用于臨床應(yīng)用時，聚乙二醇化效果能被最大化。
序列表<110>派格斯菲爾有限公司<120>非靶位點胺基被保護的肽，其制備方法以及使用該肽制備特異性地結(jié)合的pEG肽的方法<130>03op101p<160>2<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>32<212>PRT<213>Oncorhynchus keta<300>
<301>O′Dor，RKParkes，COCopp，DH<302>Amino acid composition of salmon calcitonin<303>Can.J.Biochem.
<305>47<306>823-825<307>1969-01-01<400>1Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu1 5 10 15His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro20 25 30<210>2<211>29<212>PRT<213>Homo sapiens<300>
<301>Rivier，J.et al.
<302>Characterization of a growth hormone-releasing factor from ahuman pancreatic islet tumor<303>Nature<305>300<306>276-278<307>1982-01-01<400>2Tyr Ala Asp Ala Ile phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg20 25權(quán)利要求
1.一種制備非靶位點胺基被選擇性地保護的肽的方法，其包括分別以ivDde或Mtt、以及Boc封閉靶位點支鏈胺基與非靶位點支鏈胺基，以及以Fmoc或Nsc保護Nα-胺基，從而合成所述肽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括以至少一個選自Fmoc、Nsc、Dde以及ivDde的最終胺基保護基取代包括Nα-胺基的非靶位點胺基的胺基保護基。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括以Boc取代包括Nα-胺基的非靶位點胺基的胺基保護基。
4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其中肽的合成是通過固相合成實施。
5.如權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其中肽序列被分為至少兩個片段，各片段經(jīng)單獨合成然后經(jīng)縮合生成肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的方法制備的非靶位點胺基被選擇性地保護的肽。
7.如權(quán)利要求6所述的肽，其中所述肽為降鈣素或GRF(1-29)。
8.一種制備其中PEG特異性地結(jié)合到靶位點胺上的特異性地結(jié)合的PEG-肽的方法，其包括(1)將如權(quán)利要求6所述的肽與經(jīng)活化的PEG反應(yīng)的步驟，以及(2)在酸-堿解封閉條件下除去步驟(1)中所得到的化合物的胺基保護基的步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其進一步包括將步驟(2)的產(chǎn)品純化的步驟。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述純化步驟包括通過離子交換色譜分離產(chǎn)品、脫鹽、然后干燥。
11.如權(quán)利要求8至10任一項所述的方法，其中所述經(jīng)活化的PEG為分子量范圍在1,000至40,000內(nèi)的直鏈或支鏈羥基或甲氧基型烷基化或酰化PEG。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述經(jīng)活化的PEG為選自以下組中的至少之一單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺氨基甲酸酯以及單甲氧基聚乙二醇tresylate。
全文摘要
本發(fā)明涉及非靶位點胺基被選擇性地保護的合成肽及其制備方法，以及應(yīng)用該合成肽將PEG特異性地結(jié)合至靶位點的方法。本發(fā)明能以高得多的收率提供其中PEG與靶位點的胺基特異性地結(jié)合的PEG結(jié)合肽。
文檔編號C07K1/06GK1745091SQ03825828
公開日2006年3月8日 申請日期2003年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月18日
發(fā)明者李相得, 李康春, 羅東熙, 尹裕錫 申請人:派格斯菲爾有限公司