專利名稱：合成雙功能復(fù)合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于得到包含展示分子部分和編碼部分的雙功能復(fù)合物的方法。本發(fā)明還涉及一種用于生成雙功能復(fù)合物庫的方法，一種用于鑒定具有預(yù)選性能的展示分子的方法。
背景已經(jīng)開發(fā)出能夠?qū)Χ嚯暮推渌酆衔镞M(jìn)行合成編碼的方法。該方法的一個(gè)例子公開于US 5,723,598，其中涉及雙功能分子庫的生成。雙功能復(fù)合物的一個(gè)部分是多肽且另一部分是包含用于編碼和鑒別已參與形成多肽的氨基酸的核苷酸序列的標(biāo)識(shí)符寡核苷酸。在生成雙功能分子的庫之后，在對(duì)靶親和性方面進(jìn)行分配且雙功能分子的標(biāo)識(shí)符寡核苷酸部分利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。最終，PCR擴(kuò)增子被測序和解碼用于鑒別具有靶親和性的多肽。雙功能復(fù)合物庫通過一種通常稱作分開-和-混合的方法而制成。該方法意味著接頭分子被分開至空間分離的隔室中并在每個(gè)隔室中在一端與特定氨基酸前體反應(yīng)并在另一端通過正交化學(xué)反應(yīng)添加編碼該特定氨基酸前體的核酸標(biāo)簽。隨后，收集(混合)各隔室的內(nèi)容物并隨后再次分開至數(shù)個(gè)隔室，用于新一輪的與氨基酸前體和核苷酸標(biāo)簽的交替反應(yīng)。繼續(xù)該分開-和-混合法直至多肽達(dá)到所需長度。
該已有技術(shù)方法在其應(yīng)用中受到局限，因?yàn)橛糜诩尤牖瘜W(xué)單元或用于加入核苷酸或寡核苷酸序列的兩種交替合成步驟之間必須存在相容的化學(xué)。根據(jù)已有技術(shù)，合成相容性問題通過在合成交替聚合物時(shí)正確選擇相容的保護(hù)基團(tuán)，和通過正確選擇用于在一種生長中的聚合物保持被封閉的同時(shí)選擇性地去保護(hù)另一生長中的聚合物的方法而解決。
Halpin和Harbury在WO 00/23458中建議了另一方案，其中所形成的分子不僅被核酸標(biāo)簽鑒別而且被它指導(dǎo)。該方案也基于分開-和-混合技術(shù)，其中使用兩個(gè)或多個(gè)合成步驟得到組合庫。使用多個(gè)核酸模板，其中每個(gè)在一端具有化學(xué)反應(yīng)部位點(diǎn)和在整個(gè)鏈中分散多個(gè)密碼子區(qū)域，每個(gè)所述密碼子區(qū)域又規(guī)定不同的密碼子。模板通過密碼子雜交至固定化探針上而分離和隨后每個(gè)鏈在化學(xué)反應(yīng)部位與特定選擇的試劑反應(yīng)。隨后，所有的鏈被集中并基于第二密碼子區(qū)域進(jìn)行第二分配。該分開-和-混合法進(jìn)行合適的次數(shù)以得到通常103至106種不同的化合物的庫。該方法的缺點(diǎn)在于必須提供大量的核酸模板。如果需要106種不同化合物的最終庫，必須合成總共106個(gè)核酸模板。這種合成一般麻煩或昂貴，因?yàn)楹怂崮０灞仨毦哂邢喈?dāng)?shù)拈L度以確保密碼子區(qū)域和探針之間足夠的雜交。
在WO 02/074929中，公開了一種用于合成化合物的方法。這些化合物通過起始將包含反密碼子和反應(yīng)性單元的轉(zhuǎn)移單元與具有與其相連的反應(yīng)性單元的模板在允許反密碼子雜交至模板上的條件下接觸和隨后使反應(yīng)性單元反應(yīng)而合成。另外，該方法的缺點(diǎn)在于，必須起始提供大量的核酸模板。
使用模板的已有技術(shù)方法的缺點(diǎn)在于，編碼取決于反密碼子和模板之間的鑒別。兩種寡核苷酸之間的雜交可在兩者之間存在足夠互補(bǔ)性時(shí)發(fā)生。有時(shí)，雜交甚至在寡核苷酸之間不存在完全匹配的情況下發(fā)生。其后果是，如果存在多個(gè)轉(zhuǎn)移單元，那么有時(shí)模板的密碼子序列不對(duì)應(yīng)于實(shí)際反應(yīng)的反應(yīng)性單元。該不希望的后果在希望形成庫時(shí)甚至更加明顯，因?yàn)槎鄠€(gè)模板和構(gòu)件被估計(jì)在反應(yīng)介質(zhì)中相互尋找。如果雜交步驟不完全適當(dāng)，會(huì)產(chǎn)生被在模板上的不正確密碼子編碼的分子。這對(duì)針對(duì)該庫進(jìn)行的選擇方法產(chǎn)生兩種主要作用。首先，具有編碼結(jié)合配體的密碼子組合的模板會(huì)在選擇過程中損失。第二，而且更重要的是，具有編碼非結(jié)合性配體的密碼子組合的模板將被富集。
本發(fā)明的一個(gè)方面的目的是提供一種用于得到被編碼分子的非模板依賴性方法，所述方法使得多種化學(xué)能夠被應(yīng)用于被編碼分子的形成，因?yàn)榭杀苊庀嗳莸恼槐Ｗo(hù)基團(tuán)在被編碼分子和寡核苷酸標(biāo)簽的交替形成中的應(yīng)用。本發(fā)明在一個(gè)優(yōu)選方面意欲改進(jìn)以前在密碼子鑒別過程中顯示的易錯(cuò)雜交方法。另外，本發(fā)明的目的是減少所形成的非特異性反應(yīng)產(chǎn)物。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，本方法具有固有校正性質(zhì)以確保表現(xiàn)型被基因型準(zhǔn)確地編碼。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種用于得到包含展示分子(display molecule)部分和編碼部分的雙功能復(fù)合物的方法，其中包含化學(xué)反應(yīng)部位和用于酶加入標(biāo)簽(tag)的引發(fā)部位(priming site)的新生雙功能復(fù)合物在化學(xué)反應(yīng)部位與一種或多種反應(yīng)物反應(yīng)，并且在引發(fā)部位上使用一種或多種酶給該復(fù)合物提供標(biāo)識(shí)反應(yīng)物的各自的標(biāo)簽。
酶一般是底物特異性的，因此標(biāo)簽至引發(fā)部位上的酶加入不可能干擾正在形成的展示分子。因此，保護(hù)基團(tuán)在編碼部分以及新生展示分子上的應(yīng)用因此可被避免。但可因?yàn)槠渌蛐枰Ｗo(hù)正生長中的展示分子?？傻玫皆诤陀袡C(jī)介質(zhì)中具有活性的酶。但大多數(shù)酶在水介質(zhì)中具有高于在有機(jī)介質(zhì)中的活性。因此，在提供標(biāo)簽之前或之后，可能需要改變介質(zhì)以得到可用于反應(yīng)物在化學(xué)反應(yīng)部位上反應(yīng)的條件。
一般，展示分子部分通過一種或多種反應(yīng)物和化學(xué)反應(yīng)部位之間一輪以上的反應(yīng)而形成。在本發(fā)明的某些方面，與一種或多種反應(yīng)物反應(yīng)和提供有各自的標(biāo)簽的新生雙功能復(fù)合物進(jìn)一步一次或多次與一種或多種反應(yīng)物反應(yīng)和向其提供各自的標(biāo)識(shí)標(biāo)簽，得到作為雙功能復(fù)合物的一部分的反應(yīng)產(chǎn)物和包含標(biāo)簽的標(biāo)識(shí)部分，所述標(biāo)識(shí)部分編碼已參與形成反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)物的身份(identity)。
在本發(fā)明的某些方面，反應(yīng)的輪或周期是指，單個(gè)反應(yīng)物與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)且用于標(biāo)識(shí)反應(yīng)物的各自的標(biāo)簽被提供在用于酶加入的引發(fā)部位上。在本發(fā)明的另一方面，一輪反應(yīng)意味著多個(gè)反應(yīng)物在化學(xué)反應(yīng)部位上反應(yīng)且用于標(biāo)識(shí)一種或多個(gè)，但不必所有的，反應(yīng)物的標(biāo)簽被提供在用于酶加入的引發(fā)部位上。在化學(xué)反應(yīng)部位上的反應(yīng)和標(biāo)簽的加入可按照任何順序發(fā)生，即反應(yīng)可在標(biāo)簽加入之后，同時(shí)，或之前發(fā)生。對(duì)順序的選擇可取決于酶種類，反應(yīng)條件，和反應(yīng)物種類，以及其它。
新生雙功能復(fù)合物包含化學(xué)反應(yīng)部位和用于標(biāo)簽的酶加入的引發(fā)部位。任選地，新生雙功能復(fù)合物還包含連接部分(linking moiety)，它連接化學(xué)反應(yīng)部位與引發(fā)部位。連接部分可用于各種目的，如使引發(fā)部位與化學(xué)反應(yīng)部位彼此相距足夠遠(yuǎn)以允許酶進(jìn)行標(biāo)簽加入和提供雜交區(qū)域。在本發(fā)明的一個(gè)方面，連接部分是核酸序列。寡核苷酸的長度優(yōu)選適用于與互補(bǔ)性寡核苷酸雜交，即連接部分中的核苷酸的數(shù)目合適地是8或以上。在某些實(shí)施方案中，連接部分通過間隔基連接到化學(xué)反應(yīng)部位上，間隔基包含可選擇性地?cái)嗔训慕宇^以使展示分子能夠在形成最終雙功能復(fù)合物之后的步驟中脫離編碼部分。新生雙功能復(fù)合物也被稱作生長中的復(fù)合物和表示待根據(jù)本發(fā)明方法處理的起始或中間復(fù)合物。中間復(fù)合物表示已進(jìn)行一輪或多輪反應(yīng)物反應(yīng)和標(biāo)簽加入的起始復(fù)合物。
化學(xué)反應(yīng)部位可包含單個(gè)或多個(gè)能夠與一種或多種反應(yīng)物反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)。在某些方面，化學(xué)反應(yīng)部位包含連接有一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的支架(scaffold)。合適的反應(yīng)基團(tuán)的例子包括胺，羧酸，硫(thio)，醛，和羥基基團(tuán)。支架的例子包括苯并二氮雜_類，甾族，hydantiones，哌嗪類，二酮哌嗪類，嗎啉類，托烷類，香豆素類，喹啉類，吲哚類，呋喃類，吡咯類，噁唑類，氨基酸前體，和噻唑類。另外，化學(xué)反應(yīng)部位的反應(yīng)基團(tuán)可以是在可與反應(yīng)物進(jìn)行反應(yīng)之前必須被活化的前形(pro-form)。例如，反應(yīng)基團(tuán)可用合適的基團(tuán)保護(hù)，后者需要在可與反應(yīng)物進(jìn)行反應(yīng)之前被去除。本說明書或權(quán)利要求中的展示分子表示已與一種或多種反應(yīng)物反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)部位。
本發(fā)明的反應(yīng)物包括游離反應(yīng)物以及包含功能實(shí)體(funcitionalentity)和核酸序列的反應(yīng)物。游離反應(yīng)物參與與化學(xué)反應(yīng)部位的反應(yīng)和可得到最終展示分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。連接到核酸上的功能實(shí)體在本文中可被稱作構(gòu)件(building block)和表示功能實(shí)體能夠在化學(xué)反應(yīng)部位上反應(yīng)的化學(xué)實(shí)體。在本發(fā)明的某些方面，功能實(shí)體從核酸部分上分開和轉(zhuǎn)移至化學(xué)反應(yīng)部位。構(gòu)件的寡核苷酸可具有或不具有關(guān)于功能實(shí)體身份的信息。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，反應(yīng)物是包含與連接部分足夠互補(bǔ)從而能夠雜交的寡核苷酸，可轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體，和用于標(biāo)識(shí)該功能實(shí)體的反密碼子的構(gòu)件。游離反應(yīng)物一般不連接到核酸上，除非在最終展示分子中需要核酸組分。游離反應(yīng)物可具有任何化學(xué)結(jié)構(gòu)和優(yōu)選包含反應(yīng)基團(tuán)或其前體，它們能夠與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)。反應(yīng)基團(tuán)的例子包括羥基基團(tuán)，羧酸基團(tuán)，硫醇，異氰酸酯，胺，酯，和硫酯。任選地，可存在其它的反應(yīng)物介導(dǎo)游離反應(yīng)物和化學(xué)反應(yīng)部位之間的連接。構(gòu)件的功能實(shí)體就與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)的要求而言類似游離反應(yīng)物。但是，另外，在大多數(shù)情況下需要在該反應(yīng)之后斷開功能實(shí)體和核酸之間的連接。任選地，反應(yīng)和斷裂可在單個(gè)步驟中發(fā)生。以下詳細(xì)公開各類構(gòu)件。在本發(fā)明的某些方面，游離反應(yīng)物或功能實(shí)體不包括核苷酸。
新生雙功能復(fù)合物的編碼部分通過使用一種或多種酶向引發(fā)部位加入至少一個(gè)標(biāo)簽而形成。進(jìn)一步的標(biāo)簽可連接到以前的標(biāo)簽上以得到直鏈或支鏈標(biāo)識(shí)符(identifier)。只要標(biāo)識(shí)符的至少一個(gè)標(biāo)簽通過酶催化反應(yīng)而連接，進(jìn)一步的標(biāo)簽可使用化學(xué)方式或酶方式根據(jù)試驗(yàn)者的意愿而提供。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所有的標(biāo)簽使用酶催化反應(yīng)而提供。標(biāo)簽合適地包含識(shí)別單元，即可被識(shí)別基團(tuán)識(shí)別的單元。識(shí)別單元具有攜帶信息以標(biāo)識(shí)反應(yīng)物的能力。實(shí)際上存在各種不同種類的識(shí)別。例子是識(shí)別表位的抗體，識(shí)別另一蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，識(shí)別蛋白質(zhì)的mRNA，和識(shí)別互補(bǔ)性寡核苷酸序列的寡核苷酸。一般優(yōu)選的是，標(biāo)簽是核苷酸序列。
雙功能復(fù)合物的編碼部分在本發(fā)明的優(yōu)選方面是可擴(kuò)增的。被擴(kuò)增的能力使得能夠在選擇過程中使用低量的雙功能復(fù)合物。如果標(biāo)簽是蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可通過連接已編碼其合成的mRNA，由mRNA生成cDNA和使所述mRNA經(jīng)受翻譯體系而擴(kuò)增。這些體系公開于WO98/31700，其內(nèi)容在此通過參考并入本發(fā)明。用于擴(kuò)增蛋白質(zhì)標(biāo)簽的另一方法是使用噬菌體展示的蛋白質(zhì)。但一般來說，標(biāo)簽是可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如PCR擴(kuò)增的核苷酸序列。如果兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽存在于線性標(biāo)識(shí)性寡核苷酸中，所述寡核苷酸一般由某一種類的主鏈結(jié)構(gòu)組成，以允許酶識(shí)別該寡核苷酸作為底物。例如，主鏈結(jié)構(gòu)可以是DNA或RNA。
新生雙功能復(fù)合物的引發(fā)部位能夠接受標(biāo)簽。引發(fā)部位的化學(xué)身份取決于所用的標(biāo)簽和特定酶的種類以及其它。如果標(biāo)簽是多核苷酸，引發(fā)部位一般包含接受性核苷酸的3’-OH或5’-磷酸基團(tuán)，或這些基團(tuán)的功能衍生物?？捎糜趯?biāo)簽酶促加入引發(fā)部位上的酶包括選自聚合酶，連接酶，和重組酶，和這些酶的組合的酶。
化學(xué)反應(yīng)部位和一種或多種反應(yīng)物之間的反應(yīng)可在有利于該反應(yīng)的合適的條件下進(jìn)行。在本發(fā)明的一些方面，該反應(yīng)在雜交條件下進(jìn)行，即在反應(yīng)條件下保持兩種互補(bǔ)性寡核苷酸之間的退火。在本發(fā)明的其它方面，該反應(yīng)在變性條件下進(jìn)行以使條件合適反應(yīng)發(fā)生。如果生長中的復(fù)合物的編碼部分包含寡核苷酸；所述寡核苷酸在本發(fā)明的一個(gè)方面在反應(yīng)過程中是雙鏈形式以減少寡核苷酸的組分和反應(yīng)物之間副反應(yīng)的可能性。
用于標(biāo)識(shí)反應(yīng)物的標(biāo)簽可使用任何合適的酶而加至引發(fā)部位。在某些實(shí)施方案中，標(biāo)簽采用酶延伸反應(yīng)被提供在新生雙功能復(fù)合物的引發(fā)部位。延伸反應(yīng)可通過聚合酶或連接酶或其組合而進(jìn)行。使用聚合酶的延伸作用合適地使用反標(biāo)簽寡核苷酸(anti-tagoligonucleotide)作為模板而進(jìn)行。反標(biāo)簽寡核苷酸在新生雙功能復(fù)合物的寡核苷酸部分的3’端退火，并有一個(gè)包含能夠標(biāo)識(shí)反應(yīng)物的反密碼子的單鏈突出端。反標(biāo)簽的反密碼子可使用聚合酶和dNTPs混合物被轉(zhuǎn)錄至標(biāo)識(shí)符部分上?；蛘?，連接酶用于使用一種或多種寡核苷酸作為底物而加入標(biāo)簽。連接可根據(jù)所用的酶在單鏈或雙鏈態(tài)下進(jìn)行。一般來說優(yōu)選在雙鏈態(tài)下連接，即所要連接在一起的寡核苷酸通過一種能夠互補(bǔ)這兩個(gè)寡核苷酸的末端的互補(bǔ)性寡核苷酸而保持在一起。
合適的酶的例子包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶，DNA連接酶，RNA連接酶，Taq DNA聚合酶，Pfu聚合酶，Vent聚合酶，HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶，Klenow片段，或任何能夠催化互補(bǔ)性元件如單-，二-或多核苷酸的引入的其它酶。也可使用允許錯(cuò)配延伸的其它種類的聚合酶，例如DNA聚合酶η(Washington等人，(2001)JBC 2762263-2266)，DNA聚合酶ι(Vaisman等人，(2001)JBC 27630615-30622)，或允許延伸錯(cuò)配退火堿基對(duì)的任何其它酶。另一方面，如果使用連接酶，合適的例子包括Taq DNA連接酶，T4 DNA連接酶，T4 RNA連接酶，T7 DNA連接酶，和大腸桿菌(E.coli)DNA連接酶。對(duì)連接酶的選擇在一定程度上取決于所要連接在一起的末端的設(shè)計(jì)。因此，如果末端是平端，T4 RNA連接酶可以是優(yōu)選的，而對(duì)于粘性末端連接，即其中每端上的突出端是相互互補(bǔ)的連接，Taq DNA連接酶可以是優(yōu)選的。
加至新生雙功能復(fù)合物的引發(fā)部位上的標(biāo)簽具有有關(guān)反應(yīng)物的信息。在本發(fā)明中以及權(quán)利要求書中，涉及反應(yīng)物的信息被稱作密碼子。除了編碼反應(yīng)物身份的核苷酸的組合，標(biāo)簽可包含其它核苷酸。在本發(fā)明的某些方面，標(biāo)簽包含構(gòu)架序列(framing sequence)。構(gòu)架序列可用于各種目的，如用于反標(biāo)簽的退火區(qū)域和/或用作提供相關(guān)反應(yīng)物已反應(yīng)的合成歷史的時(shí)間點(diǎn)信息的序列。
密碼子和反應(yīng)物的身份之間的相關(guān)可根據(jù)所需輸出而變化。在某些實(shí)施方案中，密碼子用于編碼幾種不同的反應(yīng)物。在隨后的鑒定步驟中，展示分子的結(jié)構(gòu)可根據(jù)對(duì)不同的連接化學(xué)，位阻，正交保護(hù)基團(tuán)(orthogonal protection groups)的去保護(hù)，等的知識(shí)而推斷。在另一實(shí)施方案中，同一密碼子用于具有共性，如親油性質(zhì)，分子量，某些連接化學(xué)，等的一組反應(yīng)物。但在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，密碼子是獨(dú)特的，即核苷酸的類似組合不標(biāo)識(shí)另一反應(yīng)物。在實(shí)際方案中，對(duì)于特定反應(yīng)物，僅使用核苷酸的單個(gè)組合。在本發(fā)明的一些方面，可針對(duì)相同的反應(yīng)物有利地使用幾種不同的密碼子。兩種或多種標(biāo)識(shí)相同反應(yīng)物的密碼子可攜帶有關(guān)不同的反應(yīng)條件的其它信息。在本發(fā)明的另一方面，單個(gè)密碼子指定兩種或多種反應(yīng)物。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，每種雙功能復(fù)合物通過同時(shí)或順序標(biāo)記和反應(yīng)物反應(yīng)而制成，如以下方案所說明x-X—→ax-XA—→1ax-XA1大寫字母表示反應(yīng)物或化學(xué)反應(yīng)部位。小寫字母表示標(biāo)簽。
支架“X”連接至標(biāo)簽“x”上。反應(yīng)物連接至“X”上，如“A”，并連接針對(duì)該片段的標(biāo)簽，如“a”。合適地，標(biāo)簽是獨(dú)特的。
最終形成的雙功能復(fù)合物的編碼部分包含所有的密碼子。每個(gè)密碼子的序列用于破譯已參與形成展示分子，即反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)物的結(jié)構(gòu)。密碼子的順序也可用于確定反應(yīng)物的引入順序。這在形成線性聚合物時(shí)可具有特殊的意義，因?yàn)榫酆衔锏臏?zhǔn)確序列可通過解碼該編碼序列而確定。通常，為了有助于解碼步驟，恒定或結(jié)合區(qū)域與密碼子一起被轉(zhuǎn)移至雙功能復(fù)合物上。該恒定區(qū)域可包含有關(guān)所相關(guān)的反應(yīng)物在展示分子的合成路徑中的位置的信息。
本發(fā)明還涉及一種用于鑒定具有預(yù)選性能的展示分子的方法，包括步驟將根據(jù)上述方法制成的庫經(jīng)受一種條件，其中具有預(yù)定性能的展示分子或展示分子的子集與該庫的剩余部分分開，和通過解碼復(fù)合物的編碼部分而鑒定具有預(yù)選功能的展示分子。
一般稱作選擇的以上方法包括，將庫經(jīng)受一種條件以選擇具有對(duì)該條件起反應(yīng)的性能的展示分子。該條件可包括該庫暴露于靶。具有對(duì)該靶的親和性的雙功能復(fù)合物可通過去除非結(jié)合復(fù)合物和隨后在更嚴(yán)格的條件下洗脫已結(jié)合到靶上的復(fù)合物而與該庫的剩余部分分開?；蛘?，雙功能復(fù)合物的編碼部分可在去除非結(jié)合復(fù)合物之后從展示分子上切離并可將編碼部分回收和解碼以鑒定展示分子。
可針對(duì)特定靶進(jìn)行單輪或幾輪選擇，隨后擴(kuò)增所選的變型。所得的這些變型隨后在合適的分析中分開測試。選擇條件可以是嚴(yán)格的和特異的以在一輪選擇中得到結(jié)合分子?？捎欣厥褂脝屋嗊x擇進(jìn)行該方法，因?yàn)榭赡艿慕Y(jié)合物的數(shù)目或多樣性與其中可能損失潛在結(jié)合物的使用更多選擇的方法相比而言較大。在另一實(shí)施方案中，選擇程序包括使用日益嚴(yán)格的條件進(jìn)行幾輪選擇。在每次選擇之間，可有益地?cái)U(kuò)增所選的復(fù)合物。
編碼部分可通過使用產(chǎn)生兩個(gè)獨(dú)特的切割位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這些切割位點(diǎn)可通過克隆到適用于測序的載體中而用于編碼區(qū)域的多聚化。該方案能夠?qū)υS多編碼區(qū)域同時(shí)測序。或者，PCR產(chǎn)物使用例如TA克隆而被直接克隆到合適的載體中。在另一方案中，展示分子的身份通過將PCR產(chǎn)物應(yīng)用于合適的微陣列而確立。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員完全能夠構(gòu)建寡核苷酸的所需設(shè)計(jì)。如果需要特定退火溫度，那么建議合適的核酸單體的組成和其長度是標(biāo)準(zhǔn)步驟。合適設(shè)計(jì)的構(gòu)建可通過軟件，如Vector NTI Suite或因特網(wǎng)地址http//www.nwfsc.noaa.gov/protocols/oligoTMcalc.html上的公眾數(shù)據(jù)庫而輔助。兩種寡核苷酸能夠雜交的條件受許多因素的影響，包括溫度，鹽濃度，緩沖劑的種類，和酸度。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員完全能夠選擇合適的條件以確保兩種寡核苷酸之間的接觸在雜交條件下進(jìn)行。兩種單鏈寡核苷酸形成雙螺旋時(shí)的溫度被稱作退火溫度或融解溫度。融解曲線通常是不尖銳的，表明退火在一溫度范圍內(nèi)發(fā)生。
本發(fā)明可按照兩種基本模式進(jìn)行。第一模式使用這樣的反應(yīng)物，其中密碼子或反密碼子共價(jià)連接至其所要標(biāo)識(shí)的功能實(shí)體上。第二模式使用不共價(jià)連接到密碼子或反密碼子上的反應(yīng)物。標(biāo)簽通過與反應(yīng)物分開的實(shí)體被提供在雙功能復(fù)合物的引發(fā)部位上。如果進(jìn)行一輪以上，第一和第二模式可按照任何順序結(jié)合。如果要生成不同的雙功能復(fù)合物的庫，那么兩種模式按照兩種不同的方案進(jìn)行。使用第一模式制成的庫可在單個(gè)容器中進(jìn)行，這在本文中稱作一罐合成，而根據(jù)第二模式制成的庫需要分開-和-混合合成，即針對(duì)每種復(fù)合物反應(yīng)和標(biāo)簽加入必須在不同的隔室中進(jìn)行。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在涉及兩種或多種反應(yīng)物和化學(xué)反應(yīng)部位的反應(yīng)之前或之后，提供一種或多種分別編碼該兩種或多種反應(yīng)物的標(biāo)簽。
模式1本發(fā)明在第一模式中涉及一種用于編碼被轉(zhuǎn)移至雙功能復(fù)合物上的化學(xué)實(shí)體的身份的方法，所述方法包括步驟a)提供包含反應(yīng)基團(tuán)和寡核苷酸標(biāo)識(shí)符區(qū)域的新生雙功能復(fù)合物，b)提供包含對(duì)標(biāo)識(shí)符區(qū)域足夠互補(bǔ)從而允許雜交的寡核苷酸，可轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體，和標(biāo)識(shí)該功能實(shí)體的反密碼子的構(gòu)件，c)將新生雙功能復(fù)合物和構(gòu)件在雜交條件下混合形成雜交產(chǎn)物，d)通過涉及新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)基團(tuán)的反應(yīng)將構(gòu)件的功能實(shí)體轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上，和e)酶促延伸該寡核苷酸標(biāo)識(shí)符區(qū)域，以得到連接到已接收該化學(xué)實(shí)體的雙功能復(fù)合物上的密碼子。
本發(fā)明方法包括為被轉(zhuǎn)移至復(fù)合物上的功能實(shí)體引入密碼子。密碼子的引入通過使用合適的酶，即對(duì)核酸有活性的酶在構(gòu)件的反密碼子上延伸而進(jìn)行。編碼區(qū)域的轉(zhuǎn)錄可通過酶，如聚合酶或連接酶而進(jìn)行。一般來說優(yōu)選使用對(duì)底物和最終產(chǎn)物特異性的酶，這樣盡可能精確地轉(zhuǎn)錄反密碼子。高度的特異性一般為核酸活性酶可得到，因?yàn)榉翘禺惢钚钥善茐幕罴?xì)胞存活的能力。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的酶是具有校正活性以用于精確編碼但保存上游核酸堿基的聚合酶。
酶延伸可在功能實(shí)體轉(zhuǎn)移之后或同時(shí)或甚至在轉(zhuǎn)移之前進(jìn)行。但一般優(yōu)選在轉(zhuǎn)移步驟之后進(jìn)行延伸步驟，這樣避免酶和功能實(shí)體之間的任何可能相互作用。
因?yàn)槊竷H當(dāng)標(biāo)識(shí)符區(qū)域和互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域已相互雜交形成雙螺旋時(shí)進(jìn)行延伸，所以確保功能實(shí)體和反應(yīng)基團(tuán)在給該復(fù)合物提供密碼子時(shí)緊密靠近。與以前所建議的雜交方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，通過非定向反應(yīng)而提供功能實(shí)體的復(fù)合物不會(huì)被提供以密碼子。因此，假陽性分子可由于不存在密碼子而容易被檢測。
本發(fā)明還涉及一種用于得到由展示分子部分和編碼部分組成的雙功能復(fù)合物的方法，其中用于編碼被轉(zhuǎn)移至雙功能復(fù)合物上的化學(xué)實(shí)體的身份的方法進(jìn)一步包括步驟f)分開雜交產(chǎn)物的組成部分和回收該復(fù)合物。
本發(fā)明可通過僅將單個(gè)功能實(shí)體和相應(yīng)的密碼子轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上而進(jìn)行。但一般來說，優(yōu)選構(gòu)建由兩個(gè)或多個(gè)功能實(shí)體組成的展示分子。因此，在本發(fā)明優(yōu)選方面，提供了一種用于得到由展示分子部分和編碼部分組成的雙功能復(fù)合物的方法，所述展示分子部分是功能實(shí)體和起始復(fù)合物的反應(yīng)基團(tuán)的反應(yīng)產(chǎn)物，其中步驟c)至f)適當(dāng)?shù)刂貜?fù)。在制備雙功能復(fù)合物的最終周期中，步驟f)可省去，尤其是在其中得到雙鏈標(biāo)識(shí)符寡核苷酸的情況下，因?yàn)殡p鏈核酸通常比相應(yīng)的單鏈寡核苷酸更穩(wěn)定。標(biāo)識(shí)符寡核苷酸也可通過延伸過程而變成雙鏈，其中引物被退火至該寡核苷酸的3’端和使用合適的聚合酶延伸。雙鏈性在隨后選擇過程中可能是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)閱捂満怂峥砂凑找环N類似于aptamers的方式進(jìn)行與生物學(xué)靶的相互作用。在周期的重復(fù)過程中，以前周期中的所得雙功能復(fù)合物，即已接收功能實(shí)體和密碼子的新生雙功能復(fù)合物，在功能實(shí)體轉(zhuǎn)移和密碼子引入的下一周期中用作新生雙功能復(fù)合物。
根據(jù)本方法使用的寡核苷酸具有合理的長度。因此，一般避免在已有技術(shù)(在WO 00/23458中，建議使用至少220和優(yōu)選420個(gè)核苷酸的寡核苷酸)中建議的長預(yù)制模板。
本發(fā)明還涉及一種用于產(chǎn)生雙功能復(fù)合物庫的方法，包括步驟a)提供一種或多種不同的包含反應(yīng)基團(tuán)和寡核苷酸標(biāo)識(shí)符區(qū)域的新生雙功能復(fù)合物，b)提供每個(gè)構(gòu)件包含與標(biāo)識(shí)符區(qū)域足夠互補(bǔ)從而允許雜交的寡苷酸，可轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體，和標(biāo)識(shí)該功能實(shí)體的反密碼子的多個(gè)不同的構(gòu)件，c)將新生雙功能復(fù)合物和多個(gè)構(gòu)件在雜交條件下混合以形成雜交產(chǎn)物，d)通過涉及新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)基團(tuán)的反應(yīng)將構(gòu)件的功能實(shí)體轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上，e)酶促延伸該寡核苷酸標(biāo)識(shí)符區(qū)域，以得到連接到已接收該化學(xué)實(shí)體的雙功能復(fù)合物上的密碼子，f)分開雜交產(chǎn)物的組分和回收復(fù)合物，g)適當(dāng)?shù)刂貜?fù)步驟c)至f)一次或多次。
與已有技術(shù)中所建議的雜交技術(shù)有關(guān)的缺點(diǎn)在考慮形成庫時(shí)變得明顯。即使兩種雙鏈寡核苷酸具有相同數(shù)目的核苷酸，也決不能確保它們具有相同的融解溫度。這至少部分由于，不同的堿基對(duì)涉及不同數(shù)目的氫鍵(C-G對(duì)涉及三個(gè)氫鍵和A-T堿基對(duì)涉及兩個(gè)氫鍵)。因此，確立用于將各種構(gòu)件退火至模板的溫度要兼顧避免錯(cuò)配和確保足夠的退火。本發(fā)明意欲通過在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中提供對(duì)所有構(gòu)件具有類似親和性的標(biāo)識(shí)符區(qū)域而避免該缺點(diǎn)。
如果使用一個(gè)以上的標(biāo)識(shí)符序列，如在存在一種以上的反應(yīng)基團(tuán)或支架時(shí)，構(gòu)件有時(shí)可被錯(cuò)退火至其上。但轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體實(shí)際上通過延伸過程被正確地編碼在復(fù)合物上。該方案類似于自然中使用的安排在DNA水平上允許堿基錯(cuò)誤摻入(與構(gòu)件的錯(cuò)配退火相比)，得到多樣性，但堅(jiān)持對(duì)表型的正確編碼(與復(fù)合物上的正確密碼子的延伸相比)。
標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件之間的退火可以是隨機(jī)過程或通過標(biāo)識(shí)符區(qū)域和互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域中的序列而引導(dǎo)。隨機(jī)過程可通過在所有的標(biāo)識(shí)符區(qū)域和互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域中使用相同的序列而實(shí)現(xiàn)。因此標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件的混合物隨機(jī)或半隨機(jī)地退火并得到功能實(shí)體的獨(dú)特組合?；蛘撸S機(jī)或半隨機(jī)過程可通過在與標(biāo)識(shí)符核酸堿基相對(duì)的構(gòu)件位置上使用通用堿基而實(shí)現(xiàn)，其中所述標(biāo)識(shí)符核酸堿基編碼特定支架或反應(yīng)基團(tuán)的身份。標(biāo)識(shí)符寡核苷酸和構(gòu)件寡核苷酸的序列可被優(yōu)化以確保退火過程涉及的庫中的序列以相等的退火程度組裝，而與連接到構(gòu)件上的功能實(shí)體無關(guān)。因此，在選擇步驟中沒有或較少有由于特定構(gòu)件的不同的退火性能產(chǎn)生的偏差。另外，在每個(gè)退火步驟中和針對(duì)庫中的每種雜交產(chǎn)物的退火過程類似性可確保為反應(yīng)基團(tuán)/支架同等地提供功能實(shí)體。這樣提供用于轉(zhuǎn)移步驟的最佳條件。
新生雙功能復(fù)合物包含寡核苷酸標(biāo)識(shí)符區(qū)域和反應(yīng)基團(tuán)。反應(yīng)基團(tuán)可通過可斷裂的接頭連接至寡核苷酸上，允許最終反應(yīng)產(chǎn)物與寡核苷酸分離?？纱嬖趩蝹€(gè)反應(yīng)基團(tuán)或多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)可作為支架的一部分而存在。支架可通過可斷裂的接頭連接到寡核苷酸，這樣能夠隨后分離反應(yīng)過的支架。反應(yīng)基團(tuán)可選自任何能夠接受功能實(shí)體的基團(tuán)。合適的反應(yīng)基團(tuán)的例子包括胺，羧酸，硫(thio)，和羥基基團(tuán)。另外，新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)基團(tuán)可以是在開始本發(fā)明的方法之前必需被活化的前形。新生雙功能復(fù)合物也被稱作生長中的復(fù)合物和表示要根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)一步處理的起始或中間復(fù)合物。
標(biāo)識(shí)符分子的標(biāo)識(shí)符區(qū)域中的核苷酸數(shù)根據(jù)標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件之間的退火的強(qiáng)度和特異性而確定。較強(qiáng)的和更特異的退火過程一般使用較長的核苷酸序列而得到。通常約10-20個(gè)核苷酸足以實(shí)現(xiàn)特異和有效的退火。但在本發(fā)明的一些方面，該范圍可以是2-1000，最優(yōu)選15-30個(gè)核苷酸。
標(biāo)識(shí)符區(qū)域可在某些實(shí)施方案中包含有關(guān)新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)基團(tuán)或支架的身份的信息。這些支架密碼子的位置一般遠(yuǎn)離支架，這樣允許在包含所要轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體和支架的部分形成穩(wěn)定的雙螺旋。支架密碼子可具有任何長度，但一般選擇為與規(guī)定功能實(shí)體的密碼子相同的長度。標(biāo)識(shí)符區(qū)域的后部一般提供有恒定或結(jié)合序列。結(jié)合序列在被退火至構(gòu)件的合適部分上時(shí)提供酶進(jìn)行延伸的底物。
構(gòu)件包含與至少一部分標(biāo)識(shí)符區(qū)域足夠互補(bǔ)從而允許雜交的寡核苷酸。構(gòu)件的寡核苷酸可不完全與標(biāo)識(shí)符互補(bǔ)，即，可允許一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配，但必須確保構(gòu)件能夠退火至標(biāo)識(shí)符區(qū)域上。為簡便起見，構(gòu)件寡核苷酸的能夠退火至標(biāo)識(shí)符上的部分被稱作互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域。在本說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語雜交要理解為將兩個(gè)單鏈寡核苷酸相互附著使得形成雜交產(chǎn)物的過程。
構(gòu)件還包含由寡核苷酸組成的反密碼子區(qū)域。反密碼子標(biāo)識(shí)構(gòu)件的功能實(shí)體的身份。在某些實(shí)施方案中，相同的反密碼子用于編碼幾種不同的功能實(shí)體。在隨后鑒定步驟中，展示分子的結(jié)構(gòu)可根據(jù)對(duì)不同的連接化學(xué)，位阻，正交保護(hù)基團(tuán)的去保護(hù)，等的認(rèn)識(shí)而推斷。在另一實(shí)施方案中，同一反密碼子用于具有共性，如親油性質(zhì)，某些連接化學(xué)，等的一組功能實(shí)體。但在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反密碼子是獨(dú)特的，即核苷酸的類似組合不出現(xiàn)在攜帶另一功能實(shí)體的另一構(gòu)件上。在實(shí)際方案中，對(duì)于特定功能實(shí)體，僅使用核苷酸的單個(gè)組合。在本發(fā)明的一些方面，可有利地為相同的功能實(shí)體使用幾種反密碼子，其方式非常類似于自然界為單個(gè)氨基酸使用最高六個(gè)不同的反密碼子。兩種或多種標(biāo)識(shí)相同的功能實(shí)體的反密碼子可攜帶有關(guān)不同的反應(yīng)條件的更多信息。
各個(gè)反密碼子與庫中的另一反密碼子的區(qū)別可僅在于單個(gè)核苷酸。但為了有助于隨后解碼過程，一般最好在特定的反密碼子和出現(xiàn)在各種構(gòu)件上的任何其它反密碼子之間存在兩個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配。例如，如果選擇5個(gè)核苷酸的密碼子/反密碼子長度，那么存在100個(gè)以上的核苷酸組合，其中出現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配。對(duì)于密碼子中的一定數(shù)目的核苷酸，一般希望優(yōu)化特定密碼子/反密碼子相對(duì)于出現(xiàn)在該庫中的任何其它密碼子/反密碼子的錯(cuò)配數(shù)。
功能實(shí)體與互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域的偶聯(lián)可使用合適的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行。本領(lǐng)域已知的這些反應(yīng)的任何偶聯(lián)反應(yīng)或組合可適當(dāng)?shù)厥褂?，這是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所容易認(rèn)識(shí)。連接至互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域上的功能實(shí)體為優(yōu)選包含至少一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)從而允許鍵接至標(biāo)識(shí)符的反應(yīng)基團(tuán)上的分子。
反密碼子的序列標(biāo)識(shí)連接在相同的構(gòu)件中的功能實(shí)體。該反密碼子序列直接包括在構(gòu)件序列中或例如使用聚合酶或連接酶連接到預(yù)先存在的構(gòu)件上。在例如詳細(xì)公開于實(shí)施例7的某些實(shí)施方案中，在實(shí)施例中被稱作載體oligo的互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域最初用各種功能實(shí)體加載。每個(gè)加載的載體oligo隨后使用夾板oligo(splint oligo)連接至反密碼子oligo上以組裝這兩個(gè)寡核苷酸。連接反應(yīng)用于將所要轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體與指定功能實(shí)體的結(jié)構(gòu)的反密碼子連接。反密碼子oligo可按照各種方式設(shè)計(jì)。通常，允許夾板退火的區(qū)域被包括在該設(shè)計(jì)中。但一些連接酶如T4RNA連接酶無需雙鏈DNA的區(qū)段。因此，夾板和退火至夾板上的反密碼子oligo的部分可在一些實(shí)施方案中可被省去。如果標(biāo)識(shí)符區(qū)域包含編碼支架的身份的密碼子，那么反密碼子oligo包含一串通用堿基，如次黃嘌呤核苷。如果與標(biāo)識(shí)符區(qū)域上的結(jié)合區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域被包括在下游，那么通用堿可被省去。后一實(shí)施方案通常要求一部分標(biāo)識(shí)符環(huán)出?；パa(bǔ)性結(jié)合區(qū)域通常被選擇使得聚合酶能夠識(shí)別與新生雙功能分子的結(jié)合區(qū)域所形成的雙螺旋作為底物。反密碼子合適地位于互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域的5’側(cè)，這樣它可通過延伸反應(yīng)被轉(zhuǎn)移至新生復(fù)合物上。合適地，設(shè)計(jì)互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域使得可鑒別出現(xiàn)在最后雙功能復(fù)合物上的密碼子序列中的特定密碼子的位置。
反密碼子序列通過延伸過程被轉(zhuǎn)錄至標(biāo)識(shí)符以形成在標(biāo)識(shí)符分子上的密碼子。這可通過本領(lǐng)域任何方法而進(jìn)行，包括，但不限于，聚合酶延伸反應(yīng)。聚合酶延伸反應(yīng)通常需要在合適的緩沖劑中存在足夠的聚合酶活性以及四種天然核苷酸三磷酸(ATP，CTP，GTP，和TTP)中的每一種。因此，當(dāng)構(gòu)件和標(biāo)識(shí)符分子已退火并在功能實(shí)體和接受性反應(yīng)基團(tuán)之間進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，特定反密碼子的序列僅被轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符上作為密碼子。
四種天然核苷酸可編碼4N變型，其中N是密碼子的長度。例如，如果獨(dú)特密碼子是5個(gè)核苷酸的長度，那么用于不同的功能實(shí)體的可能編碼的數(shù)目是1024。密碼子也可在每個(gè)位置上使用四種天然核苷酸的子集而設(shè)計(jì)。這可有利地與通用核酸堿基結(jié)合使用。每個(gè)構(gòu)件中的反密碼子為相同的構(gòu)件中的功能實(shí)體編碼。該序列在本發(fā)明的一個(gè)方面可通過利用功能實(shí)體引物和反密碼子引物的互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域的PCR而引入。
構(gòu)件的功能實(shí)體所起的作用是用作最終被引入展示分子中的結(jié)構(gòu)實(shí)體的前體。因此，在本申請和權(quán)利要求書中，如果敘述到功能實(shí)體被轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上，這要理解為未必該原始功能實(shí)體的所有原子會(huì)出現(xiàn)在最終形成的展示分子中。另外，由于該連接所涉及的反應(yīng)，功能實(shí)體的結(jié)構(gòu)可在它出現(xiàn)在新生展示分子上時(shí)被改變。尤其，導(dǎo)致釋放功能實(shí)體的斷裂作用可產(chǎn)生在隨后步驟中可參與形成新生展示分子和功能實(shí)體之間連接的反應(yīng)基團(tuán)。
構(gòu)件的功能實(shí)體優(yōu)選包含至少一個(gè)能夠參與反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)，該反應(yīng)導(dǎo)致構(gòu)件的功能實(shí)體和攜帶反應(yīng)基團(tuán)的標(biāo)識(shí)符之間的連接。出現(xiàn)在功能實(shí)體上的反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目合適地是1至10。以僅一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)為特征的功能實(shí)體用于例如聚合物或支架的末端位置，而具有兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的功能實(shí)體適用于形成能夠進(jìn)一步反應(yīng)的聚合物或支架的體部分。意欲用于形成連接的兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)通常存在于支架上。支架是核心結(jié)構(gòu)，構(gòu)成用于產(chǎn)生多個(gè)變型的基礎(chǔ)。支架的變型形式通常通過支架的反應(yīng)基團(tuán)與其它功能實(shí)體的反應(yīng)基團(tuán)，任選地在填入基團(tuán)或催化劑的媒介下反應(yīng)而形成。所要連接至支架上的功能實(shí)體可包含一個(gè)，兩個(gè)或幾個(gè)能夠形成連接的反應(yīng)基團(tuán)。支架的例子包括甾族，hydantions，苯并二氮雜_，等。
構(gòu)件的反應(yīng)基團(tuán)可以能夠形成與標(biāo)識(shí)符的反應(yīng)基團(tuán)的直接連接或構(gòu)件的反應(yīng)基團(tuán)可以能夠通過橋接填入基團(tuán)而形成與標(biāo)識(shí)符的反應(yīng)基團(tuán)的連接?？梢岳斫?，不是反應(yīng)基團(tuán)的所有原子必需保持在所形成的連接中。相反，反應(yīng)基團(tuán)要被認(rèn)為是用于該連接結(jié)構(gòu)的前體。
在形成連接之后或同時(shí)，進(jìn)行斷裂以使功能實(shí)體轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符上。斷裂可按照任何合適的方式進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)方面，斷裂包括試劑或和酶的使用。斷裂導(dǎo)致功能實(shí)體轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上或?qū)е聫?fù)合物轉(zhuǎn)移至構(gòu)件的功能實(shí)體上。在某些情況下，可有利地通過接頭斷裂而引入新化學(xué)基團(tuán)。新化學(xué)基團(tuán)可用于在隨后周期中，直接或在已被活化之后進(jìn)一步反應(yīng)。在其它情況下，最好在斷裂之后沒有留下接頭的痕跡(trace)。
另一方面，連接和斷裂作為同時(shí)反應(yīng)而進(jìn)行，即構(gòu)件的功能實(shí)體或新生展示分子是該反應(yīng)的離去基團(tuán)。在本發(fā)明的一些方面，優(yōu)選設(shè)計(jì)該體系使得連接和斷裂同時(shí)發(fā)生，因?yàn)檫@樣可減少步驟數(shù)和復(fù)雜性。同時(shí)連接和斷裂也可設(shè)計(jì)使得沒有留下接頭的痕跡或使得用于進(jìn)一步反應(yīng)的新化學(xué)基團(tuán)被引入，如上所述。在本發(fā)明其它方面，優(yōu)選進(jìn)行分開的交聯(lián)和斷裂步驟，因?yàn)橹鸩椒桨改軌蚩刂泼總€(gè)子步驟并能夠減少非特異性轉(zhuǎn)移的可能性。
優(yōu)選，至少一個(gè)接頭在斷裂步驟之后保持完整。該至少一個(gè)接頭將新生展示分子連接至編碼區(qū)域上。如果該方法基本上包括功能實(shí)體至支架或正形成的聚合物上的轉(zhuǎn)移，那么最終支架上的分子或聚合物可與可選擇性地?cái)嗔训慕宇^連接?？蛇x擇性地?cái)嗔训慕宇^設(shè)計(jì)使得它在導(dǎo)致功能實(shí)體轉(zhuǎn)移至新生模板引導(dǎo)的分子上的條件下不斷裂。
可斷裂的接頭可選自大量的化學(xué)結(jié)構(gòu)。接頭的例子包括，但不限于此，具有酶斷裂位點(diǎn)的接頭，包含化學(xué)可降解組分的接頭，和可通過電磁輻射而斷裂的接頭。特別有意義的可斷裂的接頭目前是可通過光斷裂的接頭。合適的實(shí)施例包括位于展示分子和標(biāo)識(shí)符區(qū)域之間的o-硝基芐基基團(tuán)。
用于根據(jù)本發(fā)明的方法使用的構(gòu)件可按照該構(gòu)件所涉及的特定實(shí)體而設(shè)計(jì)。例如，反密碼子可用聚乙二醇(PEG)接頭連接到互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域上且功能實(shí)體可直接連接到所述互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域上。在另一和優(yōu)選的實(shí)施例中，反密碼子、互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域和功能實(shí)體是鄰接的線性寡核苷酸。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，構(gòu)件設(shè)計(jì)使得一部分標(biāo)識(shí)符環(huán)出。常常發(fā)生標(biāo)識(shí)符的環(huán)出，因?yàn)闃?gòu)件oligo不退火至整個(gè)長度的標(biāo)識(shí)符上。通常，構(gòu)件設(shè)計(jì)使得它能夠退火至雙功能復(fù)合物的至少標(biāo)識(shí)符區(qū)域上和標(biāo)識(shí)符后面部分的結(jié)合區(qū)域上?；パa(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域和反密碼子可通過單個(gè)鍵直接連接，通過合適的長度的PEG接頭，或核酸堿基序列而連接，其中所述核酸堿基序列可或可不包含與標(biāo)識(shí)符上的各種密碼子和結(jié)合區(qū)域互補(bǔ)的核酸堿基。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，構(gòu)件被設(shè)計(jì)成僅退火至結(jié)合區(qū)域上，通常在與已連接展示分子的末端相對(duì)的標(biāo)識(shí)符末端。在本發(fā)明的一個(gè)方面，構(gòu)件和/或新生標(biāo)識(shí)符由兩個(gè)或多個(gè)能夠相互雜交以形成雜交復(fù)合物的單獨(dú)的核苷酸組成。寡核苷酸之間的間隙可使用合適的酶活性，如聚合酶和連接酶填充以合適的核苷酸，得到連貫的標(biāo)識(shí)符和/或構(gòu)件。
功能實(shí)體與互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域的連接通常通過接頭而進(jìn)行。優(yōu)選接頭將功能實(shí)體與互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域在末端核苷酸或寡核苷酸下游一個(gè)或兩個(gè)核苷酸的核苷酸處連接。功能實(shí)體的連接可處于任何可用于連接的實(shí)體上，即功能實(shí)體可連接到寡核苷酸的核苷酸的核酸堿基上，或主鏈上。一般來說，優(yōu)選在核苷酸間鍵的磷上或在核酸堿基上連接功能實(shí)體。
在本發(fā)明的某些方面，功能實(shí)體的反應(yīng)基團(tuán)連接到接頭寡核苷酸上。反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選能夠通過相應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)之間的直接反應(yīng)或通過使用合適的填入基團(tuán)而產(chǎn)生與新生展示分子的連接。將功能實(shí)體與接頭偶聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選在建立連接的同時(shí)被斷裂。功能實(shí)體在一些情況下可包含能夠在隨后周期中涉及形成連接的第二反應(yīng)基團(tuán)。第二反應(yīng)基團(tuán)可在它能夠參與形成連接之前需要活化。
如果兩個(gè)或多個(gè)功能實(shí)體要被轉(zhuǎn)移至復(fù)合物上，密碼子可被恒定區(qū)域或結(jié)合區(qū)域分開。結(jié)合區(qū)域的一個(gè)功能可以是確立一個(gè)聚合酶可在其上結(jié)合的平臺(tái)。根據(jù)所形成的被編碼分子，標(biāo)識(shí)符可包含其它的密碼子，如3，4，5，或更多的密碼子。其它密碼子每一個(gè)可通過合適的結(jié)合區(qū)域而分開。優(yōu)選，標(biāo)識(shí)符的所有的或至少大多數(shù)的密碼子通過結(jié)合序列與相鄰密碼子分開。結(jié)合區(qū)域可具有任何合適數(shù)目的核苷酸，如1至20個(gè)。
除了用作酶的底物，結(jié)合區(qū)域(如果有的話)可用于各種目的。在本發(fā)明的一種設(shè)置中，結(jié)合區(qū)域標(biāo)識(shí)密碼子的位置。通常，在密碼子的上游或下游的結(jié)合區(qū)域包含允許確定密碼子的位置的信息。在另一設(shè)置中，結(jié)合區(qū)域具有交替序列(alternating sequences)，允許在形成庫時(shí)由兩個(gè)池(pool)加入構(gòu)件。另外，結(jié)合區(qū)域可調(diào)節(jié)退火溫度至所需水平。
具有高親和性的結(jié)合區(qū)域可通過引入一個(gè)或多個(gè)與相關(guān)核酸堿基形成三個(gè)氫鍵的核酸堿基而提供。具有該性能的核酸堿基的例子是鳥嘌呤和胞嘧啶。作為替代方案，或在此之外，結(jié)合區(qū)域可經(jīng)受主鏈修飾。幾種主鏈修飾提供較高親和性，如核糖部分的2’-O-甲基取代，肽核酸(PNA)，和也被稱作LNA(鎖定的核酸)的核糖部分的2’-4’O-亞甲基環(huán)化。
標(biāo)識(shí)符可包含在密碼子周圍的側(cè)翼區(qū)域。側(cè)翼區(qū)域可包括信號(hào)基團(tuán)，如熒光團(tuán)或放射性活性基團(tuán)從而能夠檢測復(fù)合物的存在或不存在或側(cè)翼區(qū)域可包含可被檢測的標(biāo)記，如生物素。如果標(biāo)識(shí)符包含生物素部分，標(biāo)識(shí)符可容易被回收。
側(cè)翼區(qū)域也可用作擴(kuò)增反應(yīng)，如PCR的引發(fā)部位。通常，在形成雙功能復(fù)合物的最后周期包括引發(fā)部位的引入。雙功能復(fù)合物的標(biāo)識(shí)符區(qū)域通常用作另一引發(fā)部位，這樣允許對(duì)雙功能復(fù)合物的編碼區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
可以理解，當(dāng)術(shù)語標(biāo)識(shí)符用于本說明書和權(quán)利要求書時(shí)，標(biāo)識(shí)符可以是有義或反義形式，即標(biāo)識(shí)符可包含實(shí)際編碼該分子的密碼子的序列或可以是與其互補(bǔ)的序列。另外，標(biāo)識(shí)符可根據(jù)需要是單鏈或雙鏈的。
一般在活性反密碼子之前包含一個(gè)或多個(gè)反密碼子的那部分互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域或構(gòu)件寡核苷酸的設(shè)計(jì)可以是隨機(jī)或半隨機(jī)的且可允許與標(biāo)識(shí)符區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配。但尤其是當(dāng)考慮庫時(shí)，可有利地在與前面的密碼子互補(bǔ)的區(qū)域中引入一個(gè)或多個(gè)非特異堿基配對(duì)的核酸堿基。非特異堿基配對(duì)的核酸堿基是當(dāng)連接到主鏈上時(shí)能夠與五種自然存在的核酸堿基(C，T，G，A，和U)中的至少兩種配對(duì)的堿基。優(yōu)選，此兩種或多種天然核酸堿基和該非特異性堿基配對(duì)的核酸堿基之間的堿基配對(duì)基本上等能量地發(fā)生，即所形成的鍵具有同數(shù)量級(jí)的強(qiáng)度。術(shù)語“非特異性堿基配對(duì)的核酸堿基”在本文中可與術(shù)語“通用堿基”互換使用。
在天然tRNA中，存在核酸堿基次黃嘌呤核苷。次黃嘌呤核苷具有與三種核酸堿基，即胞嘧啶，胸腺嘧啶，和腺嘌呤非特異性雜交的能力。以下描述次黃嘌呤核苷和具有與天然核酸堿基非特異性堿基配對(duì)的相同能力的其它合成化合物的例子通用堿基的例子次黃苷5-硝基吲哚 3-硝基吡咯 N8-8氮雜-7脫氮腺嘌呤 MICS 5MICS PIM dP dK 水粉蕈素通用堿基在本方法中的使用在生成庫方面具有優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)橐郧稗D(zhuǎn)移的密碼子的核酸堿基可與構(gòu)件的互補(bǔ)區(qū)上的通用堿基匹配。用過的密碼子與通用堿基序列的互補(bǔ)使得相同的構(gòu)件能夠用于各種正生長的雙功能復(fù)合物。
通過延伸原理的編碼也可使用三鏈程序進(jìn)行。每個(gè)步驟涉及被雜交至功能實(shí)體載體上的組裝平臺(tái)分子庫(圖7)。組裝平臺(tái)包含通過標(biāo)識(shí)符區(qū)域同樣地結(jié)合所有的或子集的標(biāo)識(shí)符分子的固定序列(互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域)?；蛘?，該互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符序列也可以是隨機(jī)或半隨機(jī)的以增加該庫的多樣性，因?yàn)檫@樣能夠使用不同的支架分子。組裝平臺(tái)還包含具有特定序列的獨(dú)特反密碼子區(qū)域。該特定序列會(huì)退火至載體中的獨(dú)特密碼子區(qū)域，因此形成其中可轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體通過雜交被偶聯(lián)至獨(dú)特反密碼子上的構(gòu)件。獨(dú)特反密碼子和獨(dú)特反密碼子區(qū)域的序列被連接，這樣能夠在這兩個(gè)序列之間直接偶聯(lián)。該偶聯(lián)例如在合成組裝平臺(tái)時(shí)得到。
獨(dú)特反密碼子可與獨(dú)特反密碼子區(qū)域相同或可以是更短或更長的序列。但先決條件是，這兩個(gè)序列(獨(dú)特反密碼子和獨(dú)特反密碼子區(qū)域)例如通過互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域和可有可無的連接區(qū)域而相互連接。獨(dú)特反密碼子的序列可用于獨(dú)特反密碼子區(qū)域的解碼。這樣得到為功能實(shí)體編碼的獨(dú)特密碼子區(qū)域。連接區(qū)域任選地是一種可變化以在功能實(shí)體和連接實(shí)體(attachment entity)之間得到最佳反應(yīng)性的序列。如果聚合物使用該體系而產(chǎn)生，那么連接區(qū)域可通過裝配周期而延伸。
標(biāo)識(shí)符展示的分子通過三鏈裝配原理的形成在順序步驟中進(jìn)行。各個(gè)單個(gè)步驟包括將載體和標(biāo)識(shí)符分子退火至組裝平臺(tái)上。在退火步驟之后，進(jìn)行兩個(gè)重要的事情1)連接實(shí)體和功能實(shí)體之間反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)功能實(shí)體至標(biāo)識(shí)符分子上的轉(zhuǎn)移，和2)使用組裝平臺(tái)上的獨(dú)特反密碼子序列作為讀取序列將獨(dú)特密碼子序列延伸到標(biāo)識(shí)符分子中。
按照本發(fā)明的雙功能復(fù)合物庫的形成可使用平臺(tái)分子的固體支持物而進(jìn)行，如圖9和10所示。這樣允許順序轉(zhuǎn)移，其中取決于特定步驟不同地加入非編碼區(qū)域和互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域的組裝平臺(tái)分子的每個(gè)庫被固定在單獨(dú)的小瓶中并提供標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件分子的庫。在退火-反應(yīng)/轉(zhuǎn)移-延伸步驟之后，該庫被移出(如使用升高的溫度)和被轉(zhuǎn)移至帶有固定的組裝平臺(tái)庫(具有附加的非編碼和互補(bǔ)性連接區(qū)域)的另一小瓶中從而進(jìn)行該過程的下一步驟。
模式2本發(fā)明在本發(fā)明的第二模式中公開了一種用于生成包含展示分子部分和編碼部分的雙功能復(fù)合物的方法，其中包含化學(xué)反應(yīng)部位和用于酶加入標(biāo)簽的引發(fā)部位的新生雙功能復(fù)合物在化學(xué)反應(yīng)部位與一種或多種反應(yīng)物反應(yīng)，和使用一種或多種酶在引發(fā)部位上被提供以標(biāo)識(shí)該一種或多種反應(yīng)物的各自的標(biāo)簽。
構(gòu)件的反應(yīng)性部分和編碼部分之間的共價(jià)鍵的缺少意味著，庫要通過分開-和-混合策略而制成。在第一步驟中，新生雙功能復(fù)合物被分配在一個(gè)或多個(gè)分開的隔室中并隨后暴露于在化學(xué)反應(yīng)部位上反應(yīng)的每個(gè)隔室中的反應(yīng)物，和用于在引發(fā)部位上提供標(biāo)識(shí)所述反應(yīng)物的標(biāo)簽的試劑。用于提供標(biāo)簽的試劑包括酶和其底物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，標(biāo)簽通過使用聚合酶在反密碼子上延伸而提供。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，標(biāo)簽通過具有有關(guān)反應(yīng)物身份的密碼子寡核苷酸的連接被提供在引發(fā)部位上。
如果酶是聚合酶，底物通常是選自dATP，dGTP，dTTP，dCTP，rATP，rGTP，rTTP，rCTP，rUTP的三磷酸核苷酸的共混物。用于連接酶的底物是寡聚-和多核苷酸，即包含兩個(gè)或多個(gè)核苷酸的核酸。酶連接可按照單鏈或雙鏈方式進(jìn)行。如果進(jìn)行單鏈連接，第一核酸的3’OH基團(tuán)被連接至第二核酸的5’磷酸基團(tuán)上。雙鏈連接使用與第一和第二核酸的3’端和5’端的一部分互補(bǔ)的第三寡核苷酸以幫助連接。一般，優(yōu)選進(jìn)行雙鏈連接。
在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，使用聚合酶轉(zhuǎn)錄和連接偶聯(lián)的組合。例如，在其它方面雙鏈的核酸中的間隙可用聚合酶填入且連接酶可連接延伸產(chǎn)物至上游寡核苷酸以得到完全雙鏈核酸。
模式2如上所討論的針對(duì)每種反應(yīng)在單獨(dú)的隔室中進(jìn)行。因此，加入標(biāo)簽而不競爭所存在的核酸且明顯減少交叉編碼的可能性。標(biāo)簽的酶促加入可在反應(yīng)之前，之后，或同時(shí)進(jìn)行。在本發(fā)明的一些方面，優(yōu)選將標(biāo)簽在反應(yīng)之前加入新生雙功能復(fù)合物，因?yàn)榭蓛?yōu)選應(yīng)用不同于該酶所用條件的反應(yīng)條件。一般，酶反應(yīng)在水介質(zhì)中進(jìn)行，而用于某些反應(yīng)的反應(yīng)物和化學(xué)反應(yīng)部位之間的反應(yīng)受到有機(jī)溶劑的促進(jìn)。得到適于兩種反應(yīng)的條件的合適方案是在水介質(zhì)中進(jìn)行酶反應(yīng)，凍干和隨后溶解或分散在適合在化學(xué)反應(yīng)部位上發(fā)生反應(yīng)的介質(zhì)中。在另一方案中，凍干步驟可被省去，因?yàn)楹线m的反應(yīng)條件可通過將溶劑加入水介質(zhì)中而得到。溶劑可與水介質(zhì)混溶以得到均相反應(yīng)介質(zhì)或不混溶以得到兩相介質(zhì)。
根據(jù)第二模式的反應(yīng)物可以是游離反應(yīng)物或拉鏈構(gòu)件(zipperbuilding block)。游離反應(yīng)物不連接到標(biāo)識(shí)反應(yīng)物的另一部分的密碼上。在大多數(shù)情況下，游離反應(yīng)物包括包含一個(gè)，兩個(gè)或多個(gè)可與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。拉鏈構(gòu)件是連接到化學(xué)實(shí)體上的功能實(shí)體，所述化學(xué)實(shí)體在化學(xué)反應(yīng)部位的附近結(jié)合。結(jié)合性化學(xué)實(shí)體可以是在反應(yīng)之前雜交至新生雙功能復(fù)合物的連接部分上的寡核苷酸。雜交作用會(huì)增加功能實(shí)體和化學(xué)反應(yīng)部位之間的接近度，這樣降低副反應(yīng)的可能性和由于高局部濃度而促進(jìn)反應(yīng)。
新生雙功能復(fù)合物要考慮編碼方法來構(gòu)建。因此，如果聚合酶用于編碼，雜交區(qū)域通常被提供在接頭部分。雜交區(qū)域允許包含反密碼子的互補(bǔ)性寡核苷酸的結(jié)合區(qū)域雜交至新生雙功能復(fù)合物上。結(jié)合區(qū)域用作聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，隨后聚合酶可使用反密碼子寡核苷酸作為模板生產(chǎn)延伸產(chǎn)物。如果連接酶用于編碼，新生雙功能復(fù)合物的引發(fā)部位包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，該連接酶可將其當(dāng)作底物。在單鏈連接中，存在于介質(zhì)中和攜帶有關(guān)反應(yīng)基團(tuán)身份的信息的寡核苷酸被連接至新生雙功能分子上。雙鏈連接要求新生雙功能復(fù)合物的引發(fā)部位能夠在連接之前雜交至互補(bǔ)性寡核苷酸上。合適地，引發(fā)部位包含一個(gè)，兩個(gè)，或多個(gè)互補(bǔ)性寡核苷酸可與其雜交的核苷酸。此互補(bǔ)性寡核苷酸在另一端雜交至具有特定反應(yīng)物信息的密碼子寡核苷酸上。
新生雙功能復(fù)合物的接頭部分可包含涉及化學(xué)反應(yīng)部位的身份的信息。在適合的方案中，接頭部分包含具有化學(xué)反應(yīng)部位身份的信息的密碼子。
除了標(biāo)識(shí)反應(yīng)物的核苷酸組合，帶有相關(guān)反應(yīng)物的信息的寡核苷酸可包含側(cè)翼區(qū)域。側(cè)翼區(qū)域可用作能夠雜交至新生雙功能復(fù)合物上的結(jié)合區(qū)域。結(jié)合區(qū)域可設(shè)計(jì)成混雜地雜交至一個(gè)以上新生雙功能復(fù)合物上?；蛘?，編碼寡核苷酸上的結(jié)合區(qū)域能夠使用夾板寡核苷酸作為媒介而連接至新生雙功能復(fù)合物的結(jié)合區(qū)域上。
本發(fā)明可通過將單個(gè)反應(yīng)物與新生雙功能復(fù)合物反應(yīng)和加入相應(yīng)的標(biāo)簽而進(jìn)行。但一般來說，優(yōu)選構(gòu)建包含兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)物的反應(yīng)產(chǎn)物的展示分子。因此，在本發(fā)明的某些方面，提出了一種用于得到由展示分子部分和編碼部分組成的雙功能復(fù)合物的方法，所述展示分子部分是反應(yīng)物和起始復(fù)合物的化學(xué)反應(yīng)部位的反應(yīng)產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個(gè)方面，進(jìn)行兩種交替的平行合成，這樣標(biāo)簽被酶連接至新生雙功能復(fù)合物上，同時(shí)化學(xué)反應(yīng)部位和反應(yīng)物之間進(jìn)行反應(yīng)。在每輪中，標(biāo)簽的加入在反應(yīng)物和化學(xué)反應(yīng)部位之間的反應(yīng)之后或之前。在隨后的每輪平行合成中，以前反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物用作化學(xué)反應(yīng)部位且被最后引入的標(biāo)簽提供允許標(biāo)簽的酶加入的引發(fā)部位。在本發(fā)明的其它方面，兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽在與各自的反應(yīng)物反應(yīng)之前或之后被提供。
包含所有的標(biāo)簽的編碼部分可通過延伸過程被轉(zhuǎn)換至雙鏈形式，其中引物被退火至寡核苷酸的3’端和使用合適的聚合酶延伸。雙鏈性在隨后選擇過程過程中可能是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)閱捂満怂峥砂凑找环N類似于aptamers的方式進(jìn)行與生物靶的相互作用。
在模式2的某些方面，提供了一種用于生成包含展示分子部分和編碼部分的雙功能復(fù)合物的庫的方法。該方法包括步驟在單獨(dú)的隔室中提供分別包含化學(xué)反應(yīng)部位和用于酶加入標(biāo)簽的引發(fā)部位的新生雙功能復(fù)合物，和按照任何順序在每個(gè)隔室中進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)部位和一種或多種反應(yīng)物之間的反應(yīng)，和使用一種或多種酶在引發(fā)部位上加入一種或多種標(biāo)識(shí)該一種或多種反應(yīng)物的各自的標(biāo)簽。
每個(gè)隔室中的新生雙功能復(fù)合物可以是相同的或不同的。如果新生雙功能復(fù)合物在化學(xué)反應(yīng)部位上不同，那么新生雙功能復(fù)合物合適地包含用于標(biāo)識(shí)化學(xué)反應(yīng)部位的結(jié)構(gòu)的密碼子。類似地，施用到每個(gè)隔室中的反應(yīng)物可以是相同的或不同的，看情況而定。另外，每個(gè)隔室中的反應(yīng)條件可以是類似的或不同的。
通常，最好使復(fù)合物與一個(gè)以上的反應(yīng)物反應(yīng)。在本發(fā)明的某些方面，兩個(gè)或多個(gè)隔室的內(nèi)容物被合并在一起并隨后為新一輪反應(yīng)而分入一系列隔室中。因此，在第一輪之后的任一輪中，前一輪反應(yīng)的最終產(chǎn)物用作新生雙功能復(fù)合物以得到雙功能復(fù)合物庫，其中該庫的每個(gè)成員包含試劑特異性反應(yīng)產(chǎn)物和相應(yīng)的標(biāo)簽，所述標(biāo)簽為已參與形成反應(yīng)產(chǎn)物的每種反應(yīng)物的身份編碼。在每輪反應(yīng)之間，各隔室的內(nèi)容物在本發(fā)明的一個(gè)方面被混合在一起并再次分入隔室中。在本發(fā)明的其它方面，隔室的內(nèi)容物在已接收密碼子之后但在已發(fā)生反應(yīng)之前被分入其它的隔室中，其中接收進(jìn)一步的密碼子并發(fā)生與已被編碼的兩個(gè)反應(yīng)物的反應(yīng)。在本發(fā)明的另一方面，在化學(xué)反應(yīng)部位和反應(yīng)物之間能夠發(fā)生反應(yīng)之前，兩個(gè)以上的密碼子被編碼?；蛘?，兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)可在開始用相應(yīng)的標(biāo)簽編碼之前發(fā)生。
各個(gè)密碼子與庫中的另一密碼子的區(qū)別可僅在于單個(gè)核苷酸。但為了便于隨后解碼過程，一般理想地在特定密碼子和任何其它密碼子之間具有兩種或多種差別。例如，如果選擇5個(gè)核苷酸的密碼子/反密碼子長度，那么存在100個(gè)以上的核苷酸組合，其中出現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)差別。對(duì)于密碼子中的一定數(shù)目的核苷酸，一般需要優(yōu)化特定密碼子/反密碼子相對(duì)于出現(xiàn)在該庫中的任何其它密碼子/反密碼子的差別的數(shù)目。寡核苷酸密碼子可包含任何合適數(shù)目的核苷酸，如2至100，3至50，4至20或5至15個(gè)核苷酸。
反應(yīng)物可以是游離反應(yīng)物或拉鏈構(gòu)件。反應(yīng)物所起的功能是用作最終被引入展示分子部分中的結(jié)構(gòu)實(shí)體的前體。反應(yīng)物的結(jié)構(gòu)可在與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)之后在隨后一輪中被改變。如果反應(yīng)物是拉鏈構(gòu)件，功能實(shí)體和寡核苷酸之間的鍵的斷裂通常在反應(yīng)之后進(jìn)行。最后一輪是個(gè)例外，其中斷裂可被省去。斷裂可在與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)之后或同時(shí)進(jìn)行。斷裂可產(chǎn)生在隨后步驟中可參與形成新生展示分子和反應(yīng)物之間連接的反應(yīng)基團(tuán)。
游離反應(yīng)物或拉鏈構(gòu)件的功能實(shí)體優(yōu)選包含至少一個(gè)能夠參與反應(yīng)以導(dǎo)致連接至新生雙功能分子的化學(xué)反應(yīng)部位上的反應(yīng)基團(tuán)。出現(xiàn)在游離反應(yīng)物和功能實(shí)體上的反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目合適地是1至10。以僅一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)為特征的游離反應(yīng)物或功能實(shí)體例如用于聚合物或支架的末端位置，而具有兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的功能實(shí)體適用于形成能夠進(jìn)一步反應(yīng)的聚合物或支架的體部分。意欲用于形成連接的兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)通常存在于支架上。支架是核心結(jié)構(gòu)，構(gòu)成用于產(chǎn)生多個(gè)變型的基礎(chǔ)。支架的變型形式通常通過支架的反應(yīng)基團(tuán)與其它反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán)，任選地在填入基團(tuán)或催化劑的媒介下反應(yīng)而形成。所要連接至支架上的功能實(shí)體或游離反應(yīng)物可包含一個(gè)，兩個(gè)或幾個(gè)能夠形成連接的反應(yīng)基團(tuán)。支架的例子包括甾族，hydantions，苯并二氮雜_，等。
連接到包含拉鏈區(qū)域，即混雜地結(jié)合至新生雙功能復(fù)合物的連接部分上的區(qū)域的核酸的游離反應(yīng)物或功能實(shí)體的反應(yīng)基團(tuán)可以能夠形成與化學(xué)反應(yīng)部位的反應(yīng)基團(tuán)的直接連接或該反應(yīng)物能夠通過橋接填入基團(tuán)而形成與化學(xué)反應(yīng)部位的反應(yīng)基團(tuán)的連接?？梢岳斫?，不是反應(yīng)基團(tuán)的所有原子必需保持在所形成的連接中。相反，反應(yīng)基團(tuán)要被認(rèn)為是該連接結(jié)構(gòu)的前體。
如果使用拉鏈構(gòu)件，斷裂可在形成化學(xué)反應(yīng)部位和功能實(shí)體之間連接之前或同時(shí)進(jìn)行。斷裂可按照任何合適的方式進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)方面，斷裂包括試劑或酶的使用。斷裂導(dǎo)致功能實(shí)體轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上或?qū)е聫?fù)合物轉(zhuǎn)移至拉鏈構(gòu)件的功能實(shí)體上。在某些情況下，可有利地通過斷裂而引入新化學(xué)基團(tuán)。新化學(xué)基團(tuán)可用于在隨后周期中，直接或在已被活化之后進(jìn)一步反應(yīng)。在其它情況下，最好在斷裂之后沒有留下接頭的痕跡。在本發(fā)明的一些方面，可能最好不斷裂一個(gè)或多個(gè)化學(xué)鍵。例如，可理想地在最后一輪中保持拉鏈區(qū)域和功能實(shí)體之間的連接。
在本發(fā)明的一些方面，連接和斷裂作為同時(shí)的反應(yīng)而進(jìn)行，即拉鏈構(gòu)件的功能實(shí)體或新生雙功能復(fù)合物的化學(xué)反應(yīng)部位是該反應(yīng)的離去基團(tuán)。在本發(fā)明的一些方面，優(yōu)選設(shè)計(jì)這樣的體系，該體系使得斷裂同時(shí)發(fā)生，因?yàn)檫@樣可減少步驟數(shù)和復(fù)雜性。同時(shí)連接和斷裂也可設(shè)計(jì)使得沒有留下接頭的痕跡或使得用于進(jìn)一步反應(yīng)的新化學(xué)基團(tuán)被引入，如上所述。在本發(fā)明其它方面，優(yōu)選進(jìn)行分開的交聯(lián)和斷裂步驟，因?yàn)橹鸩椒桨改軌蚩刂泼總€(gè)子步驟并能夠減少非特異性轉(zhuǎn)移的可能性。
功能實(shí)體至包含拉鏈區(qū)域的寡核苷酸上的連接通常通過接頭而進(jìn)行。優(yōu)選接頭將功能實(shí)體與寡核苷酸在末端核苷酸或該寡核苷酸下游一個(gè)或兩個(gè)核苷酸的核苷酸處連接。功能實(shí)體的連接可在任何可用于連接的實(shí)體上，即功能實(shí)體可連接到寡核苷酸的核苷酸的核酸堿基上，或主鏈上。一般來說，優(yōu)選在核苷酸間鍵的磷上或在核酸堿基上連接功能實(shí)體。
在本發(fā)明的某些方面，功能實(shí)體的反應(yīng)基團(tuán)任選地通過合適的間隔基而連接到寡核苷酸上。反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選能夠通過相應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)之間的直接反應(yīng)或通過使用合適的填入基團(tuán)而產(chǎn)生與新生展示分子的連接。將功能實(shí)體與寡核苷酸偶聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選在進(jìn)行連接的同時(shí)被斷裂。功能實(shí)體在一些情況下可包含能夠在隨后周期中參與形成連接的第二反應(yīng)基團(tuán)。第二反應(yīng)基團(tuán)可在它能夠參與形成連接之前需要活化。
優(yōu)選，至少一個(gè)接頭在斷裂步驟之后保持完整。所述至少一個(gè)接頭可將展示分子連接至編碼部分，即包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的部分，所述標(biāo)簽用于標(biāo)識(shí)已參與形成展示分子的各種反應(yīng)物。可想要地通過包含可選擇性地?cái)嗔训慕宇^的間隔基將展示分子部分連接至雙功能復(fù)合物的編碼部分上。可選擇性地?cái)嗔训慕宇^設(shè)計(jì)使得它在導(dǎo)致功能實(shí)體轉(zhuǎn)移至化學(xué)反應(yīng)部位上的條件下不斷裂。
可斷裂的接頭可選自大量的化學(xué)結(jié)構(gòu)。接頭的例子包括，但不限于此，具有酶促斷裂位點(diǎn)的接頭，包含化學(xué)可降解組分的接頭，和可通過電磁輻射而斷裂的接頭。特別有意義的可斷裂的接頭目前是可通過光斷裂的接頭。合適的實(shí)例包括位于展示分子和雙功能復(fù)合物的編碼部分之間的o-硝基芐基基團(tuán)。
如果兩個(gè)或多個(gè)反應(yīng)物與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)，那么編碼部分的密碼子可被恒定區(qū)域或結(jié)合區(qū)域分開。結(jié)合區(qū)域的一個(gè)功能可以是確立其上酶，如聚合酶或連接酶可識(shí)別為底物的平臺(tái)。根據(jù)所形成的編碼分子，標(biāo)識(shí)符可包含其它的密碼子，如3，4，5，或更多的密碼子。其它密碼子分別可通過合適的結(jié)合區(qū)域而分開。優(yōu)選，標(biāo)識(shí)符的所有的或至少大多數(shù)的密碼子通過結(jié)合序列與相鄰密碼子分開。結(jié)合區(qū)域可具有任何合適數(shù)目的核苷酸，如1至20個(gè)。
除了用作酶的底物，結(jié)合區(qū)域(如果有)可用于各種目的。在本發(fā)明的一種設(shè)置中，結(jié)合區(qū)域標(biāo)識(shí)密碼子的位置。通常，在密碼子的上游或下游的結(jié)合區(qū)域包含允許確定密碼子的位置的信息。在另一設(shè)置中，結(jié)合區(qū)域具有交替序列，允許在形成庫時(shí)由兩個(gè)池加入構(gòu)件。另外，結(jié)合區(qū)域可調(diào)節(jié)退火溫度至所需水平。
具有高親和性的結(jié)合區(qū)域可通過引入一個(gè)或多個(gè)與相關(guān)的核酸堿基形成三個(gè)氫鍵的核酸堿基而提供。具有該性能的核酸堿基的例子是鳥嘌呤和胞嘧啶。作為替代方案，或在此之外，連接區(qū)域可經(jīng)受主鏈修飾。幾種主鏈修飾提供較高親和性，如核糖部分的2’-O-甲基取代，肽核酸(PNA)，和也被稱作LNA(鎖定的核酸)的核糖部分的2’-4’O-亞甲基環(huán)化。
標(biāo)識(shí)符可包含在密碼子周圍的側(cè)翼區(qū)域。側(cè)翼區(qū)域可包括信號(hào)基團(tuán)，如熒光團(tuán)或放射性活性基團(tuán)從而能夠檢測復(fù)合物的存在或不存在或側(cè)翼區(qū)域可包含可被檢測的標(biāo)記，如生物素。如果標(biāo)識(shí)符包含生物素部分，標(biāo)識(shí)符可容易被回收。
側(cè)翼區(qū)域也可用作擴(kuò)增反應(yīng)，如PCR的引發(fā)部位。通常，在形成雙功能復(fù)合物的最后周期包括引發(fā)部位的引入。雙功能復(fù)合物的靠近展示分子的區(qū)域，如展示分子和為支架分子編碼的密碼子之間的核酸序列，通常用作另一引發(fā)部位，這樣允許對(duì)雙功能復(fù)合物的編碼區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
模式1和模式2的結(jié)合在本發(fā)明的某些方面中，結(jié)合上述的模式1和模式2，即不同的反應(yīng)物用于不同的輪。另外在模式1和模式2內(nèi)，不同的構(gòu)件可用于不同的輪。
在形成庫時(shí)，可有利地使用一罐合成技術(shù)(模式1)和分開-和-混合技術(shù)(模式2)的聯(lián)合，因?yàn)槟Ｊ?和模式2分別具有其優(yōu)點(diǎn)。一罐技術(shù)提供在反應(yīng)之前使反應(yīng)基團(tuán)緊密靠近的可能性，因此得到高局部濃度和具有單個(gè)容器的便利。分開和混合技術(shù)提供具有游離反應(yīng)物和非雜交反應(yīng)條件的可能性，提供通用的反應(yīng)。可合適地參照

圖15，其中顯示各種單編碼酶方法。分開-和-混合合成技術(shù)一般用于反應(yīng)物/功能實(shí)體和密碼子/反密碼子之間不具有共價(jià)連接的反應(yīng)物，即游離反應(yīng)物和拉鏈構(gòu)件。一罐合成技術(shù)一般用于其中在功能實(shí)體和標(biāo)識(shí)所述功能實(shí)體的密碼子/反密碼子之間存在共價(jià)連接的反應(yīng)物，即E2構(gòu)件，環(huán)形構(gòu)件，和N構(gòu)件。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，雙功能復(fù)合物的中間體庫使用一罐合成技術(shù)而生成。該中間體庫隨后用于通過分開-和-混合合成而生成最終庫。中間體庫可使用單輪或多輪一罐合成而生成且最終庫可采用單輪或多輪分開-和-混合而制成。分開-和-混合合成在最后一輪庫生成中的應(yīng)用為最終反應(yīng)物提供使用與維持雜交不相容的反應(yīng)介質(zhì)，如高離子強(qiáng)度或有機(jī)溶劑的可能性。
在另一實(shí)施方案中，中間體庫使用分開和混合合成技術(shù)而制成。中間體庫用于使用一罐合成技術(shù)生成最終庫。中間體庫可使用單輪或多輪分開-和-混合合成而制成而最終庫可采用一輪或多輪一罐合成而制造。最后一輪的一罐合成在生長中的被編碼分子和功能實(shí)體之間提供緊密接近。這種緊密接近度導(dǎo)致高局部濃度，即使對(duì)于具有較低反應(yīng)傾向的反應(yīng)物也促進(jìn)反應(yīng)。
多編碼(multiple encoding)
多編碼意味著，兩種或多種密碼子在化學(xué)反應(yīng)部位和兩種或多種反應(yīng)物之間的反應(yīng)之前或之后被提供在標(biāo)識(shí)符中。多編碼具有各種優(yōu)點(diǎn)，例如可使反應(yīng)的范圍更寬，因?yàn)樵S多化合物只能通過三(或更多)種組分反應(yīng)而合成，這是由于第一反應(yīng)物和化學(xué)反應(yīng)部位之間的中間體不是穩(wěn)定的。其它優(yōu)點(diǎn)涉及有機(jī)溶劑的使用和兩種或多種游離反應(yīng)物在某些實(shí)施方案中的可得性。
因此在本發(fā)明的某些方面，本發(fā)明涉及一種用于得到包含展示分子部分和編碼部分的雙功能復(fù)合物的方法，其中展示分子通過將化學(xué)反應(yīng)部位與兩種或多種反應(yīng)物反應(yīng)而制成且編碼部分包含用于標(biāo)識(shí)反應(yīng)物的標(biāo)簽。
在本發(fā)明的某些方面，第一反應(yīng)物在與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)后形成中間體產(chǎn)物且第二反應(yīng)物與該中間體產(chǎn)物反應(yīng)得到展示分子或其前體。在本發(fā)明的另一方面，兩種或多種反應(yīng)物相互反應(yīng)形成中間體產(chǎn)物且化學(xué)反應(yīng)部位與該中間體產(chǎn)物反應(yīng)得到展示分子或其前體。中間體產(chǎn)物可通過將兩種或多種反應(yīng)物分開地反應(yīng)并隨后在隨后步驟中將中間體產(chǎn)物與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)而得到。在一個(gè)單獨(dú)步驟中進(jìn)行的反應(yīng)物的反應(yīng)提供使用其中標(biāo)簽不能經(jīng)受的條件的可能性。因此，如果編碼部分包含核酸，反應(yīng)物之間的反應(yīng)可在本來會(huì)降解核酸的條件下進(jìn)行。
反應(yīng)可按照以下給出的方案進(jìn)行。該方案給出了一個(gè)例子，其中連接到化學(xué)反應(yīng)部位上的用于兩種反應(yīng)物和化學(xué)反應(yīng)部位(支架)的標(biāo)識(shí)標(biāo)簽被提供在分開的隔室中。這些隔室被排列成陣列，如微量滴定板，允許不同的酰基化劑和不同的烷基化劑進(jìn)行任何組合。
起始情形
X表示化學(xué)反應(yīng)部位如支架。
兩種反應(yīng)物按照任何組合單獨(dú)地相互反應(yīng)或隨后按照編碼部分的標(biāo)簽加入每個(gè)隔室中或反應(yīng)物可按照任何順序加入每個(gè)隔室中以允許直接反應(yīng)。以下方案顯示反應(yīng)的結(jié)果。
產(chǎn)物板 例如，XA2表示處于其最終狀態(tài)的展示分子XA2，即由片段X，A和2完全組裝。
包含兩個(gè)或多個(gè)用于標(biāo)識(shí)反應(yīng)物的標(biāo)簽的編碼部分可按照任何合適的方式在反應(yīng)前或后制備。在本發(fā)明的一個(gè)方面，每個(gè)編碼部分通過標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)而合成。在另一方面，標(biāo)簽被預(yù)先制備并通過化學(xué)或酶連接而組裝到最終編碼部分中。
化學(xué)連接存在各種可能性。合適的例子包括a)第一寡核苷酸末端包含3’-OH基團(tuán)和第二寡核苷酸末端包含5’-磷酸-2-咪唑基團(tuán)(5′-phosphor-2-imidazole group)。反應(yīng)時(shí)，形成磷酸二酯核苷間鍵，b)第一寡核苷酸末端包含處于3’-端的磷酸imidazolide基團(tuán)和處于5’-端的磷酸imidazolide基團(tuán)。如果在一起反應(yīng)，形成磷酸二酯核苷間鍵，c)第一寡核苷酸末端包含3’-硫代磷酸酯基團(tuán)和第二寡核苷酸包含5’-碘。如果兩個(gè)基團(tuán)反應(yīng)，形成3’-O-P(＝O)(OH)-S-5’核苷間鍵，和d)第一寡核苷酸末端包含3’-硫代磷酸酯基團(tuán)和第二寡核苷酸包含5’-甲苯磺酸酯。反應(yīng)時(shí)，形成3’-O-P(＝O)(OH)-S-5’核苷間鍵。
合適地，標(biāo)簽有效地連接在一起，這樣核酸活性酶能夠識(shí)別連接區(qū)域?yàn)榈孜铩ｏ@然，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)行連接使得聚合酶能夠識(shí)別連接鏈作為模板。因此，在優(yōu)選方面，用于偶聯(lián)步驟的化學(xué)反應(yīng)策略一般包括磷酸二酯核苷間鍵的形成。按照該方面，以上的方法a)和b)是優(yōu)選的。
在另一方面，如果連接酶用于連接，合適的例子包括Taq DNA連接酶，T4 DNA連接酶，T7 DNA連接酶，和大腸桿菌DNA連接酶。對(duì)連接酶的選擇在一定程度上取決于所要連接在一起的末端的設(shè)計(jì)。因此，如果末端是平端，T4 DNA連接酶可以是優(yōu)選的，而對(duì)于粘性末端連接，即其中每端上的突出端是互補(bǔ)性的連接，Taq DNA連接酶可以是優(yōu)選的。
在本發(fā)明的某些方面，酶編碼由于酶所提供的特異性而優(yōu)選。圖17公開了用于酶編碼雙功能分子的編碼部分中的兩種或多種反應(yīng)物的方法。對(duì)編碼方法的選擇取決于各種因素，如對(duì)游離反應(yīng)物的需求，對(duì)接近度的需求，和對(duì)便利性的需求。圖17所示的酶雙編碼方法可容易地?cái)U(kuò)展至三，四，等編碼。
按照某些實(shí)施方案，功能實(shí)體連接到標(biāo)識(shí)標(biāo)簽上，和每個(gè)功能實(shí)體攜帶一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)。所有的功能實(shí)體相互反應(yīng)，生成包含與功能實(shí)體一樣多的標(biāo)簽的最終產(chǎn)物。標(biāo)簽可通過分子間反應(yīng)或結(jié)合作用隨后斷裂兩個(gè)接頭而合并成單個(gè)編碼部分(通常寡核苷酸)，如下所示 粗線表示標(biāo)簽。細(xì)線表示接頭或鍵?！?”表示引發(fā)部位。在本發(fā)明的一些方面，X被認(rèn)為是化學(xué)反應(yīng)部位。
在以上實(shí)施方案的一個(gè)方面，標(biāo)簽是寡核苷酸，它們通過化學(xué)連接或酶催化連接而結(jié)合在一起。
或者，標(biāo)簽在功能實(shí)體反應(yīng)之前被偶聯(lián)。在該過程中，功能實(shí)體從其標(biāo)簽上斷裂或隨后斷裂。如
以上示意表示化的一個(gè)實(shí)施方案包括，如果標(biāo)簽是核苷酸，標(biāo)簽通過化學(xué)連接或酶催化連接而組合。
實(shí)施例9說明一種多組分反應(yīng)，其中使用三重編碼。因此在三種游離反應(yīng)物與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)之后，編碼部分通過酶連接而提供三種標(biāo)識(shí)性標(biāo)簽。
能夠轉(zhuǎn)移功能實(shí)體的構(gòu)件。
以下部分描述能夠?qū)⒐δ軐?shí)體轉(zhuǎn)移至雙功能復(fù)合物的反應(yīng)基團(tuán)上的示例性構(gòu)件的形成和使用。粗線表示寡核苷酸。
A.?；磻?yīng)形成酰基化構(gòu)件的總體路線和這些構(gòu)件的用途
N-羥基馬來酰亞胺(1)可通過使用酰氯如乙酰氯而?；蛟谌鏣HF中通過使用二環(huán)己基碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺和酸如乙酸而?；Ｖ虚g體可通過使用過量1，3-丙烷二硫醇而進(jìn)行Michael加成，隨后與4，4’-二吡啶基二硫化物或2，2′-二吡啶基二硫化物反應(yīng)。該中間體(3)可隨后被加載到攜帶硫醇把手(handle)的寡核苷酸上，得到構(gòu)件(4)。顯然，中間體(2)可使用不是二硫鍵的另一鍵，如酰胺鍵而連接到寡核苷酸上和N-羥基馬來酰亞胺可使用各種間隔基而與寡核苷酸隔離。
構(gòu)件(4)可與包含受體胺基團(tuán)的標(biāo)識(shí)符寡核苷酸如通過以下步驟而反應(yīng)構(gòu)件(4)(1nmol)與氨基-寡核苷酸(1nmol)在hepes-緩沖劑(20pL 100mM hepes和1M NaCl溶液，pH＝7.5)和水(39μL)中混合。寡核苷酸通過加熱至50攝氏度和冷卻(2攝氏度/秒)至30攝氏度而退火在一起?；旌衔镫S后處于波動(dòng)溫度下(10攝氏度1秒，隨后35攝氏度1秒)過夜，得到產(chǎn)物(5)。
更一般地說，下示的構(gòu)件能夠?qū)⒒瘜W(xué)實(shí)體(CE)轉(zhuǎn)移至受體親核基團(tuán)，通常是胺基團(tuán)。粗體的下方水平線說明構(gòu)件和垂直線說明間隔基。5-元取代的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)環(huán)用作活化劑，即在連接到NHS環(huán)上的氧原子和化學(xué)實(shí)體之間形成不穩(wěn)定鍵。該不穩(wěn)定鍵可通過如位于支架上的親核基團(tuán)而斷裂
可形成酰胺鍵的另一構(gòu)件是 R可不存在或是NO2，CF3，鹵素，優(yōu)選Cl，Br，或I，和Z可以是S或O。這種類型的構(gòu)件公開于丹麥專利申請No.PA 2002 0951和US臨時(shí)專利申請(2002年12月20日遞交，題為“能夠?qū)⒐δ軐?shí)體轉(zhuǎn)移至接受性反應(yīng)基團(tuán)上的構(gòu)件”)。這兩篇專利申請的內(nèi)容在此作為參考完全并入本發(fā)明。
親核基團(tuán)可斷裂Z和羰基基團(tuán)之間的鍵，這樣將化學(xué)實(shí)體-(C＝O)-CE’轉(zhuǎn)移至所述親核基團(tuán)上。
B.烷基化形成烷基化/乙烯基化構(gòu)件的總體路線和這些構(gòu)件的用途烷基化構(gòu)件可具有以下一般結(jié)構(gòu) R1＝H，Me，Et，iPr，Cl，NO2R2＝H，Me，Et，iPr，Cl，NO2R1和R2可用于調(diào)整硫酸酯的反應(yīng)性以使反應(yīng)性合適。氯和硝基取代可增加反應(yīng)性。烷基基團(tuán)可降低反應(yīng)性。硫酸酯上的鄰位取代基由于空間原因而引導(dǎo)進(jìn)入的親核試劑選擇性地進(jìn)攻R-基團(tuán)和避免進(jìn)攻硫。
以下描述形成烷基化構(gòu)件和轉(zhuǎn)移功能實(shí)體的一個(gè)例子 3-氨基苯酚(6)用馬來酸酐處理，隨后用酸如H2SO4或P2O5處理并加熱得到馬來酰亞胺(7)。馬來酰亞胺的閉環(huán)作用也可在以下情況下實(shí)現(xiàn)使用酸穩(wěn)定的O-保護(hù)基團(tuán)時(shí)，通過用Ac2O處理(加熱或不加熱)，隨后O-去保護(hù)?；蛘?，在Ac2O中回流，隨后在熱水/二噁烷中O-脫乙?；?，得到(7)。
用SO2Cl2，在有或沒有三乙基胺或碳酸鉀的情況下在二氯甲烷或更高沸點(diǎn)的溶劑中進(jìn)一步處理(7)，得到中間體(8)，后者可被分離或通過用合適的醇(在這種情況下，MeOH)淬滅而直接進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成芳基烷基硫酸酯，這樣形成(9)。
有機(jī)部分(9)可連接至寡核苷酸上，如下將攜帶硫醇的寡核苷酸在緩沖劑50mM MOPS或hepes或磷酸鹽(pH 7.5)中用有機(jī)構(gòu)件(9)在DMSO或DMF中的1-100mM溶液和優(yōu)選7.5mM溶液處理，使得DMSO/DMF濃度是5-50％，和優(yōu)選10％。該混合物在25攝氏度下放置1-16h和優(yōu)選2-4h，得到烷基化劑(在這種情況下，甲基化構(gòu)件(10))。
烷基化構(gòu)件(10)與帶有胺的新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)可進(jìn)行如下將雙功能復(fù)合物(1nmol)與構(gòu)件(10)(1nmol)在hepes-緩沖劑(20μL100mM hepes和1M NaCl溶液，pH＝7.5)和水(39μL)中混合。寡核苷酸通過加熱至50攝氏度和冷卻(2攝氏度/秒)至30攝氏度而相互退火?；旌衔镫S后處于波動(dòng)溫度(10攝氏度1秒，隨后35攝氏度1秒)過夜(o/n)，得到甲基胺反應(yīng)產(chǎn)物(11)。
更一般地說，能夠?qū)⒒瘜W(xué)實(shí)體轉(zhuǎn)移至接受性反應(yīng)基團(tuán)上以形成單鍵的構(gòu)件是 接受基團(tuán)可以是親核試劑，如包含雜原子的基團(tuán)，這樣形成化學(xué)實(shí)體和雜原子之間的單鍵，或接受基團(tuán)可以是電負(fù)性碳原子，這樣形成化學(xué)實(shí)體和支架之間的C-C鍵。
C.乙烯基化反應(yīng)乙烯基化構(gòu)件可類似于以上烷基化構(gòu)件所述而制備和使用。盡管不將氯磺酸酯(以上的8)與醇反應(yīng)，將中間體氯硫酸酯分離并用烯醇化物或O-三烷基甲硅烷基烯醇化物在存在或不存在氟化物的情況下處理。例如
示例性乙烯基化構(gòu)件(13)的形成將攜帶硫醇的寡核苷酸在緩沖劑50mM MOPS或hepes或磷酸鹽(pH7.5)中用有機(jī)部分(12)在DMSO或DMF中的1-100mM溶液和優(yōu)選7.5mM溶液處理，使得DMSO/DMF濃度是5-50％，和優(yōu)選10％。將該混合物在25攝氏度下放置1-16h和優(yōu)選2-4h，得到乙烯基化構(gòu)件(13)。
磺?；┐蓟?13)可用于與攜帶胺的支架反應(yīng)得到烯胺(14a和/或14b)或如與碳負(fù)離子反應(yīng)得到(15a和/或15b)。如
乙烯基化構(gòu)件(13)和攜帶胺或硝基烷基的標(biāo)識(shí)符的反應(yīng)可進(jìn)行如下氨基-寡核苷酸(1nmol)或硝基烷基-寡核苷酸(1nmol)標(biāo)識(shí)符與構(gòu)件(1nmol)(13)在0.1M TAPS，磷酸鹽或hepes-緩沖劑和300mMNaCl溶液(pH＝7.5-8.5和優(yōu)選pH＝8.5)中混合。寡核苷酸通過加熱至50攝氏度和冷卻(2攝氏度/秒)至30攝氏度而退火至模板上?；旌衔镫S后處于波動(dòng)溫度(10攝氏度1秒，隨后35攝氏度1秒)過夜，得到反應(yīng)產(chǎn)物(14a/b或15a/b)。上述烷基和乙烯基硫酸酯的替代物可以是一樣有效的磺酸酯如(31)(但R″是烷基或乙烯基)，可用作烷基化和乙烯基化劑，所述(31)如下所述由(28，其中苯基基團(tuán)被烷基基團(tuán)取代)和(29)制備。
以下給出能夠通過將化學(xué)實(shí)體轉(zhuǎn)移至受體醛基團(tuán)上而形成雙鍵的另一構(gòu)件。醛的碳和化學(xué)實(shí)體之間的雙鍵通過該反應(yīng)而形成。
以上構(gòu)件包括在丹麥專利專利申請No.DK PA 2002 01952和US臨時(shí)專利申請(2002年12月20日遞交，題為“能夠?qū)⒐δ軐?shí)體轉(zhuǎn)移至接受性反應(yīng)基團(tuán)上以形成C＝C雙鍵的構(gòu)件”)中。這兩篇專利申請的內(nèi)容在此作為參考完全并入本發(fā)明。
D.鏈烯基化(Alkenylidation)反應(yīng)形成Wittig和HWE構(gòu)件的總體路線和這些構(gòu)件的使用市售化合物(16)可通過標(biāo)準(zhǔn)方式，即DCC或DIC偶聯(lián)而被轉(zhuǎn)化成NHS酯(17)。將攜帶胺的寡核苷酸在緩沖劑50mM MOPS或hepes或磷酸鹽(pH 7.5)中用有機(jī)化合物在DMSO或DMF中的1-100mM溶液和優(yōu)選7.5mM溶液處理，使得DMSO/DMF濃度是5-50％，和優(yōu)選10％。
將該混合物在25攝氏度下放置1-16h和優(yōu)選2-4h，得到膦鍵接的前體構(gòu)件(18)。該前體構(gòu)件通過加入合適的烷基鹵化物，如N，N-二甲基-2-碘乙酰胺(作為在DMSO或DMF中的1-100mM和優(yōu)選7.5mM溶液，使得DMSO/DMF濃度是5-50％，和優(yōu)選10％)而進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。該混合物在25攝氏度下放置1-16h和優(yōu)選2-4h，得到構(gòu)件(19)。作為一種替代方式，有機(jī)化合物(17)可用烷基鹵化物進(jìn)行P-烷基化并隨后偶聯(lián)到攜帶胺的寡核苷酸上，得到(19)。
攜帶醛的標(biāo)識(shí)符(20)可通過4-甲?；郊姿岬腘HS酯和攜帶胺的寡核苷酸之間使用類似于上述的條件進(jìn)行反應(yīng)而形成。標(biāo)識(shí)符(20)與(19)在稍微堿性的條件下反應(yīng)，得到烯烴(21)。
單體構(gòu)件(19)和標(biāo)識(shí)符(20)的反應(yīng)可進(jìn)行如下標(biāo)識(shí)符(20)(1nmol)與構(gòu)件(19)(1nmol)在0.1M TAPS，磷酸鹽或hepes-緩沖劑和1M NaCl溶液(pH＝7.5-8.5和優(yōu)選pH＝8.0)中混合。將反應(yīng)混合物在35-65攝氏度優(yōu)選58攝氏度下放置過夜，得到反應(yīng)產(chǎn)物(21)。
作為(17)的替代，可使用膦酸酯(24)。它們可通過二乙基氯亞磷酸酯(22)和合適的攜帶羧基的醇之間的反應(yīng)而制成。羧酸隨后轉(zhuǎn)化成NHS酯(24)并可采用上述的方法或替換物。盡管不是簡單的P-烷基化，亞磷酸酯可經(jīng)歷Arbuzov′s反應(yīng)和產(chǎn)生膦酸酯。構(gòu)件(25)的益處在于，它比其磷鎓對(duì)應(yīng)物(19)更具反應(yīng)性。
E.過渡金屬催化的芳基化，雜芳基化(hetaylation)和乙烯基化反應(yīng)能夠轉(zhuǎn)移芳基，雜芳基(hetaryl)或乙烯基官能度的親電性構(gòu)件(31)可由有機(jī)化合物(28)和(29)通過使用用于馬來酰亞胺衍生物偶聯(lián)至上述攜帶SH的寡核苷酸上的步驟而制成。替代馬來酰亞胺，NHS-酯衍生物可由如羧基苯磺酸衍生物制備，通過將這些偶聯(lián)至胺攜帶性寡核苷酸上而使用。(28)和(29)的R-基團(tuán)用于調(diào)節(jié)磺酸酯的反應(yīng)性以得到合適的反應(yīng)性。
過渡金屬催化交叉偶聯(lián)可進(jìn)行如下將1.4mM Na2PdCl4和2.8mMP(p-SO3C6H4)3在水中放置15min的預(yù)混物加入標(biāo)識(shí)符(30)和構(gòu)件(3)(都是1nmol)在0.5M NaOAc緩沖劑(pH＝5)和75mM NaCl(最終[Pd]＝0.3mM)中的混合物中?；旌衔镫S后被放置在35-65攝氏度優(yōu)選58攝氏度過夜，得到反應(yīng)產(chǎn)物(32)。
R″＝芳基、雜芳基(hetaryl)或乙烯基能夠轉(zhuǎn)移芳基，雜芳基(hetaryl)或乙烯基官能度的相應(yīng)的親核單體構(gòu)件可由種類(35)的有機(jī)化合物制備。這可通過將烴基代硼酸用二醇如(33)酯化，隨后轉(zhuǎn)化成NHS-酯衍生物而實(shí)現(xiàn)。NHS-酯衍生物可隨后通過使用用于將NHS-酯衍生物偶聯(lián)至胺攜帶性寡核苷酸上的上述步驟而被偶聯(lián)至寡核苷酸上，生成構(gòu)件類型(37)?；蛘?，馬來酰亞胺衍生物可如上所述制備并加載到攜帶SH的寡核苷酸上。
過渡金屬催化交叉偶聯(lián)進(jìn)行如下將1.4mM Na2PdCl4和2.8mM P(p-SO3C6H4)3在水中放置15min的預(yù)混物加入標(biāo)識(shí)符(36)和構(gòu)件(37)(都是1nmol)在0.5M NaOAc緩沖劑(pH＝5)和75mM NaCl(最終[Pd]＝0.3mM)中的混合物。混合物隨后放置在35-65攝氏度優(yōu)選58攝氏度下過夜，得到模板結(jié)合的(38)。
R＝芳基，hetaryl或乙烯基F.烯胺和烯醇醚單體構(gòu)件的反應(yīng)加載有烯胺和烯醇醚的構(gòu)件可制備如下對(duì)于Z＝NHR(R＝H，烷基，芳基，雜芳基(hetaryl))，2-巰基乙基胺可與二吡啶基二硫化物反應(yīng)生成活化二硫化物(40)，后者可隨后在脫水條件下縮合至酮或醛上，生成烯胺(41)。對(duì)于Z＝OH，2-巰基乙醇與二吡啶基二硫化物反應(yīng)，隨后O-甲苯磺酰基化(Z＝OTs)。甲苯磺酸酯(40)可隨后直接與烯醇化物或在氟化物的存在下與O-三烷基甲硅烷基烯醇化物反應(yīng)，生成烯醇化物(41)。
烯胺或烯醇化物(41)可隨后如上所述偶聯(lián)到攜帶SH的寡核苷酸上，得到構(gòu)件(42)。
構(gòu)件(42)可與羰基攜帶性標(biāo)識(shí)符寡核苷酸如(44)或與烷基鹵化物攜帶性寡核苷酸如(43)反應(yīng)如下構(gòu)件(42)(1nmol)與標(biāo)識(shí)符(43)(1nmol)在50mM MOPS，磷酸鹽或hepes-緩沖劑緩沖劑和250mM NaCl溶液(pH＝7.5-8.5和優(yōu)選pH＝7.5)中混合。反應(yīng)混合物在35-65攝氏度優(yōu)選58攝氏度下放置過夜或處于波動(dòng)溫度(10攝氏度1秒，隨后35攝氏度1秒)，得到反應(yīng)產(chǎn)物(46)，其中Z＝O或NR。對(duì)于其中Z＝NR的化合物，可采用稍微酸性的條件以得到產(chǎn)物(46)，其中Z＝O。
構(gòu)件(42)(1nmol)與標(biāo)識(shí)符(44)(1nmol)在0.1M TAPS，磷酸鹽或hepes-緩沖劑緩沖劑和300mM NaCl溶液(pH＝7.5-8.5和優(yōu)選pH＝8.0)中混合。反應(yīng)混合物在35-65攝氏度優(yōu)選58攝氏度下放置過夜或處于波動(dòng)溫度(10攝氏度1秒，隨后35攝氏度1秒)，得到反應(yīng)產(chǎn)物(45)，其中Z＝O或NR。對(duì)于其中Z＝NR的化合物，可采用稍微酸性的條件以得到產(chǎn)物(45)，其中Z＝O。
烯醇醚種類(13)可經(jīng)歷有或沒有催化的環(huán)加成。類似地，二烯醇醚可例如通過(8)與α，β-不飽和酮或醛的烯醇化物或三烷基甲硅烷基烯醇化物(在氟化物的存在下)反應(yīng)生成(47)而制備或使用，(47)可被加載到攜帶SH的寡核苷酸上，生成單體構(gòu)件(48)。

二烯(49)，烯(50)和1，3-偶極子(1，3-dipole)(51)可通過攜帶氨基的寡核苷酸和相應(yīng)的有機(jī)化合物的NHS-酯之間的簡單反應(yīng)而形成。(13)或(31，R″＝乙烯基)與二烯如(49)反應(yīng)生成(52)或與如1，3-偶極子(1，3-dipole)(51)反應(yīng)生成(53)以及(48)或(31，R″＝二烯基)與烯如(50)反應(yīng)生成(54)，可進(jìn)行如下構(gòu)件(13)或(48)(1nmol)與標(biāo)識(shí)符(49)或(50)或(51)(1nmol)在50mM MOPS，磷酸鹽或hepes-緩沖劑緩沖劑和2.8M NaCl溶液(pH＝7.5-8.5和優(yōu)選pH＝7.5)中混合。反應(yīng)混合物在35-65攝氏度優(yōu)選58攝氏度下放置過夜或處于波動(dòng)溫度(10攝氏度1秒，隨后35攝氏度1秒)，分別生成模板結(jié)合的(52)，(53)或(54)。

交聯(lián)斷裂構(gòu)件可有利地將化學(xué)實(shí)體至接受性反應(yīng)基團(tuán)上的轉(zhuǎn)移分成兩個(gè)不同的步驟，即交聯(lián)步驟和斷裂步驟，因?yàn)槊總€(gè)步驟可被優(yōu)化。以下示例給出適用于這種兩個(gè)步驟過程的構(gòu)件 起始，出現(xiàn)在功能實(shí)體前體(簡稱FEP)上的反應(yīng)基團(tuán)與接受性反應(yīng)基團(tuán)，如出現(xiàn)在支架上的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)，這樣形成交聯(lián)。隨后，通常通過加入含水氧化劑如I2，Br2，Cl2，H+，或Lewis酸而進(jìn)行斷裂。斷裂導(dǎo)致基團(tuán)HZ-FEP-轉(zhuǎn)移至受體部分，如支架上。
在以上結(jié)構(gòu)式中Z是O，S，NR4Q是N，CR1P是價(jià)鍵，O，S，NR4，或基團(tuán)C5-7亞芳基，C1-6亞烷基，C1-6O-亞烷基，C1-6S-亞烷基，NR1-亞烷基，C1-6亞烷基-O，C1-6亞烷基-S(任選地，所述基團(tuán)被0-3個(gè)R4，0-3個(gè)R5和0-3個(gè)R9取代)或C1-C3亞烷基-NR42，C1-C3亞烷基-NR4C(O)R8，C1-C3亞烷基-NR4C(O)OR8，C1-C2亞烷基-O-NR42，C1-C2亞烷基-O-NR4C(O)R8，C1-C2亞烷基-O-NR4C(O)OR8(被0-3個(gè)R9取代)，B是包含D-E-F的基團(tuán)，其中D是價(jià)鍵或基團(tuán)C1-6亞烷基，C1-6亞鏈烯基，C1-6亞炔基，C5-7亞芳基，或C5-7亞雜芳基，所述基團(tuán)任選地被1至4個(gè)基團(tuán)R11取代，E是，如果存在的話，價(jià)鍵，O，S，NR4，或基團(tuán)C1-6亞烷基，C1-6亞鏈烯基，C1-6亞炔基，C5-7亞芳基，或C5-7亞雜芳基，所述基團(tuán)任選地被1至4個(gè)基團(tuán)R11取代，F(xiàn)是，如果存在的話，價(jià)鍵，O，S，或NR4，A是使化學(xué)結(jié)構(gòu)離開互補(bǔ)性成分的間隔基團(tuán)，可以是核酸，R1，R2，和R3相互獨(dú)立地選自H，C1-C6烷基，C2-C6鏈烯基，C2-C6炔基，C4-C8鏈二烯基，C3-C7環(huán)烷基，C3-C7環(huán)雜烷基，芳基，和雜芳基，所述基團(tuán)被0-3個(gè)R4，0-3個(gè)R5和0-3個(gè)R9取代，或C1-C3亞烷基-NR42，C1-C3亞烷基-NR4C(O)R8，C1-C3亞烷基-NR4C(O)OR8，C1-C2亞烷基-O-NR42，C1-C2亞烷基-O-NR4C(O)R8，C1-C2亞烷基-O-NR4C(O)OR8(被0-3個(gè)R9取代)，F(xiàn)EP是基團(tuán)選自H，C1-C6烷基，C2-C6鏈烯基，C2-C6炔基，C4-C8鏈二烯基，C3-C7環(huán)烷基，C3-C7環(huán)雜烷基，芳基，和雜芳基(所述基團(tuán)被0-3個(gè)R4，0-3個(gè)R5和0-3個(gè)R9取代)或C1-C3亞烷基-NR42，C1-C3亞烷基-NR4C(O)R8，C1-C3亞烷基-NR4C(O)OR8，C1-C2亞烷基-O-NR42，C1-C2亞烷基-O-NR4C(O)R8，C1-C2亞烷基-O-NR4C(O)OR8(被0-3個(gè)R9取代)，其中R4是H或獨(dú)立地選自C1-C6烷基，C2-C6鏈烯基，C2-C6炔基，C3-C7環(huán)烷基，C3-C7環(huán)雜烷基，芳基，雜芳基，所述基團(tuán)被0-3個(gè)R9取代和R5獨(dú)立地選自-N3，-CNO，-C(NOH)NH2，-NHOH，-NHNHR6，-C(O)R6，-SnR63，-B(OR6)2，-P(O)(OR6)2或選自C2-C6鏈烯基，C2-C6炔基，C4-C8鏈二烯基(所述基團(tuán)被0-2個(gè)R7取代)。
其中R6獨(dú)立地選自H，C1-C6烷基，C3-C7環(huán)烷基，芳基或C1-C6亞烷基-芳基(被0-5個(gè)選自F，-Cl，-Br，和-I的鹵素原子取代)；和R7獨(dú)立地選自NO2，-COOR6，-COR6，-CN，-OSiR63，-OR6和-NR62。
R8是H，C1-C6烷基，C2-C6鏈烯基，C2-C6炔基，C3-C7環(huán)烷基，芳基或C1-C6亞烷基-芳基(被0-3個(gè)獨(dú)立地選自-F，-Cl，-NO2，-R3，-OR3，-SiR33的取代基取代)R9是＝O，-F，-Cl，-Br，-I，-CN，-NO2，-OR6，-NR62，-NR6-C(O)R8，-NR6-C(O)OR8，-SR6，-S(O)R6，-S(O)2R6，-COOR6，-C(O)NR62和-S(O)2NR62。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，z是O或S，P是價(jià)鍵，Q是CH，B是CH2，和R1，R2，和R3是H。羰基基團(tuán)和Z之間的鍵可用含水I2斷裂。
可斷裂的接頭可斷裂的接頭可位于靶和固體支持物之間或可能的藥物候選物和標(biāo)識(shí)符區(qū)域之間或任何可確保包含來自成功復(fù)合物的密碼子的核酸序列與非特異性結(jié)合復(fù)合物分離的其它位置?？蓴嗔训慕宇^可以是可選擇性地?cái)嗔训?，即可選擇僅斷裂特定接頭的條件。
可斷裂的接頭可選自大量的化學(xué)結(jié)構(gòu)。接頭的例子包括，但不限于此，具有酶切割位點(diǎn)的接頭，包含化學(xué)可降解組分的接頭，可通過電磁輻射斷裂的接頭。
可通過電磁輻射(光)斷裂的接頭的例子o-硝基芐基 p-烷氧基 處于外位(exo position)上的o-硝基芐基 更詳細(xì)內(nèi)容參見Holmes CP.J.Org.Chem.1997，62，2370-23803-硝基苯基氧基
更詳細(xì)內(nèi)容參見 Rajasekharan Pillai，V.N.Synthesis.1980，1-26丹磺酰衍生物 更詳細(xì)內(nèi)容參見Rajasekharan Pillai，V.N.Synthesis.1980，1-26香豆素衍生物 更詳細(xì)內(nèi)容參見R.O.Schoenleber，B.Giese.Synlett 2003，501-504R1和R2可分別是可能的藥物候選物和標(biāo)識(shí)符。或者，R1和R2可分別是靶或固體載體。
R3＝H或OCH3如果X是O，那么產(chǎn)物可以是羧酸如果X是NH，產(chǎn)物可以是甲酰胺一個(gè)具體例子是PC Spacer亞磷酰胺(Glen research目錄#10-4913-90)，它可在合成過程中被引入寡核苷酸中和通過將樣品在水中經(jīng)受UV光(約300-350nm)30秒至1分鐘而斷裂。

DMT＝4，4′-二甲氧基三苯甲基iPr＝異丙基CNEt＝氰基乙基以上PC Spacer亞磷酰胺在標(biāo)識(shí)符和可能的藥物候選物之間的位置上被合適地引入復(fù)合物庫中。此間隔基可根據(jù)以下反應(yīng)而斷裂。
R1和R2可分別是被編碼分子和標(biāo)識(shí)分子中之一。在優(yōu)選方面，R2是寡核苷酸標(biāo)識(shí)符和R1是可能的藥物候選物。如果接頭被斷裂，那么生成磷酸酯基團(tuán)以允許進(jìn)一步生物學(xué)反應(yīng)。例如，磷酸酯基團(tuán)可位于寡核苷酸的5’端以允許進(jìn)行酶連接過程。
可通過化學(xué)劑而斷裂的接頭的例子酯接頭可通過使用如氫氧離子親核攻擊而斷裂。實(shí)際上，這通過將靶-配體復(fù)合物短時(shí)間暴露于堿而實(shí)現(xiàn)。
R1和R2可分別是可能的藥物候選物或標(biāo)識(shí)符中的一種。R4-6可以是任何以下基團(tuán)H，CN，F(xiàn)，NO2，SO2NR2。
二硫化物接頭可有效地通過三(2-羧基乙基)膦(TCEP)而斷裂/還原。TCEP在寬pH范圍內(nèi)選擇性地和完全還原甚至最穩(wěn)定的水溶性烷基二硫化物。這些還原作用在室溫下往往需要不足5分鐘。TCEP是一種非揮發(fā)性和無味還原劑和不同于大多數(shù)其它還原劑，它耐受空氣氧化。三烷基膦如TCEP在水溶液中穩(wěn)定，選擇性地還原二硫鍵，和基本上對(duì)通常存在于蛋白質(zhì)中的其它官能團(tuán)不起反應(yīng)。
二硫鍵還原的更多細(xì)節(jié)可參見Kirley，T.L.(1989)，用于隨后結(jié)構(gòu)分析的含半胱氨酸的蛋白質(zhì)的還原和熒光標(biāo)記，Anal.Biochem.180，231和Levison，M.E.，等人(1969)，水溶性膦對(duì)生物物質(zhì)的還原γ-球蛋白，Experentia 25，126-127。
可通過酶而斷裂的接頭連接可能的藥物候選物與標(biāo)識(shí)符或固體支持物和靶的接頭可包括能夠使用蛋白酶進(jìn)行特異性切割的肽區(qū)域。這在分子生物學(xué)中是一種熟知的技術(shù)。位點(diǎn)特異的蛋白酶和其同類的靶氨基酸序列常用于去除有助于增加融合蛋白質(zhì)的表達(dá)，溶解度，分泌或純化的融合蛋白質(zhì)標(biāo)簽。
各種蛋白酶可用于實(shí)現(xiàn)特異斷裂。如果斷裂位點(diǎn)與其它序列例如融合蛋白一起被提供，該特異性是尤其重要的。各種條件已被優(yōu)化以增加斷裂效率和控制特異性。這些條件是本領(lǐng)域可得的或已知的。
腸激酶是能夠切割特定氨基酸序列的酶(絲氨酸蛋白酶)的一個(gè)例子。腸激酶識(shí)別位點(diǎn)是Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)，它在Lys的C-端切割。純化重組物腸激酶是市售和在寬范圍的pH(pH 4.5-9.5)和溫度(4-45攝氏度)下有高度活性。
來自煙草刻蝕病毒(TEV)的核內(nèi)包涵體蛋白酶是可用于在特異氨基酸序列上切割的另一市售和得到很好表征的蛋白酶。TEV蛋白酶以高特異性在Gln-Gly或Gln-Ser之間斷裂序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser(ENLYFQG/S)。
另一熟知的蛋白酶是在Arg-Gly之間特異地?cái)嗔研蛄蠰eu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(LVPAGS)的凝血酶。凝血酶還用于重組物融合蛋白的斷裂。其它序列也可用于凝血酶斷裂；這些序列或多或少是特異性的且或多或少通過凝血酶有效地?cái)嗔?。凝血酶是一種高度活性蛋白酶且各種反應(yīng)條件為公眾所已知。
活化的凝血因子FX(FXa)也是一種已知的特異性和有用的蛋白酶。該酶斷裂序列Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)上的Arg的C-端。如果用重組物技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)，F(xiàn)Xa常用于融合蛋白之間的切割。其它識(shí)別序列也可用于FXa。
也可使用其它種類的能夠識(shí)別特定氨基酸序列的蛋白水解酶。另外，如果在復(fù)合物分子中僅接頭包含氨基酸序列，也可使用以非特異性方式斷裂氨基酸序列的蛋白水解酶。
也可使用其它種類的分子如核酶，催化活性抗體，或脂肪酶。唯一的先決條件是，催化活性分子可斷裂用作連接編碼區(qū)域和被展示的分子或連接固體支持物和靶的接頭，或用作接頭的一部分的特異性結(jié)構(gòu)。
可得到能夠識(shí)別和斷裂具有特定核苷酸序列的雙鏈核酸的各種核酸內(nèi)切酶。核酸內(nèi)切酶Eco RI是有效地切割包含序列GAATTC的核苷酸序列接頭(如果該序列接近核苷酸序列長度)的核酸酶的一個(gè)例子。純化重組物Eco RI是市售的和在多種緩沖劑條件內(nèi)有高度活性。例如，Eco RI可在如下所示各種程序中工作(NEBuffer可購自New EnglandBiolabs)NEBuffer 1[10mM Bis Tris丙烷-HCl，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇(pH 7.0在25℃)]，NEBuffer 2[50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇(pH 7.9在25℃)]，NEBuffer 3[100mM NaCl，50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇(pH 7.9在25℃)]，NEBuffer 4[50mM乙酸鉀，20mM Tris-乙酸鹽，10mM乙酸鎂，1mM二硫蘇糖醇(pH 7.9在25℃)]。
延伸緩沖劑mM KCl，20mM Tris-HCl(Ph 8.8，在25攝氏度下)，10mM (NH4)2SO4，2mM MgSO4和0.1％Triton X-100，和200μM dNTPs。
核苷酸用于本發(fā)明的核苷酸可在核苷酸序列，即寡核苷酸中被連接在一起。每個(gè)核苷酸單體通常由兩個(gè)部分，即核酸堿基(nucleobase)部分和主鏈組成。主鏈在某些情況下可被再分成糖部分和核苷間接頭。
核酸堿基部分可選自自然存在的核酸堿基以及非自然存在的核酸堿基。因此，″核酸堿基″不僅包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán)，而且包括雜環(huán)類似物和其互變異構(gòu)體。核酸堿基的說明性例子是腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，尿嘧啶，嘌呤，黃嘌呤，二氨基嘌呤，8-氧代-N6-甲基腺嘌呤，7-去氮黃嘌呤，7-去氮鳥嘌呤，N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶，N6，N6-橋亞乙基-2，6-二氨基-嘌呤，5-甲基胞嘧啶，5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，假異胞嘧啶，2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶，異胞嘧啶，異鳥嘌呤，次黃嘌呤核苷和描述于Benner等人，U.S.Pat No.5,432,272的″非自然存在的″核酸堿基。術(shù)語″核酸堿基″意味著包括這些例子以及其類似物和互變異構(gòu)體。尤其有意義的核酸堿基是腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，和尿嘧啶，它們被認(rèn)為是自然存在的核酸堿基。
以下給出核酸堿基的合適的特異性對(duì)的例子
天然堿基對(duì) 合成堿基對(duì) 與天然嘧啶配對(duì)的合成嘌呤堿
以下給出主鏈單元的合適例子(B表示核酸堿基) 主鏈的糖部分合適地是戊糖但可以是PNA或六-元環(huán)的合適部分?？赡芪焯堑暮线m例子包括核糖，2’-脫氧核糖，2’-O-甲基-核糖，2’-氟-核糖，和2’-4’-O-亞甲基-核糖(LNA)。合適地，核酸堿基連接到戊糖實(shí)體的1’位上。
如果主鏈的糖部分是戊糖，如核糖或2-脫氧核糖，核苷間接頭將前述單體的3’端連接至后繼的單體的5’端。核苷間鍵可以是天然存在的磷酸二酯鍵或其衍生物。這些衍生物的例子包括硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，氨基磷酸酯，磷酸三酯，和二硫代磷酸酯。另外，核苷間接頭可以是本領(lǐng)域已知的許多非含磷的接頭中的任何一種。
優(yōu)選的核酸單體包括通過磷酸二酯鍵連接的構(gòu)成DNA及RNA的家族一部分的自然存在的核苷。DNA系列的成員包括脫氧腺苷，脫氧鳥嘌呤核苷，脫氧胸腺嘧啶核苷，和脫氧胞苷。RNA系列的成員包括腺苷，鳥嘌呤核甙，尿嘧啶核苷，胞苷，和次黃嘌呤核苷。
選擇一旦庫已根據(jù)本文所公開的方法而進(jìn)行，必需從庫中篩選出具有預(yù)定想要的特性的那類化合物。預(yù)定想要的特性可包括結(jié)合至靶上，催化改變靶，與靶化學(xué)反應(yīng)以改變/修飾靶或該靶的官能活性，和共價(jià)連接至靶上(如在自殺抑制劑中)。除了如上所公開而制成的庫，按照以下方法A和B制成的庫可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行篩選。
A.展示分子可以是各個(gè)地和分開地被標(biāo)記的處于其最終“態(tài)”的單個(gè)化合物。如單個(gè)化合物可各個(gè)地連接到獨(dú)特標(biāo)簽上。每個(gè)獨(dú)特標(biāo)簽具有關(guān)于該特定化合物的信息，如結(jié)構(gòu)，分子量等。
B.展示分子可以是可被認(rèn)為處于其最終“態(tài)”的化合物的混合物。這些展示分子通常各個(gè)地和分開地被標(biāo)記，即化合物混合物中的每個(gè)單個(gè)化合物可連接到相同的標(biāo)簽上。另一標(biāo)簽可用于另一化合物混合物。每個(gè)獨(dú)特標(biāo)簽具有關(guān)于該特定混合物的信息，如在板上的空間位置。
靶可以是任何所關(guān)心的化合物。靶可以是蛋白質(zhì)，肽，碳水化合物，多糖，糖蛋白，激素，受體，抗原，抗體，病毒，底物，代謝物，過渡態(tài)模擬物，輔因子，抑制劑，藥物，染料，營養(yǎng)素，生長因子，細(xì)胞，組織，等，但不限于此。尤其優(yōu)選的靶包括，但不限于此，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，腎素，環(huán)加氧酶，5-脂肪氧化酶，IIL-10轉(zhuǎn)化酶，細(xì)胞因子受體，PDGF受體，II型次黃嘌呤核苷單磷酸脫氫酶，β-內(nèi)酰胺酶，和真菌細(xì)胞色素P-450。靶可包括，但不限于此，緩激肽，嗜中性白細(xì)胞彈性蛋白酶，HIV蛋白質(zhì)，包括tat，rev，gag，int，RT，核殼等，VEGF，bFGF，TGFβ，KGF，PDGF，凝血酶，茶堿，咖啡因，P物質(zhì)，IgE，sPLA2，紅血細(xì)胞，惡性膠質(zhì)瘤，纖維蛋白凝塊，PBMCs，hCG，植物凝血素，selectins，細(xì)胞因子，ICP4，補(bǔ)體蛋白質(zhì)，等。
該嚴(yán)格條件的程度的上限是包含展示分子和編碼區(qū)域的復(fù)合物的分解。篩選條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。
具有預(yù)定想要的特性的復(fù)合物可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法與該庫的其余部分分開，同時(shí)仍連接到核酸標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，需要的產(chǎn)物從整個(gè)庫中分離而所連接的核酸不會(huì)化學(xué)降解，使得標(biāo)識(shí)符核酸是可擴(kuò)增的。包含密碼子的標(biāo)識(shí)符部分可隨后被擴(kuò)增，要么仍連接到需要的化合物上或在從需要的化合物中分離之后。
在某些實(shí)施方案中，需要的展示分子作用于靶而連接到需要的顯示化合物上的編碼序列和靶之間沒有任何相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，需要的化合物結(jié)合至靶上，隨后通過許多方法將該復(fù)合物從未結(jié)合的產(chǎn)物中分離。這些方法包括塑料結(jié)合，硝基纖維素過濾器結(jié)合，柱色譜，過濾，親和性色譜，離心，和用于固定靶的其它熟知的方法。
簡要地，將庫經(jīng)受分配步驟，這可包括將庫和其上連接有靶的柱接觸。不編碼具有對(duì)靶的活性的反應(yīng)產(chǎn)物的所有的標(biāo)識(shí)符序列會(huì)通過該柱。其它的非所需化學(xué)實(shí)體(如，與其它靶交叉反應(yīng)的實(shí)體)可通過反選擇方法而去除。需要的復(fù)合物結(jié)合至柱上和可通過改變柱的條件(如，鹽，等)而洗脫或與需要的化合物連接的標(biāo)識(shí)符序列可直接被斷裂和洗脫。
在某些實(shí)施方案中，基本步驟包括將復(fù)合物庫與所關(guān)心的固定靶混合。靶可通過直接固定作用或利用抗體結(jié)合或其它高親和性相互作用連接到柱基質(zhì)或微滴定孔上。在另一實(shí)施方案中，靶和展示分子相互作用而不固定該靶。結(jié)合至靶上的展示的分子保留在該表面上，同時(shí)未結(jié)合的展示分子在單個(gè)或一系列洗滌步驟過程中被去除。結(jié)合至靶上的復(fù)合物的標(biāo)識(shí)符可隨后通過裂開與合成分子的物理連接而分離。在洗滌步驟之后或替代洗滌步驟而進(jìn)行色譜步驟可被認(rèn)為是有利的。在斷裂合成分子和標(biāo)識(shí)符之間的物理連接之后，標(biāo)識(shí)符可從介質(zhì)中被回收和任選地在解碼步驟之前擴(kuò)增。
在傳統(tǒng)洗脫程序中，難以規(guī)避由于亞最佳結(jié)合和洗滌條件而產(chǎn)生的假陽性且可需要精確地調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件。但難以得到超過100至1000的富集。用于本文實(shí)施例7的選擇過程緩和了與所得假陽性有關(guān)的問題，因?yàn)榉翘禺惤Y(jié)合復(fù)合物在相當(dāng)程度上留在反應(yīng)腔中。本文所報(bào)告的實(shí)驗(yàn)表明，可得到超過107的富集。
另外，與靶反應(yīng)的化合物可從不與靶反應(yīng)的那些產(chǎn)物中分離。在一個(gè)例子中，共價(jià)連接至靶上的化合物(如自殺抑制劑)可在非常嚴(yán)格的條件下洗滌。所得復(fù)合物可隨后用蛋白酶，DNA酶或其它合適的試劑處理以斷裂接頭和釋放與需要的化合物連接的核酸。所釋放的核酸可被擴(kuò)增。
在另一例子中，需要的產(chǎn)物的預(yù)定想要的特性是該產(chǎn)物轉(zhuǎn)移化學(xué)基團(tuán)(如?；D(zhuǎn)移)至靶上和這樣鈍化該靶的能力?？傻玫狡渲兴械漠a(chǎn)物具有硫代酯化學(xué)基團(tuán)，或類似活化化學(xué)基團(tuán)的產(chǎn)品庫。通過與靶接觸，需要的產(chǎn)物將化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)移至靶上，同時(shí)將需要的產(chǎn)物從硫代酯改變?yōu)榱虼?。因此，可鑒別目前是硫醇(而非硫代酯)的產(chǎn)物的分配方法可選擇需要的產(chǎn)物和擴(kuò)增與其有關(guān)的核酸。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知其它與本發(fā)明相容的分配和篩選方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)物可通過許多常見方法而分級(jí)分離并隨后分析每個(gè)級(jí)分的活性。分級(jí)分離方法可包括大小，pH，憎水性，等。
本方法所固有的是根據(jù)所需功能進(jìn)行化學(xué)實(shí)體的選擇；這可擴(kuò)展至對(duì)具有所需功能和特異性的小分子的選擇。特異性可在選擇過程中通過首先提取能夠與非所需″靶″相互作用(負(fù)選擇，或反選擇)的化合物的標(biāo)識(shí)符序列，隨后對(duì)所需靶進(jìn)行正選擇而獲得。例如，真菌細(xì)胞色素P-450的抑制劑已知在一定程度上與哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素P-450交叉反應(yīng)(導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用)。真菌細(xì)胞色素的高度特異性抑制劑可通過首先去除能夠與哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素相互作用的那些產(chǎn)物，隨后保留能夠與真菌細(xì)胞色素相互作用的剩余產(chǎn)物而從庫中選出。
富集本發(fā)明還涉及一種用于確定具有預(yù)選性質(zhì)的化學(xué)實(shí)體的身份的方法，包括步驟i)通過將獨(dú)特標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽附加至化學(xué)實(shí)體上而產(chǎn)生化學(xué)實(shí)體的經(jīng)標(biāo)記庫，ii)將該庫經(jīng)受一種條件，其中將具有預(yù)定性質(zhì)的化學(xué)實(shí)體或化學(xué)實(shí)體的亞集與該庫的剩余部分分離，iii)從該分離的庫中回收反標(biāo)簽，所述反標(biāo)簽?zāi)軌蚺c獨(dú)特標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽以特異的方式相互作用，和iv)通過解碼反標(biāo)簽而鑒定具有預(yù)選功能的化學(xué)實(shí)體。
標(biāo)簽通過合適的方法附加至化學(xué)實(shí)體上。尤其是，每個(gè)化學(xué)實(shí)體通過包括化學(xué)實(shí)體的反應(yīng)基團(tuán)和標(biāo)簽的反應(yīng)基團(tuán)之間化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)，如“選擇”章節(jié)的方法A和B而附加標(biāo)簽。化學(xué)實(shí)體可直接或通過橋接分子部分而連接。分子部分可以是能夠?qū)⒒瘜W(xué)實(shí)體連接至標(biāo)簽上的任何合適的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
反標(biāo)簽具有與獨(dú)特標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽以特異性方式相互作用的能力。反標(biāo)簽的化學(xué)結(jié)構(gòu)在較大程度上取決于對(duì)獨(dú)特標(biāo)簽的選擇。例如，如果獨(dú)特標(biāo)簽被選擇為抗體，那么反標(biāo)簽被選擇為能夠與抗體結(jié)合的表位。一般來說，優(yōu)選使用包含與獨(dú)特標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽互補(bǔ)的核苷酸序列的反標(biāo)簽。
該方法可在某些實(shí)施方案中無需擴(kuò)增而進(jìn)行。但如果希望較大的庫，一般優(yōu)選使用可擴(kuò)增的反標(biāo)簽。包含核苷酸序列的反標(biāo)簽可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如PCR擴(kuò)增。如果反標(biāo)簽是蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可通過連接已編碼其合成的mRNA，由mRNA生成cDNA并將所述mRNA經(jīng)受翻譯體系而擴(kuò)增。這些體系描述于WO 98/31700(其內(nèi)容在此通過參考并入本發(fā)明)。用于擴(kuò)增蛋白質(zhì)標(biāo)簽的另一方法是使用噬菌體展示的蛋白質(zhì)。
如果標(biāo)簽以及反標(biāo)簽是核酸序列，標(biāo)簽反標(biāo)簽雜交體可在該庫經(jīng)受分離條件之前或在分離步驟之后形成。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，優(yōu)選在分離步驟之前形成標(biāo)簽反標(biāo)簽雜交體以使所附加的核苷酸序列相對(duì)該體系惰性，因?yàn)槿藗兪熘?，核苷酸的某些序列可結(jié)合至靶上或催化化學(xué)反應(yīng)。
寡核苷酸反標(biāo)簽可按照各種方式形成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，反標(biāo)簽通過酶延伸反應(yīng)而形成。延伸包括，起始將引物退火至獨(dú)特標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽上和隨后使用聚合酶和dNTPs延伸該引物。也可考慮其它種類的延伸反應(yīng)。例如，連接酶可由二-或三核苷酸底物起始用于產(chǎn)生引物且延伸可使用合適的聚合酶而進(jìn)行。
可有益地在該過程的各種步驟回收反標(biāo)簽。為此，在本發(fā)明的一些方面優(yōu)選提供具有能夠結(jié)合至合適的親和性配偶者(partner)上的把手(handle)的引物。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可得到大量不同的把手和親和性配偶者。最廣泛使用的把手是生物素，它根據(jù)本發(fā)明一般也是優(yōu)選的。生物素結(jié)合親和性配偶者鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白。實(shí)驗(yàn)室中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是使用覆蓋有鏈霉抗生物素蛋白的固相回收已連接生物素的生化實(shí)體。合適地，固體相是珠粒，該珠?？稍谶B接作用之后通過旋轉(zhuǎn)或在固體珠粒包含磁性顆粒的情況下通過磁場而從液體中分離。
在本發(fā)明的其它方面，反標(biāo)簽作為單獨(dú)的寡核苷酸被提供。所述單獨(dú)的寡核苷酸可使用標(biāo)準(zhǔn)amidite合成技術(shù)而制成或可使用其它有用的方法而提供。一般優(yōu)選至少部分地通過合成而提供寡核苷酸，因?yàn)樯锼豠midite容易被引入新生寡核苷酸鏈中。在將寡核苷酸反標(biāo)簽加入包含用互補(bǔ)性寡核苷酸標(biāo)簽標(biāo)記的化學(xué)實(shí)體的液體之后，雙鏈庫作為獨(dú)特標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽和反標(biāo)簽寡核苷酸之間的雜交產(chǎn)物而形成。
如上所述，反標(biāo)簽寡核苷酸可具有能夠結(jié)合親和性配偶者，如鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白上的把手，如生物素。
在將反標(biāo)簽寡核苷酸加入標(biāo)記的化學(xué)實(shí)體中之后，存在于介質(zhì)中的一些寡核苷酸可能不會(huì)找到配偶者。在本發(fā)明的一個(gè)方面，優(yōu)選的是，沒有被雜交至同類的獨(dú)特標(biāo)識(shí)符和/或反標(biāo)簽上的寡核苷酸被轉(zhuǎn)化成雙螺旋。在本發(fā)明的其它方面，單鏈寡核苷酸在步驟ii)之前被降解以避免非所需的干擾。
把手可用于在分離步驟之前或之后純化該庫。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，純化步驟在分離步驟之前進(jìn)行以減少該體系的噪聲。在另一方面，把手在步驟 ii)之后用于純化分離的庫以回收可被擴(kuò)增的雙鏈產(chǎn)物。
庫經(jīng)受一種條件以選擇出具有對(duì)該條件有響應(yīng)的性質(zhì)的化學(xué)實(shí)體。該條件可包括將庫暴露于靶和分離對(duì)該靶具有親和性的化學(xué)實(shí)體。另一條件可以是將該庫暴露于底物和分離相對(duì)該底物具有催化活性的化學(xué)實(shí)體。
反標(biāo)簽可在分離步驟之后形成。在本發(fā)明的一個(gè)方面，用作標(biāo)簽的單鏈核苷酸被形成雙鏈，同時(shí)將化學(xué)實(shí)體連接到親和性分離的靶上。任選地，在重復(fù)的溫度循環(huán)中，多個(gè)反標(biāo)簽可作為延伸產(chǎn)物使用標(biāo)簽作為模板而形成。在本發(fā)明的另一方面，帶有單鏈寡核苷酸的化學(xué)實(shí)體從靶上脫離并隨后制備出互補(bǔ)性反標(biāo)簽。
如果反標(biāo)簽包含把手，該把手可用于純化分離的庫。反標(biāo)簽的回收隨后通過從分離的雙鏈庫中熔解所述反標(biāo)簽而進(jìn)行。任選地，反標(biāo)簽的量可通過常規(guī)擴(kuò)增技術(shù)，如PCR而增加。
根據(jù)本發(fā)明的方法可使用單個(gè)分離(partitioning)步驟而進(jìn)行。但通常優(yōu)選使用一個(gè)以上的分離步驟以從大的庫中選擇出具有所需性能的候選者。因此，回收的反標(biāo)簽可與起始庫或其子集混合且分離(步驟ii))和回收(步驟iii))的步驟可重復(fù)所需次數(shù)。任選地，混合物中的單鏈部分可如上所述被降解或去除或變得惰性。
一般，將在步驟ii)中得到的分離庫經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的接觸步驟，其中使用更加嚴(yán)格的條件。該嚴(yán)格的條件可通過增加溫度，鹽濃度，酸度，堿性，等而增加。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將分離的庫在重復(fù)的接觸步驟之前不經(jīng)受中間處理步驟。尤其，分離庫不經(jīng)受反標(biāo)簽的中間擴(kuò)增。該實(shí)施方案可在使用相對(duì)小的庫時(shí)有利。
本發(fā)明的方法終止于解碼步驟，即其中一個(gè)或多個(gè)化學(xué)實(shí)體的身份通過分析反標(biāo)簽被破譯的步驟。如果反標(biāo)簽是寡核苷酸，解碼步驟iv)可通過測序反標(biāo)簽核苷酸而進(jìn)行。各種用于測序的方法對(duì)熟練技術(shù)人員是顯然的，包括克隆的使用和對(duì)微陣列的暴露。
標(biāo)簽包含識(shí)別基團(tuán)如核苷酸序列，表位以及其它。標(biāo)簽攜帶其所連接的實(shí)體的信息，如實(shí)體結(jié)構(gòu)，質(zhì)量，空間位置(板信息)等。標(biāo)簽可由單克隆抗體，肽，蛋白質(zhì)，寡核苷酸，DNA，RNA，LNA，PNA，天然肽，非天然的肽，聚合物或低聚物肼基芳基和烷基羧酸，聚合物或低聚物氨基氧基芳基和烷基羧酸，類肽(peptoids)，其它天然聚合物或低聚物，非天然的聚合物(分子量＞1000Da)或低聚物(分子量＜1000Da)，小非聚合分子(分子量＜1000Da)或大非聚合分子(分子量＞1000Da)組成。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，實(shí)體由小的非聚合分子(分子量＜1000Da)組成。小分子一般是尋求藥物口服候選物時(shí)所關(guān)心的化合物。尤其，自然界不存在的小分子在藥物發(fā)現(xiàn)過程中是所關(guān)心的，而且在本發(fā)明的一個(gè)方面，該方法被設(shè)計(jì)成選擇口服藥物候選物。各種藥物候選物庫可在市場上得到。該庫的藥物候選物通常包含反應(yīng)基團(tuán)或可被改變成反應(yīng)基團(tuán)的基團(tuán)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，藥物候選物庫的每個(gè)成員通過庫成員的所述反應(yīng)基團(tuán)和核酸上的反應(yīng)基團(tuán)附加上核酸標(biāo)簽。優(yōu)選，核酸是寡核苷酸。
在本發(fā)明的另一方面，實(shí)體由大的非聚合分子(分子量＞1000Da)組成。在另一實(shí)施方案中，實(shí)體由聚合物分子組成。
標(biāo)簽和反標(biāo)簽可由連接至單克隆抗體，蛋白質(zhì)，LNA，PNA，天然多肽，非天然的多肽，聚合物或低聚物肼基芳基或烷基羧酸，聚合物或低聚物氨基氧基芳基或烷基羧酸，其它天然聚合物或低聚物，非天然的聚合物(分子量＞1000Da)或低聚物(分子量＜1000Da)，小非聚合分子(分子量＜1000Da)或大非聚合分子(分子量＞1000Da)上的RNA組成。
或者，反標(biāo)簽可由連接至單克隆抗體，蛋白質(zhì)，LNA，PNA，天然多肽，非天然多肽，聚合物或低聚物肼基芳基或烷基羧酸，聚合物或低聚物氨基氧基芳基或烷基羧酸，其它天然聚合物或低聚物，非天然的聚合物(分子量＞1000Da)或低聚物(分子量＜1000Da)，小非聚合分子(分子量＜1000Da)或大非聚合分子(分子量＞1000Da)上的DNA組成?；蛘撸礃?biāo)簽僅由寡核苷酸，DNA或RNA組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反標(biāo)簽由DNA組成。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案，反標(biāo)簽由RNA組成。
連接至DNA或RNA上的反標(biāo)簽也由連接至其上的該DNA/RNA編碼，如噬菌體展示或多核糖體展示的抗體，肽或蛋白質(zhì)，和通過反標(biāo)簽的DNA-模板化合成而編碼，其中DNA編碼在其合成過程中連接至其DNA上的反標(biāo)簽的合成。
每種化合物或每組化合物可通過形成共價(jià)或非共價(jià)鍵而與標(biāo)簽連接。對(duì)于共價(jià)鍵形成，標(biāo)記過程可包括，但不限于，形成環(huán)加成產(chǎn)物，烷基化產(chǎn)物，芳基化產(chǎn)物，?；a(chǎn)物，酰胺鍵，羧酸酯鍵，磺酰胺鍵，二硫鍵，S-烷基鍵，NR-烷基鍵，O-烷基鍵，芳基-乙烯基鍵，炔-乙烯基鍵，肟鍵，亞胺鍵，雙環(huán)產(chǎn)物，三唑，己烯，7-氧雜-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯衍生物，7-氮雜-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯衍生物或7-甲基-7-氮雜-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-烯。非共價(jià)鍵可包括，但不限于此，通過如氫鍵，van der Waals相互作用，π-堆積或通過雜交而連接。雜交可在DNA，RNA，PNA或LNA或其混合物的互補(bǔ)鏈之間。在這些情況下，標(biāo)簽和化合物都攜帶這種相互互補(bǔ)的鏈。標(biāo)記實(shí)體，化合物或化合物混合物可如通過實(shí)體的轉(zhuǎn)化或通過標(biāo)簽的轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)化成新標(biāo)記實(shí)體。轉(zhuǎn)化可通過化學(xué)或物理轉(zhuǎn)化如加入試劑(如氧化或還原劑，pH調(diào)節(jié)以及其它)或經(jīng)受UV-照射或熱而引起。
標(biāo)簽和反標(biāo)簽之間的復(fù)合物可在單個(gè)地標(biāo)記的實(shí)體上在標(biāo)記之后立即形成?；蛘?，在混合單個(gè)地標(biāo)記的實(shí)體之后，在任選地使用庫純化之前或之后，或在針對(duì)特定性能富集的庫之前或之后。
如果標(biāo)簽和反標(biāo)簽由核苷酸組成，該復(fù)合物由雙鏈核苷酸，如雙螺旋DNA或雜交DNA/RNA組成。
純化把手(表示為“@”)可連接至反標(biāo)簽上。純化把手包含識(shí)別基團(tuán)如核苷酸序列，表位，反應(yīng)基團(tuán)，高親和性配體以及其它。純化把手可由單克隆抗體，肽，蛋白質(zhì)，DNA，RNA，LNA，PNA，天然肽，非天然的肽，聚合物或低聚物肼芳基或烷基羧酸，聚合物或低聚物氨基氧基芳基或烷基羧酸，其它天然聚合物或低聚物，非天然的聚合物(分子量＞1000Da)或低聚物(分子量＜1000Da)，小非聚合分子(分子量＜1000Da)或大非聚合分子(分子量＞1000Da)組成。純化把手可以是如核苷酸序列，生物素，鏈霉抗生物素蛋白，抗生物素蛋白，“his-標(biāo)簽”，巰基基團(tuán)或二硫化物/活化二硫化物基團(tuán)。純化把手可以是反標(biāo)簽的一部分，如在反標(biāo)簽是基于核苷酸的或是例如其中抗體的一部分可用作另一抗體的表位的抗體(如用作純化過濾器的固定抗體)的情況下。
純化過濾器包含與純化把手連接，相互作用或反應(yīng)從而形成復(fù)合物的組分。該復(fù)合物允許不形成復(fù)合物的標(biāo)記實(shí)體和形成復(fù)合物的標(biāo)記實(shí)體的分離。純化過濾器包含識(shí)別基團(tuán)如核苷酸序列，表位，反應(yīng)基團(tuán)，高親和性配體以及其它。純化過濾器可由單克隆抗體，肽，蛋白質(zhì)，DNA，RNA，LNA，PNA，天然肽，非天然的肽，聚合物或低聚物肼基芳基或烷基羧酸，聚合物或低聚物氨基氧基芳基或烷基羧酸，其它天然聚合物或低聚物，非天然的聚合物(分子量＞1000Da)或低聚物(分子量＜1000Da)，小非聚合分子(分子量＜1000Da)或大非聚合分子(分子量＞1000Da)組成。純化過濾器可以是如核苷酸序列，生物素，鏈霉抗生物素蛋白，抗生物素蛋白，“his-標(biāo)簽”，巰基基團(tuán)或二硫化物/活化二硫化物基團(tuán)。
依據(jù)性質(zhì)探測和富集庫。性質(zhì)可以是親和性，催化活性或膜滲透能力以及其它。
擴(kuò)增可使用PCR或RTPCR技術(shù)。反標(biāo)簽在本發(fā)明的一些方面是可擴(kuò)增的。反標(biāo)簽可通過使用物理或化學(xué)方式，如UV-照射，熱，pH-調(diào)節(jié)，使用鹽溶液以及其它而與標(biāo)簽分離。
分離的標(biāo)記實(shí)體可通過其標(biāo)簽或反標(biāo)簽而鑒定。鑒定可通過克隆反標(biāo)簽和測序其DNA/RNA或通過對(duì)標(biāo)記實(shí)體或反標(biāo)簽或反標(biāo)簽/標(biāo)記實(shí)體的復(fù)合物的質(zhì)譜分析而實(shí)現(xiàn)。
標(biāo)記實(shí)體的庫可包括10-1020或10-1014或10-102或10-103或102-103或102-104或103-106或103-108或103-1010或103-1014或105-106或105-108或105-1010或105-1014或108-1014或1014-1020個(gè)實(shí)體。
標(biāo)記實(shí)體和反標(biāo)簽的庫復(fù)合物可依據(jù)性質(zhì)在純化之前通過使用純化把手和純化過濾器或在純化之后富集。
術(shù)語“獨(dú)特的”在與核苷酸序列一起使用時(shí)意味著，該序列的至少一個(gè)核酸堿基和/或主鏈實(shí)體不與不同的化學(xué)實(shí)體一起出現(xiàn)。優(yōu)選，特定序列是獨(dú)特的，因?yàn)闆]有其它化學(xué)實(shí)體與相同的核酸堿基序列相關(guān)。
一旦已形成庫，必須篩選出具有預(yù)定想要的特性的化合物的庫。預(yù)定想要的特性可包括連接至靶上，催化改變靶，與靶化學(xué)反應(yīng)以改變/修飾該靶或靶的功能活性，和共價(jià)連接至靶上(如在自殺抑制劑的情況下)。
靶可以是任何所關(guān)心的化合物。靶可以是蛋白質(zhì)，肽，碳水化合物，多糖，糖蛋白，激素，受體，抗原，抗體，病毒，底物，代謝物，過渡態(tài)類似物，輔因子，抑制劑，藥物，染料，營養(yǎng)素，生長因子，細(xì)胞，組織，等，但不限于此。尤其優(yōu)選的靶包括，但不限于此，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，腎素，環(huán)加氧酶，5-脂肪氧化酶，IIL-10轉(zhuǎn)化酶，細(xì)胞因子受體，PDGF受體，II型次黃嘌呤核苷單磷酸脫氫酶，β-內(nèi)酰胺酶，和真菌細(xì)胞色素P-450。靶可包括，但不限于此，緩激肽，嗜中性白細(xì)胞彈性蛋白酶，HIV蛋白質(zhì)，包括tat，rev，gag，int，RT，核殼等，VEGF，bFGF，TGFβ，KGF，PDGF，凝血酶，茶堿，咖啡因，P物質(zhì)，IgE，sPLA2，紅血細(xì)胞，惡性膠質(zhì)瘤，纖維蛋白凝塊，PBMCs，hCG，植物凝血素，selectins，細(xì)胞因子，ICP4，補(bǔ)體蛋白質(zhì)，等。
庫篩選時(shí)的嚴(yán)格條件通常局限于使得在標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽和反標(biāo)簽之間保持雜交的那些條件。但可采用高嚴(yán)格條件，隨后重新合成或連接反標(biāo)簽。篩選條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。
具有預(yù)定想要的特性的化合物可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法與該庫的剩余部分分開，同時(shí)仍連接到核酸標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，想要的產(chǎn)物從整個(gè)庫中分開而所連接的核酸沒有化學(xué)降解，使得標(biāo)識(shí)符核酸是可擴(kuò)增的。標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽可隨后被擴(kuò)增，此時(shí)或者仍連接到想要的化合物上或在從想要的化合物中分離之后。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，想要的化合物作用于靶而連接到想要的化合物上的標(biāo)簽和靶之間沒有任何相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，想要的化合物結(jié)合至靶上且結(jié)合的標(biāo)簽-所需化合物-靶復(fù)合物可通過許多方法從未結(jié)合的產(chǎn)物中分開。這些方法包括硝基纖維素過濾器結(jié)合，柱色譜，過濾，親和性色譜，離心，和其它熟知的方法。
簡要地，將庫經(jīng)受分離(partitioning)步驟，這可包括將庫和其上連接有靶的柱接觸。沒有與化學(xué)實(shí)體-標(biāo)簽聚集體形成雜交產(chǎn)物的所有標(biāo)簽或與非所需化學(xué)實(shí)體連接的那些標(biāo)簽可通過該柱。其它的非所需化學(xué)實(shí)體(如，與其它靶相互反應(yīng)的實(shí)體)可通過反選擇方法而去除。想要的復(fù)合物連接至柱上和可通過改變柱的條件(如，鹽，等)而洗脫或與想要的化合物連接的標(biāo)簽可直接被斷裂和洗脫。
或者，與靶反應(yīng)的化合物可和不與靶反應(yīng)的那些產(chǎn)物分離。在一個(gè)例子中，共價(jià)連接至靶上的化合物(如自殺抑制劑)可在非常嚴(yán)格的條件下洗滌。所得復(fù)合物可隨后用蛋白酶，DNA酶或其它合適的試劑處理以斷裂接頭和釋放與想要的化合物連接的核酸。所釋放的核酸可被擴(kuò)增。
在另一例子中，想要的產(chǎn)物的預(yù)定想要的特性是該產(chǎn)物轉(zhuǎn)移化學(xué)基團(tuán)(如?；D(zhuǎn)移)至靶上和這樣鈍化該靶的能力?？傻玫狡渲兴械漠a(chǎn)物具有硫代酯化學(xué)基團(tuán)的產(chǎn)品庫。通過與靶接觸，想要的產(chǎn)物將化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)移至靶上，同時(shí)將想要的產(chǎn)物從硫代酯改變?yōu)榱虼肌Ｒ虼?，可鑒別目前是硫醇(而非硫代酯)的產(chǎn)物的分離方法可選擇想要的產(chǎn)物和擴(kuò)增與其有關(guān)的核酸。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知其它與本發(fā)明相容的分離和篩選方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)物可通過許多普通方法而分級(jí)分離并隨后分析每個(gè)級(jí)分的活性。分級(jí)分離方法可包括大小，pH，憎水性，等。
本方法包括根據(jù)所需功能進(jìn)行化學(xué)實(shí)體的選擇；這可擴(kuò)展至對(duì)具有所需功能和特異性的小分子的選擇。特異性可在選擇過程中通過首先提取能夠與非所需″靶″相互作用(負(fù)選擇，或反選擇)的化合物的標(biāo)識(shí)符序列，隨后用所需靶進(jìn)行正選擇而獲得。例如，真菌細(xì)胞色素P-450的抑制劑已知在一定程度上與哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素P-450相互反應(yīng)(導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用)。真菌細(xì)胞色素的高度特異性抑制劑可通過首先去除能夠與哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素相互作用的那些產(chǎn)物，隨后保留能夠與真菌細(xì)胞色素相互作用的剩余產(chǎn)物而從庫中選出。
在選擇步驟之后，回收反標(biāo)簽?；厥湛赏ㄟ^將所選的復(fù)合物經(jīng)受嚴(yán)格條件以使反標(biāo)簽序列從標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽上脫離而進(jìn)行。如果標(biāo)簽和反標(biāo)簽是核酸，嚴(yán)格條件可通過逐漸增加溫度直至雙螺旋的兩個(gè)鏈融解開而增加。反標(biāo)簽序列的另外復(fù)本可通過使用合適的引物和聚合酶延伸標(biāo)識(shí)符序列而提供?；蛘?，回收的反標(biāo)簽序列和/或標(biāo)識(shí)符序列標(biāo)簽可經(jīng)受PCR以形成雙鏈產(chǎn)物。包含與至少一部分獨(dú)特的標(biāo)識(shí)符序列互補(bǔ)的序列的鏈隨后被分離。
所選的化學(xué)實(shí)體可在延伸或擴(kuò)增過程中連接至靶上或可從靶上脫離。在本發(fā)明的一個(gè)方面，優(yōu)選的是，靶被固定而且化合物在延伸或擴(kuò)增過程中保持連接到靶上，這樣容易通過簡單的洗脫而回收延伸或擴(kuò)增產(chǎn)物。另一方面，所選的化學(xué)實(shí)體在回收富集序列之前，同時(shí)或之后與獨(dú)特的標(biāo)識(shí)符序列分離。
為了回收所需反標(biāo)簽序列，可合適地給自然的以及擴(kuò)增的(如果存在)反標(biāo)簽序列提供分子親和性對(duì)的一方。所述分子親和性對(duì)的一方在本文中也被稱作把手。反標(biāo)簽可隨后通過使用可分離的連接到固體相上的分子親和性對(duì)的另一方而回收。分子親和性對(duì)的基本性能是，這兩方能夠相互作用以組裝成分子親和性對(duì)。在生物技術(shù)領(lǐng)域中，各種相互作用分子部分已知可用作分子親和性對(duì)。例子包括，但是不限制至蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)-多糖相互作用，RNA-蛋白質(zhì)相互作用，DNA-DNA相互作用，DNA-RNA相互作用，RNA-RNA相互作用，生物素-鏈霉抗生物素蛋白相互作用，酶-配體相互作用，抗體-配體相互作用，蛋白質(zhì)-配體相互作用，等。
合適的分子親和性對(duì)是生物素-鏈霉抗生物素蛋白。反標(biāo)簽序列可如通過在擴(kuò)增或延伸步驟中使用連接到生物素部分上的引物和將生物素標(biāo)記的反標(biāo)簽序列與涂有鏈霉抗生物素蛋白的珠粒接觸而提供生物素。
在回收反標(biāo)簽序列之后，將這些與起始庫或其部分接觸并通過將反標(biāo)簽序列雜交至獨(dú)特標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽的同類的序列上而能夠形成富集庫。
根據(jù)本發(fā)明的方法可重復(fù)一次或多次。在該方法的第二輪中，不被反標(biāo)簽序列識(shí)別的那部分單鏈庫可從反應(yīng)介質(zhì)中被清除或單鏈庫的剩余部分可留在與富集庫的混合物中。一般來說，在富集的雙鏈庫進(jìn)行與靶的第二次接觸之前無需將單鏈庫的剩余部分從介質(zhì)中分離，因?yàn)橛糜陬A(yù)選功能的條件通常比第一輪更嚴(yán)格，因此單鏈庫的成員估計(jì)不結(jié)合靶。但為了減少該體系的噪聲，可在某些情況下有用地從介質(zhì)中取出不與反標(biāo)簽序列相配的單鏈起始庫的成員。如果反標(biāo)簽序列提供有分子親和性對(duì)的一方，如生物素，那么所關(guān)心的化合物可通過用固定鏈霉抗生物素蛋白，如涂有鏈霉抗生物素蛋白的珠粒處理而從介質(zhì)中提取。
如上所述，用于進(jìn)行第二或進(jìn)一步選擇步驟的條件一般比第一或先前步驟更嚴(yán)格。在順序選擇輪中不斷增加的嚴(yán)格條件有利于形成在數(shù)目上變窄但在所需性質(zhì)上被富集的化合物的子庫。
在本說明書和權(quán)利要求中，術(shù)語核酸，寡核苷酸，oligo，和核苷酸頻繁地使用。術(shù)語核苷酸，核苷酸單體，或單核苷酸用于表示通常由兩部分，即核酸堿基部分和主鏈組成的化合物。主鏈在一些情況下可被再分為糖部分和核苷間接頭。單核苷酸可相互連接以形成寡核苷酸。通常，單核苷酸通過核苷間鍵而連接。術(shù)語核酸包括單核苷酸以及寡核苷酸。但該術(shù)語通常表示具有2至30個(gè)通過核苷間接頭連接在一起的單核苷酸的寡核苷酸。
確定雙功能復(fù)合物的編碼部分測定存在于分離的雙功能分子或分離的標(biāo)識(shí)符寡核苷酸中的標(biāo)識(shí)符序列的編碼部分以鑒別參與形成展示分子的化學(xué)實(shí)體。如果可從標(biāo)識(shí)符寡核苷酸推導(dǎo)出有關(guān)功能實(shí)體以及它們被引入展示分子時(shí)的時(shí)間點(diǎn)的信息，那么可確立展示分子的合成方法。獲得有關(guān)已參與展示分子的各種化學(xué)實(shí)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)的信息可由于在形成過程中的結(jié)構(gòu)限制而足以推導(dǎo)出完整分子。例如，不同種類的連接化學(xué)的使用可確保構(gòu)件上的化學(xué)實(shí)體僅可被轉(zhuǎn)移至支架上的單個(gè)位置。另一種類的化學(xué)限制可由于支架分子或所要轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體上的位阻而存在。但一般優(yōu)選的是，該信息可由能夠鑒定已參與形成被編碼分子的每種化學(xué)實(shí)體以及該化學(xué)實(shí)體已被引入(新生)展示分子的合成歷史中的時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)識(shí)符序列推斷。
盡管常規(guī)DNA測序方法容易得到且可用于該確定，但分離的雙功能分子的量和質(zhì)量可需要在測序反應(yīng)之前的附加操作。
如果該量低，優(yōu)選通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)使用被針對(duì)存在于標(biāo)識(shí)符序列中的引物結(jié)合位點(diǎn)的PCR引物而增加標(biāo)識(shí)符序列的量。
另外，分離的雙功能分子的質(zhì)量可能是這樣的雙功能分子的多種種類利用結(jié)合靶的類似能力而共分離。如果分離了一種以上的雙功能分子，不同的分離種類必須在標(biāo)識(shí)符寡核苷酸的測序之前分離。
因此在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的雙功能復(fù)合物的不同的標(biāo)識(shí)符序列在通過DNA測序方法確定其序列之前被克隆到不同的測序載體中。這通常通過本文所述的PCR擴(kuò)增所有的不同的標(biāo)識(shí)符序列，并隨后使用該擴(kuò)增產(chǎn)物上的獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)將擴(kuò)增片段定向性地克隆到測序載體中而實(shí)現(xiàn)。擴(kuò)增片段的克隆和測序是一個(gè)可通過本領(lǐng)域已知的許多分子生物方法中的任何方法進(jìn)行的常規(guī)程序。
或者，雙功能復(fù)合物或PCR擴(kuò)增的標(biāo)識(shí)符序列可在微陣列中分析。該陣列可被設(shè)計(jì)成分析單個(gè)密碼子或多個(gè)密碼子在標(biāo)識(shí)符序列中的存在。
核酸的合成寡核苷酸可通過各種熟知的化學(xué)而合成。為了以3′至5′的方向在基質(zhì)上合成寡核苷酸，需要可根據(jù)需要方便地被封端或解封端的游離羥基末端。優(yōu)選的羥基末端封端基團(tuán)是二甲氧基三苯甲基醚(DMT)。DMT封端的末端首先被解封，例如用在二氯甲烷(DCM)中的3％二氯乙酸處理，這是寡核苷酸合成所熟知的，這樣形成游離羥基末端。
用于以3′至5′的方向加到游離羥基末端上的前體形式的核苷酸需要一個(gè)在核苷酸的3′末端上具有氨基二異丙基側(cè)鏈的氨基磷酸酯部分。另外，氨基磷酸酯的游離羥基用氰基乙基酯(OCNET)封端，和5′末端用DMT醚封端。5′DMT-，3′OCNET-封端的氨基磷酸酯核苷酸至游離羥基上的添加需要在乙腈中的四唑，隨后進(jìn)行碘氧化并將未反應(yīng)的羥基用乙酸酐封端，這是寡核苷酸合成所熟知的。所得產(chǎn)物包含具有DMT封端的5′末端的添加的核苷酸殘基，備用于如前所述的隨后的封端核苷酸的解封和添加。
為了在5’至3′的方向上合成寡核苷酸，如前所述需要一個(gè)在接頭上的游離羥基末端。但所要添加的封端核苷酸具有在其5′和3′末端上相反的封端化學(xué)以有助于在相反的取向上的添加。具有游離3′羥基和5′DMT醚的核苷酸首先在3′羥基末端上通過與TBS-C1在咪唑中反應(yīng)形成在3′末端上的TBS酯而封端。隨后將DMT-封端5′末端如前所述用在DCM中的DCA解封，形成游離5′羥基末端。具有氨基二異丙基基團(tuán)和OCNET酯的試劑(N，N-二異丙基氨基)(氰基乙基)phosphonamidic chloride在四氫呋喃(THF)中與5′解封核苷酸反應(yīng)形成在5′末端上的氨基二異丙基-，OCNET-封端氨基磷酸酯基團(tuán)。然后將3′TBS酯用在DCM中的氟化四丁基銨(TBAF)去除，以形成具有氨基磷酸酯-封端的5′末端和游離3′羥基末端的核苷酸。在堿中與DMT-Cl的反應(yīng)向3′羥基末端上加成一個(gè)DMT醚封端基團(tuán)。
3′DMT-，5′OCNET-封端的氨基磷酸酯化核苷酸至具有游離羥基末端的接頭基質(zhì)上的添加隨后使用以前四唑反應(yīng)而進(jìn)行，這是寡核苷酸聚合反應(yīng)所熟知的。所得產(chǎn)物包含具有DMT-封端的3′末端的添加核苷酸殘基，備用于如前所述的使用DCA(在DCM中)的解封和隨后封端核苷酸的添加。
附圖的簡要描述圖1顯示標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件的組分圖2顯示通過延伸而編碼的原理圖3顯示構(gòu)件的延伸區(qū)域圖4顯示具有內(nèi)部密碼子的標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件的組分圖5顯示通過使用特異退火的延伸而編碼的原理圖6顯示支架起來的分子(scaffolded molecules)和聚合物分子的編碼圖7顯示通過使用三鏈組裝原理延伸而編碼圖8顯示通過使用三鏈組裝原理(使用特異退火)延伸而編碼圖9顯示使用固相方案的三鏈標(biāo)識(shí)符展示的分子的合成。
圖10顯示使用平臺(tái)組裝的順序反應(yīng)/延伸。
圖11公開了一種用于交替平行合成組合庫的一般方案。
圖12公開了一種使用連接編碼和游離反應(yīng)物的編碼方法。
圖13公開了一種庫產(chǎn)生方法，其中反應(yīng)之后進(jìn)行編碼步驟。
圖14公開了一種使用聚合酶編碼的庫生成方法。
圖15公開了用于單編碼方法的各種實(shí)施方案。
圖16公開了雙編碼方法。
圖17公開了各種雙編碼方法。
圖18公開了使用環(huán)形構(gòu)件的編碼。
圖19公開了一種方法，其中柔性接頭用于構(gòu)件中。
圖20公開了一種凝膠，顯示根據(jù)實(shí)施例6的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖21公開了一種三重編碼方法。
圖22具有用于實(shí)施例9的設(shè)置。
圖23顯示用于實(shí)施例9的分開-和-混合結(jié)構(gòu)。
圖24公開了庫富集，擴(kuò)增和鑒定的一個(gè)實(shí)施方案。
圖25顯示一個(gè)實(shí)施方案，其中不雜交至標(biāo)識(shí)符序列上的反標(biāo)簽序列變成雙鏈和因此惰性。
圖26顯示一個(gè)實(shí)施方案，其中富集步驟在純化步驟之前。
圖27顯示庫富集，擴(kuò)增，和鑒定的一般原理。
圖28顯示庫富集，擴(kuò)增，和鑒定的一般原理，省略了在隨后富集程序之間的中間擴(kuò)增步驟。
圖29顯示庫富集，擴(kuò)增，和鑒定的一般原理，其中起始單鏈庫在富集之前變成雙鏈。
圖30顯示用于庫富集的一般原理，其中反標(biāo)簽直到一個(gè)或多個(gè)富集過程之后才形成。
圖31顯示在實(shí)施例13中報(bào)道的兩種凝膠。
圖32顯示在實(shí)施例14中報(bào)道的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖33顯示在實(shí)施例14中報(bào)道的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
附圖的詳細(xì)描述圖1在圖片A中公開了一種在新生雙功能復(fù)合物和構(gòu)件之間的雜交產(chǎn)物。新生雙功能復(fù)合物(簡稱標(biāo)識(shí)符)包含通過接頭部分連接至寡核苷酸標(biāo)識(shí)符區(qū)域上的連接實(shí)體(attachment entity)。連接實(shí)體可以是已適應(yīng)接收功能實(shí)體的單個(gè)接受性反應(yīng)基團(tuán)或可以是包含一個(gè)或多個(gè)接受性反應(yīng)基團(tuán)的支架結(jié)構(gòu)。在圖片A中，連接實(shí)體被表示為具有四個(gè)能夠接受功能實(shí)體的反應(yīng)基團(tuán)的支架。
構(gòu)件包含連接到寡核苷酸上的功能實(shí)體，該寡核苷酸與標(biāo)識(shí)符區(qū)域足夠互補(bǔ)以允許形成雜交產(chǎn)物。功能實(shí)體能夠通過化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)移至連接實(shí)體?；パa(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域進(jìn)一步在其3’或5’端包含獨(dú)特密碼子。獨(dú)特密碼子以一種明確的方式標(biāo)識(shí)功能實(shí)體。
在形成標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件之間的雜交產(chǎn)物之后，功能實(shí)體和獨(dú)特反密碼子被轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符上。在本發(fā)明的一個(gè)方面，連接功能實(shí)體和互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域的接頭在與連接實(shí)體反應(yīng)的同時(shí)被斷裂，導(dǎo)致功能實(shí)體轉(zhuǎn)移至連接實(shí)體上。在轉(zhuǎn)移之前，同時(shí)或之后，發(fā)生密碼子的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄通過一種能夠使用模板寡核苷酸使寡核苷酸聚合或低聚的酶而進(jìn)行，以形成互補(bǔ)性鏈。通常聚合酶，如Pfu聚合酶與合適的dNTPs，即ATP，CTP，GTP，和TTP的混合物一起使用，使用構(gòu)件的獨(dú)特反密碼子作為模板而延伸標(biāo)識(shí)符鏈，形成獨(dú)特密碼子。
圖1，圖片B說明一種用于功能實(shí)體的第二次轉(zhuǎn)移的典型設(shè)置。標(biāo)識(shí)符已提供有第一功能實(shí)體和已延伸了一個(gè)密碼子。另外，該密碼子隨著密碼子的延伸還包含結(jié)合區(qū)域。結(jié)合區(qū)域通常是通過第一構(gòu)件在第一轉(zhuǎn)移周期中被轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符上的恒定區(qū)域。標(biāo)識(shí)符與第二構(gòu)件形成雜交產(chǎn)物。第二構(gòu)件包含連接至寡核苷酸上的第二功能實(shí)體，該寡核苷酸與標(biāo)識(shí)符的標(biāo)識(shí)符區(qū)域足夠互補(bǔ)以進(jìn)行雜交。一部分互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域包含非編碼區(qū)域和與結(jié)合區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域。非編碼區(qū)域與在第一周期中被轉(zhuǎn)移的密碼子相對(duì)且互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域與結(jié)合區(qū)域互補(bǔ)以允許雜交足夠強(qiáng)地使酶能結(jié)合至螺旋上。第二獨(dú)特反密碼子連接到互補(bǔ)性連接區(qū)域上和標(biāo)識(shí)第二功能實(shí)體。第二密碼子使用第二反密碼子作為模板按照以上所述的第一密碼子的相同的方式轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符上。
圖2說明功能實(shí)體和密碼子轉(zhuǎn)移的四個(gè)周期。在第一周期中，雜交產(chǎn)物在標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件之間形成。雜交產(chǎn)物確保功能實(shí)體和支架緊密地空間接近，這樣增加發(fā)生反應(yīng)的可能性。在兩個(gè)寡核苷酸之間的雙螺旋的形成也提供聚合酶的結(jié)合區(qū)域。在聚合酶，dNTPs混合物和合適的緩沖劑如包含20mM HEPES-KOH，40mM KCl和8mM MgCl2和pH調(diào)節(jié)至7，4的水溶液的存在下，獨(dú)特反密碼子(UA1)作為密碼子被轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符上。
在分別轉(zhuǎn)移功能實(shí)體和密碼子之后，將用過的構(gòu)件通過增加嚴(yán)格性而與標(biāo)識(shí)符分離。通常，嚴(yán)格性通過增加溫度，改變pH或通過增加離子強(qiáng)度而增加。在雙螺旋結(jié)構(gòu)破裂之后，標(biāo)識(shí)符被回收。在本發(fā)明的一個(gè)方面，標(biāo)識(shí)符被固定以便于與用過的構(gòu)件分離。在另一方面，用過的構(gòu)件被化學(xué)或酶方式降解。在回收標(biāo)識(shí)符之后，新周期可可通過將標(biāo)識(shí)符與另一構(gòu)件接觸而開始。
在四個(gè)轉(zhuǎn)移周期之后的最終產(chǎn)物是雙功能復(fù)合物，它包含在一端上的反應(yīng)產(chǎn)物和在另一端上的編碼區(qū)域。反應(yīng)產(chǎn)物包含來自轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體和起始支架的成分。編碼區(qū)域包含何種實(shí)體已按照何種順序被轉(zhuǎn)移的遺傳密碼。因此，合成歷史可由編碼區(qū)域解碼。
圖3顯示編碼區(qū)域的設(shè)計(jì)的例子。圖片A，描繪了根據(jù)圖1，圖片B的設(shè)計(jì)的一個(gè)例子的詳細(xì)圖。在第一周期中被轉(zhuǎn)移的獨(dú)特密碼子與部分錯(cuò)配區(qū)域相對(duì)。為了補(bǔ)償親和性的下降，在該密碼子之后跟有結(jié)合區(qū)域。結(jié)合區(qū)域與構(gòu)件的匹配互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域相對(duì)。
在圖3，圖片B中，在第一周期中被引入的獨(dú)特密碼子與已在互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域中引入中性結(jié)合區(qū)域的第二構(gòu)件相對(duì)。中性結(jié)合區(qū)域不能夠辨別各種獨(dú)特密碼子，但能夠?qū)γ糠N密碼子顯示某種親和性。通常，中性結(jié)合區(qū)域包含一個(gè)或多個(gè)通用堿基且更優(yōu)選的中性結(jié)合區(qū)域包含與標(biāo)識(shí)符上的至少一部分密碼子區(qū)域相對(duì)的通用堿基的序列。
圖4顯示標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件之間的雜交產(chǎn)物，其中標(biāo)識(shí)符具有內(nèi)部密碼子而且構(gòu)件具有相應(yīng)的反密碼子。標(biāo)識(shí)符區(qū)域和互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域也可分別包含特異獨(dú)特密碼子和反密碼子。
當(dāng)預(yù)期進(jìn)行幾輪選擇時(shí)，尤其當(dāng)編碼分子由前輪的PCR產(chǎn)物形成時(shí)，內(nèi)部密碼子的用途是特別重要的。構(gòu)件中的內(nèi)部反密碼子可完全或部分匹配標(biāo)識(shí)符序列或可包含一個(gè)或多個(gè)通用堿基以提供親和性而非特異性。內(nèi)部獨(dú)特密碼子的作用是僅引導(dǎo)標(biāo)識(shí)符分子和構(gòu)件分子之間的退火。正確的編碼由在延伸過程中產(chǎn)生的獨(dú)特密碼子負(fù)責(zé)。這些獨(dú)特密碼子行進(jìn)到下一代分子處并用于解碼被展示的分子的合成歷史。該體系不完全依賴于該內(nèi)部獨(dú)特密碼子的精確的編碼功能以使正確的基因型傳遞至下一代的標(biāo)識(shí)符分子。
在圖片A中雜交產(chǎn)物在功能實(shí)體和連接實(shí)體之間提供空間接近性，因此增加發(fā)生反應(yīng)的可能性。獨(dú)特密碼子通過酶延伸反應(yīng)而在標(biāo)識(shí)符序列上模板合成密碼子。在圖片B中，結(jié)合區(qū)域被引入每個(gè)獨(dú)特的編碼序列之間以提供兩條鏈相互的親和性，即使一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配堿基出現(xiàn)在以前使用的密碼子的密碼子非編碼區(qū)域中。
圖5給出了一種當(dāng)擴(kuò)增步驟被包括在選擇之間時(shí)有用的實(shí)施方案。起始，復(fù)合物庫如圖2所示而制成。該復(fù)合物庫可經(jīng)受選擇過程。選擇過程可包括將復(fù)合物上的展示分子提供給靶和隨后選擇對(duì)該靶表現(xiàn)出所需相互作用的展示分子?？稍谶x擇過程中有利地使用相對(duì)溫和的條件，以得到子庫。子庫可被解碼以得到有關(guān)整個(gè)子庫的合成歷史的信息。但通常優(yōu)選在進(jìn)行解碼之前進(jìn)一步減少子庫。
子庫可通過將它再次暴露于靶并使用更嚴(yán)格的條件而減少。但為了在第二選擇之前得到較高數(shù)目的每種子庫成員，一般優(yōu)選擴(kuò)增該復(fù)合物。因此，將加載有支架的引物首先在編碼區(qū)域的一端退火至引物位置。隨后形成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。優(yōu)選存在反向引物以得到具有連接其上的支架的雙鏈PCR產(chǎn)物。
該P(yáng)CR是用于生成子庫的擴(kuò)增作用的基礎(chǔ)。標(biāo)識(shí)符序列被分隔成許多內(nèi)部獨(dú)特密碼子，在附圖中簡稱IUC。IUCs的數(shù)目對(duì)應(yīng)于參與形成展示分子的功能實(shí)體的數(shù)目。IUCs的序列表達(dá)各個(gè)功能實(shí)體的身份且IUCs的順序表示功能實(shí)體的反應(yīng)的順序。優(yōu)選，引物區(qū)域被提供在IUCs序列的附近以允許隨后擴(kuò)增該核酸序列。
子庫與多個(gè)包含可轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體和對(duì)至少一個(gè)IUCs互補(bǔ)的內(nèi)部獨(dú)特反密碼子(IUA)的構(gòu)件接觸?；パa(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域具有足夠的互補(bǔ)性以允許與寡核苷酸標(biāo)識(shí)符區(qū)域的雜交。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，不標(biāo)識(shí)所要轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體的IUCs在互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域中與中性結(jié)合區(qū)域相對(duì)。如上所述，中性結(jié)合區(qū)域可包含通用堿基，即能夠與兩種或多種自然存在的核酸堿基配對(duì)的堿基。鄰近包含特異堿基配對(duì)的序列和非特異堿基配對(duì)的序列的區(qū)域，即互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域的是獨(dú)特反密碼子(UA)。UA包含與互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域的IUA相同的信息，典型地，UA和IUA具有相同的核苷酸序列。
轉(zhuǎn)移步驟和反應(yīng)步驟如上所述在幾個(gè)周期中進(jìn)行以形成雙功能復(fù)合物。在圖5中進(jìn)行四個(gè)周期，但可理解，進(jìn)行較少的周期，如3或2個(gè)周期以生產(chǎn)包含分別來自3或2種功能實(shí)體的組分的反應(yīng)產(chǎn)物。還可進(jìn)行四個(gè)以上的周期，如5至20個(gè)周期以形成更多樣的展示分子庫。得自這些周期的復(fù)合物是功能實(shí)體和支架之間的反應(yīng)產(chǎn)物，和寡核苷酸。寡核苷酸可被分成引導(dǎo)區(qū)域，即，引導(dǎo)各個(gè)構(gòu)件的退火的區(qū)域，和包含已從構(gòu)件轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符上的獨(dú)特密碼子的編碼區(qū)域。
使用以上編碼方法，能夠擴(kuò)增越來越聚焦的子庫，得到足夠量的能夠解碼的材料。
圖6所示的編碼方法可產(chǎn)生單體和聚合物編碼的分子。圖片A復(fù)合物反應(yīng)產(chǎn)物可使用已與多個(gè)功能實(shí)體反應(yīng)的連接實(shí)體而產(chǎn)生。圖片B聚合物可使用一種連接實(shí)體而產(chǎn)生，后者具有一個(gè)能夠與具有至少兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的功能實(shí)體連接的反應(yīng)基團(tuán)。
圖7說明一個(gè)用于通過延伸原理編碼的三鏈組裝程序。A標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件可在組裝平臺(tái)上組合。該組裝平臺(tái)包含獨(dú)特反密碼子區(qū)域和獨(dú)特反密碼子，其中這些兩個(gè)成分直接通過其序列連接?？梢杂幸粋€(gè)將獨(dú)特反密碼子區(qū)域與互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域連接在一起的連接區(qū)域。B描述連續(xù)反應(yīng)中使用的標(biāo)識(shí)符，構(gòu)件和組裝平臺(tái)的所有的組分，其中標(biāo)識(shí)符還包含獨(dú)特密碼子和結(jié)合區(qū)域，組裝平臺(tái)還包含非編碼區(qū)域和互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域。
圖8顯示，內(nèi)部密碼子也可用于三鏈組裝原理。如果選擇在具有中間擴(kuò)增步驟的多輪中進(jìn)行，這是有用的。
圖9給出了固相三鏈展示分子合成。組裝平臺(tái)分子連接到固體支持物上以允許隨后將構(gòu)件連接至連接實(shí)體上。用合適的非編碼區(qū)域和互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域延伸的組裝平臺(tái)分子的不同庫可在單獨(dú)的小瓶中用于每個(gè)步驟。這樣能夠在每個(gè)步驟中使用相同的構(gòu)件和標(biāo)識(shí)符分子。
圖10顯示使用組裝平臺(tái)原理的順序轉(zhuǎn)移/延伸。每個(gè)孔包含平臺(tái)分子庫。平臺(tái)分子在隨后孔中延伸一個(gè)獨(dú)特反密碼子。將標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件分子的庫加入第一孔中以允許功能實(shí)體的特異退火和轉(zhuǎn)移。反應(yīng)混合物被轉(zhuǎn)移至下一孔，最后生成標(biāo)識(shí)符展示的庫。
圖11公開了一個(gè)用于組合庫的交替平行合成的一般方案。在第一步驟中，提供新生雙功能分子。新生雙功能分子包含作為分子一部分的反應(yīng)基團(tuán)，它可出現(xiàn)在化學(xué)支架上，且有時(shí)在本文中被稱作化學(xué)反應(yīng)部位。雙功能分子的另一部分包含用于加入標(biāo)簽的引發(fā)部位。在標(biāo)簽是核苷酸的情況下，引發(fā)部位可以是核苷酸的3’-OH基團(tuán)或5’-磷酸基團(tuán)?；瘜W(xué)反應(yīng)部位和引發(fā)部位可任選地被連接基團(tuán)隔開。如果存在連接基團(tuán)，它可以是核苷酸或核苷酸序列。間隔實(shí)體可進(jìn)一步包含親水接頭，如聚乙烯或聚丙烯以使化學(xué)反應(yīng)部位離開核苷酸。還包含在連接部分中的可以是可選擇性斷裂的接頭以允許實(shí)驗(yàn)者將展示分子與編碼部分分離。
新生雙功能分子被分成多個(gè)隔室，通常是微滴定板或類似設(shè)備的孔，這樣容易處理多個(gè)空間分開的容器。每個(gè)隔室與特定小的分子片段(本文也稱作反應(yīng)物)反應(yīng)。因此，在第一隔室中，新生雙功能分子與第一小分子片段(F1)反應(yīng)，在第二隔室中；新生雙功能分子與第二小分子片段(F2)反應(yīng)，等。隔室的數(shù)目原則上是不確定的，但由于實(shí)際原因，該數(shù)目通常是5至5000，如10至500。在每個(gè)隔室中，小分子片段視情況而定可以是相同的或不同的。在每個(gè)隔室中，一種，兩種，或更多反應(yīng)物可參與反應(yīng)。在藥物片段和新生雙功能分子之間的反應(yīng)已在每個(gè)隔室中發(fā)生之后，加入標(biāo)簽，所述標(biāo)簽可標(biāo)識(shí)小分子片段。在本發(fā)明的某些方面，標(biāo)簽是核酸。因此，在第一隔室中，第一核酸標(biāo)簽(T1)被加入反應(yīng)產(chǎn)物的引發(fā)部位，在第二隔室中，第二核酸標(biāo)簽(T2)被加入第二反應(yīng)產(chǎn)物的引發(fā)部位，等。本文考慮和討論了各種用于酶編碼的方法。在每個(gè)隔室中酶促加入標(biāo)簽之后，收集隔室的內(nèi)容物。
在第二輪中，將雙功能分子的混合物再次分入隔室中。第二輪的隔室的數(shù)目不必與第一輪的隔室的數(shù)目相同。在每個(gè)隔室中，以前輪的產(chǎn)物用作新生雙功能分子。因此，出現(xiàn)在支架和第一輪的小分子片段之間的反應(yīng)產(chǎn)物上的反應(yīng)基團(tuán)與第二輪的一個(gè)或多個(gè)小分子片段反應(yīng)。因此，在第一隔室中，第一輪的混合反應(yīng)產(chǎn)物與第一小分子片段(F1)反應(yīng)，在第二隔室中，第一輪的混合反應(yīng)產(chǎn)物與第二小分子片段(F2)反應(yīng)，等。第二輪的小分子片段F1，F(xiàn)2，…Fx可與用于第一輪的小分子片段相同或不同。
在反應(yīng)已發(fā)生之后，加入用于指定小分子片段的標(biāo)簽。在第一輪中加入的標(biāo)簽通常包含可用于在第二輪中加入標(biāo)簽以得到包含這些標(biāo)簽的線性標(biāo)識(shí)符的引發(fā)部位。在第一隔室中，向反應(yīng)的產(chǎn)物中加入第一標(biāo)簽，該標(biāo)簽用于標(biāo)識(shí)已與新生雙功能分子的反應(yīng)性反應(yīng)部位反應(yīng)的第二輪的反應(yīng)物；在第二隔室中，向與第二輪的第二小分子片段反應(yīng)的產(chǎn)物中加入用于標(biāo)識(shí)所述反應(yīng)物的標(biāo)簽，等。在每個(gè)隔室中加入標(biāo)簽之后，將各隔室的內(nèi)容物在一個(gè)共同池中混合。斷裂-反應(yīng)-合并周期可重復(fù)適當(dāng)次數(shù)，以得到包含展示分子部分和編碼部分的雙功能分子的庫。該庫可用于本文別處公開的選擇過程。
以上公開了分開-和-混合的一般原理，其中小分子片段和化學(xué)反應(yīng)部位的反應(yīng)在編碼步驟之前發(fā)生。顯然，這些事件可按照相反的順序或同時(shí)發(fā)生。
圖12在左邊示意地顯示96孔微滴定板。在每個(gè)孔中或在所選數(shù)目的孔中，進(jìn)行右邊所示過程。起始，提供雙功能分子。雙功能分子包含通過接頭(線)連接到密碼子(長方形)上的化學(xué)反應(yīng)部位(橢圓形)。向密碼子的左側(cè)提供結(jié)合區(qū)域。然后，加入密碼子寡核苷酸和夾板寡核苷酸。密碼子寡核苷酸具有密碼子和側(cè)翼結(jié)合區(qū)域。夾板設(shè)計(jì)具有與新生雙功能分子的結(jié)合區(qū)域和密碼子寡核苷酸的結(jié)合區(qū)域互補(bǔ)的序列，使得末端在雜交條件下相互鄰接。新生雙功能復(fù)合物，夾板和密碼子寡核苷酸在合適的條件下形成雜交產(chǎn)物。加入連接酶以將密碼子oligo偶聯(lián)至新生雙功能復(fù)合物上。在第二步驟中，加入藥物片段，即反應(yīng)物并設(shè)立條件以提供與化學(xué)反應(yīng)部位的反應(yīng)。
隨后將每個(gè)孔的內(nèi)容物合并和，任選地再次分成多個(gè)孔用于第二輪反應(yīng)和編碼。在最終步驟中，將孔的合并的內(nèi)容物用于選擇或分離步驟，如本文所公開。
圖13概述了與圖12所示實(shí)施方案相比其中編碼和反應(yīng)步驟被顛倒的實(shí)施方案。在各種孔中，分配具有連接到寡核苷酸(水平線)上的反應(yīng)基團(tuán)(Rx)的新生雙功能復(fù)合物。在第一步驟中，每個(gè)隔室中的反應(yīng)基團(tuán)與反應(yīng)物反應(yīng)，在第二步驟中，密碼子寡核苷酸和夾板與連接酶一起被加入以將密碼子寡核苷酸共價(jià)連接至反應(yīng)的新生雙功能復(fù)合物上，和在第三步驟中，回收連接產(chǎn)物。各孔的內(nèi)容物可隨后被合并和用作雙功能復(fù)合物的庫或再循環(huán)用于另一輪反應(yīng)和加入標(biāo)簽。
圖14公開了按照圖13制成的庫，或具有編碼部分和展示分子部分的任何其它庫在另一輪中的使用。起始，將來自的圖13實(shí)施方案的孔的合并內(nèi)容物分配在分開的各孔中。隨后將具有與新生雙功能分子結(jié)合區(qū)域互補(bǔ)的結(jié)合區(qū)域的反密碼子寡核苷酸在雜交條件下，即有利于在新生雙功能復(fù)合物和反密碼子寡核苷酸之間雜交產(chǎn)物組裝的條件下加入。隨后，或在加入反密碼子寡核苷酸的同時(shí)，加入聚合酶，dNTP混合物(通常，dATP，dGTP，dCTP，和dTTP)，和合適的鹽和緩沖劑以使發(fā)生延伸。延伸(虛線箭頭)將反密碼子轉(zhuǎn)錄至標(biāo)識(shí)符，因此連接上編碼隨后在化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)的反應(yīng)物的身份的標(biāo)簽。反密碼子寡核苷酸連接至生物素(b)上以允許去除寡核苷酸。
圖15公開了與多種反應(yīng)物相結(jié)合的各種編碼方法的方案。所有的組合都按照本發(fā)明。
游離反應(yīng)物/聚合酶編碼新生雙功能復(fù)合物包括包含反應(yīng)基團(tuán)的支架(＝化學(xué)反應(yīng)部位)和包含標(biāo)識(shí)支架的密碼子的寡核苷酸部分。密碼子與能夠與反密碼子寡核苷酸的互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域形成雜交產(chǎn)物的寡核苷酸結(jié)合區(qū)域連接。將雜交產(chǎn)物經(jīng)受延伸反應(yīng)，其中支架寡核苷酸在反密碼子上延伸，這樣提供具有密碼子的支架寡核苷酸。隨后，在延伸反應(yīng)的同時(shí)或之前，將反密碼子所編碼的游離反應(yīng)物與支架反應(yīng)。
拉鏈(zipper)構(gòu)件/聚合酶新生雙功能復(fù)合物包括包含反應(yīng)基團(tuán)的支架(＝化學(xué)反應(yīng)部位)和包含標(biāo)識(shí)支架的密碼子的寡核苷酸部分。密碼子與能夠與反密碼子寡核苷酸的互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域和反應(yīng)物的互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域形成雜交產(chǎn)物的兩個(gè)寡核苷酸結(jié)合區(qū)域連接。將雜交產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng)，其中支架寡核苷酸在反密碼子上延伸，這樣提供具有密碼子的支架寡核苷酸。隨后，在延伸反應(yīng)的同時(shí)或之前，將反密碼子所編碼的功能實(shí)體與支架反應(yīng)。聚合酶的選擇可決定反應(yīng)或編碼的順序，因?yàn)橐恍┚酆厦?，如測序酶能夠置換連接到功能實(shí)體上的結(jié)合區(qū)域，而其它聚合酶，如Taq聚合酶則不進(jìn)行結(jié)合區(qū)域的置換。如果使用拉鏈構(gòu)件，那么在支架和功能實(shí)體之間得到緊密接近度，這樣促進(jìn)反應(yīng)的發(fā)生。
E2構(gòu)件/聚合酶編碼新生雙功能復(fù)合物包含化學(xué)支架和寡核苷酸部分，后者包含用于標(biāo)識(shí)支架的密碼子。寡核苷酸部分在密碼子的每側(cè)包含兩個(gè)結(jié)合區(qū)域。E2構(gòu)件退火至支架寡核苷酸上使得功能實(shí)體與支架緊密接近或就在反密碼子的前面形成雙螺旋，因此使得聚合酶能夠識(shí)別雙螺旋為結(jié)合區(qū)域。采用合適的條件和底物能夠使標(biāo)識(shí)符寡核苷酸在反密碼子上延伸，因此將功能實(shí)體的遺傳信息轉(zhuǎn)錄至標(biāo)識(shí)符上。與支架密碼子相對(duì)的是通用結(jié)合核苷酸，如次黃嘌呤核苷的區(qū)段。E2構(gòu)件的使用允許一罐合成庫。
環(huán)形構(gòu)件/聚合酶編碼新生雙功能復(fù)合物包含化學(xué)支架和寡核苷酸部分，后者包含用于標(biāo)識(shí)支架的密碼子。寡核苷酸部分在密碼子的每側(cè)包含兩個(gè)結(jié)合區(qū)域。環(huán)形構(gòu)件退火至支架寡核苷酸上使得功能實(shí)體與支架緊密接近且就在反密碼子的前面形成雙螺旋，因此使得聚合酶能夠識(shí)別雙螺旋為結(jié)合區(qū)域。采用合適的條件和底物能夠使標(biāo)識(shí)符寡核苷酸在反密碼子上延伸，因此將功能實(shí)體的遺傳信息轉(zhuǎn)錄至標(biāo)識(shí)符。因?yàn)闃?gòu)件沒有序列能夠互補(bǔ)支架密碼子序列，該密碼子序列環(huán)出(loop out)。環(huán)形構(gòu)件的使用允許一罐合成庫。
N構(gòu)件/聚合酶編碼新生雙功能復(fù)合物包含通過接頭連接到支架密碼子上的化學(xué)支架。在密碼子的一側(cè)或每側(cè)存在結(jié)合區(qū)域。N構(gòu)件包含與支架結(jié)合區(qū)域互補(bǔ)的結(jié)合區(qū)域和反密碼子。功能實(shí)體被連接到密碼子或結(jié)合區(qū)域上。在雜交條件下，互補(bǔ)性連接區(qū)域雜交且聚合酶在兩個(gè)方向上延伸，這樣將反密碼子的遺傳信息轉(zhuǎn)移至共價(jià)連接至支架上的寡核苷酸。在延伸反應(yīng)之前，之后或同時(shí)，功能實(shí)體和支架之間可進(jìn)行反應(yīng)。通常，功能實(shí)體通過可斷裂的接頭連接到反密碼子寡核苷酸上以允許功能實(shí)體轉(zhuǎn)移至支架結(jié)構(gòu)上。
游離反應(yīng)物/連接酶支架實(shí)體連接到包含密碼子的寡核苷酸上。支架寡核苷酸進(jìn)一步包含其連接密碼子寡核苷酸的引發(fā)部位。連接通過連接酶而進(jìn)行。連接可以單鏈或雙鏈形式進(jìn)行。在單鏈形式中，支架寡核苷酸的3’OH(或5’-磷酸)被連接至密碼子寡核苷酸的5’-磷酸(或3’-OH)上。在雙鏈形式中，使用分別與支架和密碼子寡核苷酸的末端互補(bǔ)的寡核苷酸并設(shè)計(jì)使得末端相互鄰接。任選地，連接在兩個(gè)雙鏈寡核苷酸之間發(fā)生，即具有突出端(“粘性端”)的雙鏈支架寡核苷酸被連接至具有互補(bǔ)性突出端的雙鏈密碼子寡核苷酸上。連接的種類取決于所選的酶。通常，雙鏈連接是優(yōu)選的，因?yàn)榕c末端互補(bǔ)的寡核苷酸的引導(dǎo)作用帶來較快的反應(yīng)?；パa(bǔ)性寡核苷酸在本文中也被稱作夾板寡核苷酸。在將密碼子寡核苷酸連接至支架寡核苷酸上之后，之前，或同時(shí)，游離反應(yīng)物和支架之間進(jìn)行反應(yīng)。
拉鏈構(gòu)件/連接酶支架實(shí)體被連接到包含密碼子和在支架和密碼子之間的結(jié)合區(qū)域的寡核苷酸上。支架寡核苷酸進(jìn)一步包含其連接密碼子寡核苷酸的引發(fā)部位。連接通過連接酶而進(jìn)行。連接可按照單鏈或雙鏈形式進(jìn)行。在單鏈形式中，支架寡核苷酸的3’OH(或5’-磷酸)被連接至密碼子寡核苷酸的5’-磷酸(或3’-OH)上。在雙鏈形式中，使用分別與支架和密碼子寡核苷酸的末端互補(bǔ)的寡核苷酸并設(shè)計(jì)使得末端相互鄰接。任選地，連接在兩個(gè)雙鏈寡核苷酸之間發(fā)生，即具有突出端(“粘性端”)的雙鏈支架寡核苷酸被連接至具有互補(bǔ)性突出端的雙鏈密碼子寡核苷酸上。連接的種類取決于所選的酶。通常，雙鏈連接是優(yōu)選的，因?yàn)榕c末端互補(bǔ)的寡核苷酸的引導(dǎo)作用帶來較快的反應(yīng)?；パa(bǔ)性寡核苷酸在本文中也被稱作夾板寡核苷酸。拉鏈構(gòu)件是連接到結(jié)合寡核苷酸上的功能實(shí)體。結(jié)合寡核苷酸與支架寡核苷酸的結(jié)合區(qū)域互補(bǔ)，因此在雜交條件下形成雜交產(chǎn)物。在密碼子寡核苷酸連接至支架寡核苷酸上之后，之前，或同時(shí)，功能實(shí)體和支架之間進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)合區(qū)域在反應(yīng)物上的使用確保功能實(shí)體和支架之間的緊密接近。
E2構(gòu)件/連接編碼(Ligational encoding)起始提供一種包含連接到寡核苷酸上的支架的新生雙功能復(fù)合物，所述寡核苷酸包含密碼子和在支架密碼子和支架密碼子之間的結(jié)合區(qū)域。支架寡核苷酸還包含其上可連接密碼子寡核苷酸的引發(fā)部位。支架寡核苷酸被雜交至攜帶雙鏈部分的E2構(gòu)件上。與反密碼子互補(bǔ)的寡核苷酸使用E2構(gòu)件作為模板被連接至支架寡核苷酸上。在連接之前，之后或同時(shí)，功能實(shí)體和支架之間進(jìn)行反應(yīng)。
環(huán)形構(gòu)件/連接編碼提供包含連接到寡核苷酸上的支架的雙功能復(fù)合物，其中支架寡核苷酸包含側(cè)翼有兩個(gè)結(jié)合區(qū)域的密碼子。提供具有與支架寡核苷酸結(jié)合區(qū)域互補(bǔ)的結(jié)合區(qū)域的環(huán)形構(gòu)件。在雜交后，支架寡核苷酸的密碼子部分環(huán)出。環(huán)形構(gòu)件還包含雙鏈密碼子部分。與環(huán)形構(gòu)件的反密碼子部分互補(bǔ)的寡核苷酸被連接至支架寡核苷酸的游離結(jié)合區(qū)域。在連接之前，之后或同時(shí)，功能實(shí)體和支架之間進(jìn)行反應(yīng)。
N構(gòu)件/連接編碼起始提供新生雙功能復(fù)合物，其中支架通過合適的接頭連接至用于標(biāo)識(shí)所述支架的密碼子上或連接到與該密碼子連接的結(jié)合區(qū)域上。具有連接至密碼子上的功能實(shí)體的構(gòu)件被連接至支架寡核苷酸上以使支架寡核苷酸與功能實(shí)體寡核苷酸連接。連接可在單鏈或在雙鏈態(tài)下進(jìn)行，這取決于選擇用于連接的特定酶。隨后，功能實(shí)體與支架反應(yīng)。作為替代方案，功能實(shí)體和支架在連接相應(yīng)的寡核苷酸之前反應(yīng)。
如果已經(jīng)按照任何的以上編碼方法完成一輪，即與新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)和標(biāo)記，可根據(jù)任何的以上反應(yīng)/編碼方法開始新一輪。因此，第一輪中的編碼和反應(yīng)可與隨后第二或更多輪相同或不同?？缮蓡蝹€(gè)雙功能復(fù)合物或復(fù)合物庫。如果考慮庫，一罐-合成可使用這樣的構(gòu)件進(jìn)行，其中使用功能實(shí)體和密碼子/反密碼子之間的共價(jià)鍵，即E2構(gòu)件，環(huán)形構(gòu)件和N構(gòu)件列。如果功能實(shí)體/反應(yīng)物和密碼子/反密碼子之間不存在共價(jià)鍵，即在說明游離反應(yīng)物和拉鏈構(gòu)件的欄中，可進(jìn)行分開和混合合成。
圖16顯示一種雙編碼(double encoding)方法，即用于一次編碼兩種或多種反應(yīng)物的方法。在某些實(shí)施方案中，多編碼(multipleencoding)方法允許反應(yīng)物和支架之間的多種反應(yīng)。起始，將連接至包含雜交區(qū)域，支架密碼子和結(jié)合區(qū)域的寡核苷酸上的支架退火至E2構(gòu)件上。隨后，進(jìn)行延伸，其中構(gòu)件的反密碼子被轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符上。幾種聚合酶形成一個(gè)或多個(gè)單鏈核苷酸的突出端。該突出端在本發(fā)明中用于連接反密碼子oligo和允許聚合酶將標(biāo)識(shí)符寡核苷酸在反密碼子寡核苷酸的反密碼子區(qū)域上進(jìn)一步延伸。反密碼子寡核苷酸的信息的轉(zhuǎn)移允許編碼第三游離反應(yīng)物C。攜帶A的寡核苷酸和攜帶B的寡核苷酸之間的退火提供A和B之間的緊密接近和因此提供高局部濃度。因此，當(dāng)加入游離反應(yīng)物C時(shí)，有利于三種組分之間的反應(yīng)。雙編碼的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于可更換溶劑，使得反應(yīng)無需在與發(fā)生延伸時(shí)相同的溶劑中進(jìn)行。
右邊說明一個(gè)例子，其中以上方法被應(yīng)用于100種不同的支架寡核苷酸和100種構(gòu)件。支架寡核苷酸和構(gòu)件寡核苷酸之間的雜交產(chǎn)物被分成100個(gè)不同的孔。在每個(gè)孔中，允許反密碼子寡核苷酸的延伸，加入和與特定游離反應(yīng)物的反應(yīng)。生成總共106種不同的雙功能分子。
圖17公開了用于進(jìn)行雙編碼的各種方法。在所有的例子中，編碼顯示為在反應(yīng)之前進(jìn)行，但熟練技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)先進(jìn)行反應(yīng)并隨后編碼。當(dāng)考慮庫時(shí)，可使用N構(gòu)件并結(jié)合任何編碼方法在單個(gè)容器中進(jìn)行反應(yīng)(一罐合成)。對(duì)于剩余的反應(yīng)物，需要進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)分開-和-混合步驟。在拉鏈構(gòu)件，E2構(gòu)件，和環(huán)形構(gòu)件與任何編碼方法的組合中，單個(gè)分開-和-混合步驟是必需的，而兩個(gè)分開-和-混合步驟對(duì)于游離反應(yīng)物與任何編碼方法的組合是必需的。該方案使得熟練技術(shù)人員可選擇出可用于特定反應(yīng)的反應(yīng)/編碼方法。如果考慮三-，四-，或多編碼，可一次或多次結(jié)合使用雙編碼方案的實(shí)施方案和圖15的單編碼方案的實(shí)施方案進(jìn)行這些編碼，得到一種適合特定化學(xué)反應(yīng)的要求的編碼/反應(yīng)方法。
圖21公開了一種三編碼(triple encoding)方法。起始，提供連接到支架寡核苷酸上的支架。支架被連接到支架寡核苷酸的連接區(qū)域，并向支架寡核苷酸進(jìn)一步提供密碼子。E2型的兩個(gè)構(gòu)件被退火至支架寡核苷酸上，這樣使功能實(shí)體BBl和BB2與支架緊密接近。在加入構(gòu)件的同時(shí)，之前或之后，提供包含與第一構(gòu)件的核苷酸序列互補(bǔ)的部分的密碼子寡核苷酸用于編碼第三反應(yīng)物(BB3)。使該體系的組分能夠相互雜交并提供聚合酶和連接酶。聚合酶進(jìn)行延伸(如果可能)且連接酶將延伸的寡核苷酸連接在一起以形成雙鏈產(chǎn)物。在編碼過程之后，加入第三反應(yīng)物并提供促進(jìn)支架和反應(yīng)物之間反應(yīng)的條件。最后，進(jìn)行選擇以選擇出對(duì)靶表現(xiàn)出某種功能的反應(yīng)產(chǎn)物。所選雙功能復(fù)合物的標(biāo)識(shí)性寡核苷酸通過PCR擴(kuò)增和鑒定。
右邊顯示一個(gè)用于實(shí)施本發(fā)明的特定實(shí)施方案。相應(yīng)地，每個(gè)密碼子是5個(gè)核苷酸長且支架兩側(cè)的結(jié)合區(qū)域分別是20個(gè)核苷酸。被設(shè)計(jì)成雜交至支架的結(jié)合區(qū)域上的構(gòu)件包含20個(gè)核苷酸的互補(bǔ)性序列以及5個(gè)核苷酸的密碼子。
圖24顯示本發(fā)明富集方法的一個(gè)實(shí)施方案。起始，將庫中的每個(gè)化學(xué)實(shí)體(表示為字母A，B，C，..)連接到獨(dú)特標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽(表示為a，b，c，..)上。標(biāo)識(shí)符標(biāo)簽包含有關(guān)那個(gè)特定化合物或化合物組的例如結(jié)構(gòu)，質(zhì)量，組成，空間位置，等方面的信息。在第二步驟中，標(biāo)記的化合物與一組反標(biāo)簽序列(表示為a’，b’，c’，..)混合。每個(gè)反標(biāo)簽序列攜帶把手，如生物素，用于純化目的。反標(biāo)簽序列包含與標(biāo)識(shí)符序列的序列互補(bǔ)的區(qū)段。反標(biāo)簽序列和標(biāo)識(shí)符序列的混合允許形成雜交產(chǎn)物。任選地，可存在不被反標(biāo)簽識(shí)別的標(biāo)記的化學(xué)實(shí)體。在第三步驟中，攜帶把手的序列被移出，即標(biāo)記化合物留在介質(zhì)中，同時(shí)包含把手的物質(zhì)被轉(zhuǎn)移至第二介質(zhì)上。如果把手是生物素，它可使用固定化的鏈霉抗生物素蛋白被轉(zhuǎn)移至第二介質(zhì)上。
純化的物質(zhì)可包含不雜交至同源序列上的反標(biāo)簽序列。因?yàn)檫@些反標(biāo)簽序列不偶聯(lián)至所要選擇的化合物上，富集序列可留在介質(zhì)中。但在一些場合中可優(yōu)選使過量的反標(biāo)簽序列變成雙鏈，如圖25所示，因?yàn)殡p螺旋通常相對(duì)選擇程序是惰性的。過量的反標(biāo)簽序列可通過使用引物以及合適的聚合酶和核苷三磷酸而被轉(zhuǎn)化成雙螺旋態(tài)。
將步驟4中純化級(jí)分經(jīng)受選擇過程。選擇包括探測一組性質(zhì)，如但不限于對(duì)特定蛋白質(zhì)的親和性。在這種情況下，不結(jié)合特定蛋白質(zhì)的實(shí)體被消除。與結(jié)合特定蛋白質(zhì)的實(shí)體復(fù)合的反標(biāo)簽可通過如使用其純化把手而被回收/分離。
在步驟5中，分離的反標(biāo)簽任選地通過使用PCR或RTPCR而擴(kuò)增。
在步驟6中，在步驟1中制成的標(biāo)記實(shí)體的起始庫可經(jīng)歷另外輪次的復(fù)合(complexation)和篩選，即來自步驟5的反標(biāo)簽可被加入步驟1的標(biāo)記實(shí)體的庫中并隨后進(jìn)行步驟3，步驟4和步驟5。步驟6可重復(fù)。
在步驟7中，步驟5的分離的反標(biāo)簽可被克隆并可揭示其身份。如在DNA的情況下，可進(jìn)行測序，這樣標(biāo)記實(shí)體庫中具有所選性質(zhì)的特定實(shí)體的身份可被揭示。
圖26所示的實(shí)施方案類似圖24，只是使非復(fù)合的組分變成惰性的，如果標(biāo)簽和/或反標(biāo)簽由單鏈DNA或RNA組成，它們可被轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA，RNA或其雜交物。這可通過使用引物，核苷三磷酸和聚合酶或轉(zhuǎn)錄酶而實(shí)現(xiàn)。另外，與圖24的方法相比，改變了純化(通過使用反標(biāo)簽上的純化把手)和探測性質(zhì)的順序。
在圖27，步驟1中，許多實(shí)體(表示為字母A，B，C...)(是混合物或單個(gè)化合物)被連接到獨(dú)特標(biāo)簽，更具體地DNA或RNA序列或其衍生物上，該標(biāo)簽具有關(guān)于該化合物或混合物的信息，如結(jié)構(gòu)，質(zhì)量，組成，空間信息等。
在步驟2中，標(biāo)記實(shí)體的所有的標(biāo)簽通過使用引物(任選地?cái)y帶@-把手如生物素)，核苷酸三磷酸和聚合酶或轉(zhuǎn)錄酶而變成雙鏈。剩余的單鏈DNA或RNA可任選地通過使用核酸酶而被消化。
該混合物在步驟3中被探測一組性能，如但不限于對(duì)特定蛋白質(zhì)的親和性。在這種情況下，不結(jié)合至特定蛋白質(zhì)上的實(shí)體被消除。與結(jié)合特定蛋白質(zhì)的實(shí)體復(fù)合的反標(biāo)簽可通過如使用其@-把手而被回收/分離。
分離的反標(biāo)簽可任選地在步驟4中通過使用PCR或RTPCR而擴(kuò)增。
在步驟5中，步驟1的標(biāo)記實(shí)體庫可經(jīng)歷與步驟3和4的分離的和任選地?cái)U(kuò)增的反標(biāo)簽的復(fù)合。
單鏈組分在步驟6中通過使用如核酸酶而被消化。該庫的剩余的雙鏈子組任選地根據(jù)步驟3-6經(jīng)受更新的庫富集。步驟3-6可重復(fù)足夠次數(shù)以得到具有所需性質(zhì)的合適的化學(xué)實(shí)體。
在步驟7中，步驟4的分離反標(biāo)簽可被克隆并可揭示其身份，如在DNA的情況下，可進(jìn)行測序，這樣標(biāo)記實(shí)體庫中的特定實(shí)體的身份被揭示。
圖28涉及一種包括單鏈寡核苷酸的消化的方法。在第一步驟中，許多實(shí)體(表示為字母A，B，C...)(是混合物或單個(gè)化合物)被連接到獨(dú)特標(biāo)簽上，該標(biāo)簽具有關(guān)于該化合物或混合物的信息，如結(jié)構(gòu)，質(zhì)量，組成，空間信息等。
在步驟2中，標(biāo)記實(shí)體的混合物與一組互補(bǔ)性反標(biāo)簽合并。反標(biāo)簽可以是，但不限于核苷酸衍生物。反標(biāo)簽可任選地?cái)y帶@-把手。允許標(biāo)簽和反標(biāo)簽形成復(fù)合物。復(fù)合可以是，但不限于雜交。一些反標(biāo)簽不與標(biāo)記實(shí)體形成復(fù)合物而一些標(biāo)記實(shí)體不與反標(biāo)簽形成復(fù)合物。
未復(fù)合的組分在步驟3中使用如核酸酶(如果標(biāo)簽和/或反標(biāo)簽由DNA或RNA或其雜交物組成)消化。
步驟3的混合物在步驟4中被探測一組性質(zhì)，如但不限于對(duì)特定蛋白質(zhì)的親和性。在這種情況下，不結(jié)合特定蛋白質(zhì)的實(shí)體被消除。與結(jié)合特定蛋白質(zhì)的實(shí)體復(fù)合的反標(biāo)簽可通過如使用其@把手被回收/分離。步驟4可重復(fù)一次或多次。
分離的反標(biāo)簽可任選地通過使用PCR或RTPCR而擴(kuò)增，如步驟5所示。反標(biāo)簽可隨后還如圖24-27所述而使用。
分離的反標(biāo)簽可被克隆且可在步驟6中揭示其身份，如在DNA的情況下，可進(jìn)行測序，這樣標(biāo)記實(shí)體庫中的特定實(shí)體的身份被揭示。
在圖29，步驟1中，許多實(shí)體(表示為字母A，B，C...)(是混合物或單個(gè)化合物)被連接到獨(dú)特標(biāo)簽，更具體地DNA或RNA序列或其衍生物上，該標(biāo)簽具有關(guān)于該化合物或混合物的信息，如結(jié)構(gòu)，質(zhì)量，組成，空間信息等。
標(biāo)記實(shí)體的所有的標(biāo)簽在步驟2中通過使用引物(任選地?cái)y帶@-把手如生物素)，核苷酸三磷酸和聚合酶或轉(zhuǎn)錄酶而變成雙鏈。剩余的單鏈DNA或RNA可任選地通過使用如核酸酶而被消化。
在步驟3中，該混合物被探測一組性質(zhì)，如但不限于對(duì)特定蛋白質(zhì)的親和性。在這種情況下，不結(jié)合至特定蛋白質(zhì)上的實(shí)體被消除。與附加有結(jié)合至特定蛋白質(zhì)上的實(shí)體的標(biāo)簽復(fù)合的反標(biāo)簽可通過如使用其@把手被回收/分離。步驟3可重復(fù)一次或多次。
根據(jù)步驟4，分離的反標(biāo)簽可任選地通過使用PCR或RTPCR而擴(kuò)增。反標(biāo)簽也可隨后按照圖24-27所述而使用。
分離的反標(biāo)簽可在步驟5中被克隆并可揭示其身份，如在DNA的情況下，可進(jìn)行測序。這樣標(biāo)記實(shí)體庫中的特定實(shí)體的身份被揭示。
圖30，步驟1產(chǎn)生許多實(shí)體(表示為字母A，B，C...)(是混合物或單個(gè)化合物)，它們被連接到獨(dú)特標(biāo)簽，更具體地DNA或RNA序列或其衍生物上，該標(biāo)簽具有關(guān)于該化合物或混合物的信息，如結(jié)構(gòu)，質(zhì)量，組成，空間信息等。
在步驟2中，該混合物被探測一組性能，如但不限于對(duì)特定蛋白質(zhì)的親和性。在這種情況下，不結(jié)合至特定蛋白質(zhì)上的實(shí)體被消除。步驟2可被重復(fù)。
標(biāo)記實(shí)體的所有的標(biāo)簽在步驟3中通過使用引物(任選地?cái)y帶@-把手如生物素)，核苷酸三磷酸和聚合酶或轉(zhuǎn)錄酶而變成雙鏈。剩余的單鏈DNA或RNA可任選地通過使用如核酸酶而被消化。
與結(jié)合特定蛋白質(zhì)的實(shí)體的標(biāo)簽復(fù)合的反標(biāo)簽可在步驟4中通過如使用其@-把手被回收/分離。反標(biāo)簽可任選地通過使用PCR或RTPCR而擴(kuò)增。反標(biāo)簽也可隨后如圖24-27所述而使用。
分離的反標(biāo)簽可在步驟5中被克隆并可揭示其身份，如在DNA的情況下，可進(jìn)行測序，這樣標(biāo)記實(shí)體庫中的特定實(shí)體的身份被揭示。
實(shí)施例實(shí)施例1支架到標(biāo)識(shí)符分子上的加載氨基-修飾劑(amino-modifier)C6 5’-標(biāo)記的標(biāo)識(shí)符oligo(5’-X-TCGTAACGACTGAATGACGT-3’，其中X可得自Glen research，cat.#10-1039-90)使用SPDP活化(參見下文)被加載上肽支架(Cys-Phe-Phe-Lys-Lys-Lys，CFFKKK)。氨基-oligo的SPDP-活化使用在100mM Hepes-KOH(pH＝7.5)中的160μl 10nmol oligo，和40μl20mM SPDP進(jìn)行并在30攝氏度下孵育2h。活化的氨基-oligo用500μlEtOAc提取3次，在Speed-vac中干燥10min和使用以100mMHepes-KOH平衡的微bio-spin柱純化。隨后通過加入10μl 100mM連接實(shí)體和在30攝氏度下孵育過夜加載支架。
加載的標(biāo)識(shí)符oligo用2M NH4OAc和2體積96％乙醇在80攝氏度下沉淀15min并隨后在4攝氏度和15.000g下離心15min。將沉淀塊再懸浮在水中并重復(fù)沉淀。oligo-沉淀塊的洗滌通過加入100μl70％乙醇并隨后簡短地離心而進(jìn)行。將oligo重新溶解在50μl H2O中和通過MS進(jìn)行分析。在將10μl水中的100pmol oligo用10μl離子交換器樹脂處理和在25攝氏度下在振蕩器上孵育最低2h之后，進(jìn)行MS分析。在孵育之后，樹脂通過離心而去除并將15μl上層清液與7μl水，2μl哌啶和咪唑(分別625mM)和24μl乙腈混合。樣品使用質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics，Esquire 3000plus)分析。從以下可以看出，所觀察到的質(zhì)量是7244.93Da，完全符合計(jì)算質(zhì)量，7244.00Da。該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)例證了將支架加載到標(biāo)識(shí)符寡核苷酸上的可能性。該加載標(biāo)識(shí)符分子可用于接收來自構(gòu)件的功能實(shí)體。該特定支架具有三個(gè)相同的反應(yīng)基團(tuán)，即賴氨酸(lycin)側(cè)鏈的胺基團(tuán)，和因此可被轉(zhuǎn)移上一個(gè)，兩個(gè)，或三個(gè)能夠與胺基團(tuán)反應(yīng)的功能實(shí)體。
成分 解卷積質(zhì)量 分子 絕對(duì)豐度 相對(duì)豐度A 7244.93 [M-H]-29674499.25
實(shí)施例2功能實(shí)體在構(gòu)件上的加載功能實(shí)體到構(gòu)件分子上的加載可使用硫醇-oligo(參見下文)進(jìn)行。生物素5’標(biāo)記的和thio-modifier C6 S-S(可得自Glen research，cat#10-1936-90)3’-標(biāo)記的構(gòu)件oligo(5’-BTGCAGACGTCATTCAGTCGTTACGA-3’)使用NHM被轉(zhuǎn)化成NHS-oligo。
將10nmol oligo在Speed-vac中干燥，重新溶解在50μl 100mMDTT，100mM磷酸鈉(pH 8.0)中和在37攝氏度下孵育1小時(shí)。硫醇-oligo隨后使用微bio-spin柱純化，該柱用100mM Hepes-KOH(pH7.5)平衡。硫醇-oligo通過加入在100mM Hepes-KOH中的100mMNHM(pH.7.5)而轉(zhuǎn)化成NHS-oligo。樣品在25攝氏度下孵育過夜。NHS-oligo隨后使用bio-spin柱純化，該柱用MS-級(jí)H2O平衡。
在將10μl水中的100pmol oligo用l0μl離子交換器樹脂處理和在25攝氏度下在振蕩器上孵育最低2h之后，進(jìn)行MS分析。在孵育之后，樹脂通過離心被去除并將15μl上層清液與7μl水，2μl哌啶和咪唑(分別625mM)和24μl乙腈混合。樣品使用質(zhì)譜儀(BrukerDaltonics，Esquire 3000plus)分析。從以下可看出的所觀察到的質(zhì)量是8369.32，完全符合計(jì)算質(zhì)量，8372.1。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)例證了轉(zhuǎn)化構(gòu)件寡核苷酸上的連接實(shí)體的可能性。該產(chǎn)物可隨后用于連接可轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體。
成分 解卷積質(zhì)量 分子絕對(duì)豐度 相對(duì)豐度A 8369.32 [M-H]- 16090596.87NHS-oligo隨后用于加載功能實(shí)體。進(jìn)行功能實(shí)體(4-戊炔酸)的EDC活化，其中將50μl在DMF中的200mM功能實(shí)體與50μl在DMF中的200mM EDC混合和在25攝氏度下在振蕩器上孵育30min。加載隨后使用在Speed-vac中凍干的1nmol NHS-oligo和10μl活化構(gòu)件(參見下文)進(jìn)行。將它在25攝氏度下孵育5min并隨后與30μl 100mMMES(pH 6.0)混合。將加載的NHS-oligo使用bio-spin柱純化，該柱用100mM MES pH 6.0平衡。加載的構(gòu)件oligo隨后立即用于轉(zhuǎn)移反應(yīng)而不進(jìn)行任何MS分析。這是由于功能實(shí)體在用于MS測量的條件下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。
該實(shí)驗(yàn)例證了功能實(shí)體在構(gòu)件分子上的完全加載，所述分子備用于轉(zhuǎn)移至接受性反應(yīng)基團(tuán)(當(dāng)退火至互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符分子上時(shí))上。
可如上所述被加載到構(gòu)件上的功能實(shí)體的另一例子是如下所示的5-己炔酸。同樣，對(duì)該化合物不進(jìn)行MS分析，因?yàn)楣δ軐?shí)體在用于MS測量的條件下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。
實(shí)施例3功能實(shí)體從構(gòu)件轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符分子以下實(shí)驗(yàn)中的連接實(shí)體(attachment entity，AE)是被加載到如實(shí)施例1制備的標(biāo)識(shí)符上的支架，如肽，CFFKKK，或接受性反應(yīng)基團(tuán)例如為在實(shí)施例1中用作起始原料的氨基修飾的寡核苷酸。這些連接實(shí)體允許轉(zhuǎn)移分別三個(gè)或一個(gè)功能實(shí)體。
用于該實(shí)驗(yàn)的標(biāo)識(shí)符是如實(shí)施例1所述加載有CFFKKK的標(biāo)識(shí)符寡核苷酸。該實(shí)驗(yàn)中的功能實(shí)體(FE)是4-戊炔酸，其加載描述于實(shí)施例2。加載有支架的標(biāo)識(shí)符分子被退火至加載構(gòu)件分子上以使連接實(shí)體和功能實(shí)體緊密接近。退火通過標(biāo)識(shí)符分子中的標(biāo)識(shí)符區(qū)域和構(gòu)件分子中的互補(bǔ)性序列引導(dǎo)。
AE-TCGTAACGACTGAATGACGT+FE-AGCATTGCTGACTTACTGCAGACGTB↓AE-TCGTAACGACTGAATGACGTFE-AGCATTGCTGACTTACTGCAGACGTB
在標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件分子之間的退火步驟之后，發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng)，其中功能實(shí)體被轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符分子上。
退火使用在0.1M MES緩沖劑中的600pmol構(gòu)件和400pmol標(biāo)識(shí)符分子在25攝氏度下在振蕩器中進(jìn)行2小時(shí)。構(gòu)件的反應(yīng)性部分(功能實(shí)體)在退火(參見下文)過程中被轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符分子上的連接實(shí)體上的一個(gè)氨基基團(tuán)上。在退火之后，樣品通過微旋凝膠過濾而純化和通過MS進(jìn)行分析。使用等量的樣品(約100pmol)和離子交換器樹脂制備用于MS分析的樣品和在25度下在振蕩器中孵育最低2h。在孵育之后，樹脂被離心掉并向15μl上層清液中加入7μl水，2μl哌啶和咪唑(分別625mM)和24μl乙腈。樣品在質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics，Esquire 3000plus)上進(jìn)行分析。所觀察到的質(zhì)量(參見下文)是7323.45Da，完全符合計(jì)算質(zhì)量，7324.00Da。因此，標(biāo)識(shí)符分子在轉(zhuǎn)移反應(yīng)之后的MS光譜顯示出對(duì)應(yīng)于標(biāo)識(shí)符分子上的被轉(zhuǎn)移功能實(shí)體的質(zhì)量。
成分 解卷積質(zhì)量 分子絕對(duì)豐度 相對(duì)豐度A 8369.18 [M-H]- 75183 99.24→NHS-CUGUB 7323.45 [M-H]- 38073 50.26→TEANGERC 7244.34 [M-H]- 20775 27.42→GCAFFULD
以下給出功能實(shí)體的轉(zhuǎn)移的另一例子，其中使用氨基oligo直接作為在標(biāo)識(shí)符分子上的AE。用于該實(shí)驗(yàn)的構(gòu)件分子上的功能實(shí)體是4-戊炔酸，其公開于實(shí)施例2。
退火使用在0.1M MES緩沖劑中的500pmol構(gòu)件和標(biāo)識(shí)符分子和并將該混合物在25攝氏度下在振蕩器中孵育2小時(shí)而進(jìn)行。構(gòu)件的反應(yīng)性部分(功能實(shí)體)在退火(參見下文)過程中被轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符分子上的氨基基團(tuán)。在退火和轉(zhuǎn)移之后，樣品通過微旋凝膠過濾而純化和通過MS進(jìn)行分析。使用等量的樣品(約100pmol)和離子交換器樹脂制備用于MS分析的樣品和在25度下在振蕩器中孵育最低2h。在孵育之后，樹脂通過離心被去除并向15μl上層清液中加入7μl水，2μl哌啶和咪唑(分別625mM)和24μl乙腈。
樣品在質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics，Esquire 3000plus)上進(jìn)行分析。所觀察到的質(zhì)量是6398.04Da，完全符合計(jì)算質(zhì)量，6400.00Da。因此，標(biāo)識(shí)符分子在轉(zhuǎn)移功能實(shí)體之后的MS光譜顯示出對(duì)應(yīng)于標(biāo)識(shí)符分子上的被轉(zhuǎn)移功能實(shí)體的質(zhì)量。該實(shí)施例表明，功能實(shí)體可使用構(gòu)件分子和標(biāo)識(shí)符分子的這種設(shè)置被轉(zhuǎn)移。
成分 解卷積質(zhì)量 分子 絕對(duì)豐度 相對(duì)豐度A 8368.93 [M-H]- 85789 99.30B 6398.04 [M-H]- 77957 90.23以下給出功能實(shí)體的轉(zhuǎn)移的另一例子，其中使用氨基oligo直接作為標(biāo)識(shí)符分子。用于該實(shí)驗(yàn)的功能實(shí)體是5-己炔酸，如實(shí)施例2所示制備。
退火使用在0.1M MES緩沖劑中的500pmol構(gòu)件和500pmol標(biāo)識(shí)符分子并在25攝氏度下在振蕩器中孵育2小時(shí)而進(jìn)行。構(gòu)件的反應(yīng)性部分(功能實(shí)體)被轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符分子(參見下文)上的氨基基團(tuán)。在退火和轉(zhuǎn)移之后，樣品通過微旋凝膠過濾而純化和通過MS進(jìn)行分析。使用等量的樣品(約100pmol)和離子交換器樹脂制備用于MS分析的樣品和在25攝氏度下在振蕩器中孵育最低2h。在孵育之后，樹脂通過離心被去除并向15μl上層清液中加入7μl水，2μl哌啶和咪唑(分別625mM)和24μl乙腈。

樣品在質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics，Esquire 3000plus)上進(jìn)行分析。所觀察到的質(zhì)量是6411.96Da，完全符合計(jì)算質(zhì)量，6414Da。因此，標(biāo)識(shí)符分子在轉(zhuǎn)移功能實(shí)體之后的MS光譜表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)移到標(biāo)識(shí)符分子上的功能實(shí)體的質(zhì)量。該實(shí)施例表明，功能實(shí)體可使用構(gòu)件分子和標(biāo)識(shí)符分子的這種設(shè)置被轉(zhuǎn)移。
成分 解卷積質(zhì)量 分子絕對(duì)豐度 相對(duì)豐度A 6411.96 [M-H]- 86999 98.85B 8368.87 [M-H]- 84433 93.78實(shí)施例4標(biāo)識(shí)符分子的延伸以轉(zhuǎn)移獨(dú)特密碼子在功能實(shí)體(FE)轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符分子上的連接實(shí)體(AE)上之后，標(biāo)識(shí)符分子被延伸以使標(biāo)識(shí)被轉(zhuǎn)移功能實(shí)體的獨(dú)特密碼子轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符分子上。這通過加入合適的聚合酶和包含野生型核苷酸(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)的聚合酶緩沖劑而實(shí)現(xiàn)。這會(huì)將標(biāo)識(shí)符分子的3’-端延伸至構(gòu)件分子的5’-端的末端。
延伸標(biāo)識(shí)符分子以轉(zhuǎn)移獨(dú)特反密碼子優(yōu)選在轉(zhuǎn)移FE之后進(jìn)行，如下所示。
FE-AE-TCGTAACGACTGAATGACGT-AGCATTGCTGACTTACTGCAGACGTB↓FE-AE-TCGTAACGACTGAATGACGTCTGCT-AGCATTGCTGACTTACTGCAGACGTB延伸使用在緩沖劑中的15單位的Taq聚合酶而進(jìn)行，所述緩沖劑在延伸緩沖劑(20mM HEPES-KOH，40mM KCl，8mM MgCl2，pH＝7,4)中包含0.4mM的每種核苷酸。在延伸反應(yīng)之后，樣品使用MS進(jìn)行分析。MS分析使用約100pmol純化的延伸混合物在一半體積的離子交換器樹脂中進(jìn)行和在25攝氏度下在振蕩器中孵育最低2h。在孵育之后，樹脂通過離心而被去除并將15μl上層清液與7μl水，2μl哌啶和咪唑(分別625mM)和24μl乙腈混合。樣品在質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics，Esquire 3000plus)上分析。
以下給出在帶有轉(zhuǎn)移的4-戊炔酸的標(biāo)識(shí)符分子上的延伸作用的MS數(shù)據(jù)。
成分 解卷積質(zhì)量 分子 絕對(duì)豐度 相對(duì)豐度A 8368.79 [M-H]-60417 98.68B 7922.53 [M-H]-51334 83.85所觀察到質(zhì)量是7922.53Da，完全符合計(jì)算質(zhì)量，7924.00Da。標(biāo)識(shí)符分子在功能實(shí)體的轉(zhuǎn)移反應(yīng)和編碼區(qū)域(獨(dú)特密碼子)的延伸反應(yīng)之后的MS光譜顯示出對(duì)應(yīng)于被轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體和標(biāo)識(shí)符分子上的延伸的質(zhì)量。該實(shí)施例表明，功能實(shí)體可使用具有長于標(biāo)識(shí)符分子的構(gòu)件分子的這種設(shè)置而轉(zhuǎn)移且標(biāo)識(shí)符分子可使用聚合酶在轉(zhuǎn)移過程之后延伸。這表現(xiàn)出將來自相同的構(gòu)件的功能實(shí)體和獨(dú)特密碼子轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符分子的可能性。
顯示轉(zhuǎn)移和延伸的另一例子是針對(duì)具有功能實(shí)體5-己炔酸的構(gòu)件。以下給出在具有轉(zhuǎn)移的5-己炔酸的標(biāo)識(shí)符分子上延伸的MS數(shù)據(jù) 成分 解卷積質(zhì)量 分子 絕對(duì)豐度 相對(duì)豐度A 7936.99 [M-H]- 10717097.88B 8369.04 [M-H]- 79840 72.92
所觀察到的質(zhì)量是7936.99Da，完全符合計(jì)算質(zhì)量，7938.00Da。標(biāo)識(shí)符分子在功能實(shí)體的轉(zhuǎn)移反應(yīng)和編碼區(qū)域(獨(dú)特密碼子)的延伸反應(yīng)之后的MS光譜表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)于被轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體和在標(biāo)識(shí)符分子上的延伸的質(zhì)量。該實(shí)施例還表明，功能實(shí)體可使用具有長于標(biāo)識(shí)符分子的構(gòu)件分子的這種設(shè)置而轉(zhuǎn)移且標(biāo)識(shí)符分子可使用聚合酶在轉(zhuǎn)移過程之后延伸。這例證了將功能實(shí)體和獨(dú)特密碼子兩者從一個(gè)構(gòu)件分子轉(zhuǎn)移至一個(gè)標(biāo)識(shí)符分子上的可能性。
實(shí)施例5庫設(shè)計(jì)標(biāo)識(shí)符分子可被設(shè)計(jì)成在各種條件下操作最想要。但它應(yīng)該包含對(duì)該功能極重要的一些成分。標(biāo)識(shí)符分子應(yīng)該包含可退火至構(gòu)件上的序列和可容納各種功能實(shí)體的連接實(shí)體。以下是關(guān)于標(biāo)識(shí)符分子在延伸區(qū)域中如何可被設(shè)計(jì)的例子。在轉(zhuǎn)移和編碼的每個(gè)步驟過程中被延伸的區(qū)域可使用各種方案設(shè)計(jì)。重要的是，在構(gòu)件和標(biāo)識(shí)符之間必須存在堿基對(duì)匹配以使用聚合酶有效地延伸。這可使用恒定的區(qū)域，例如描述于圖3(a)的結(jié)合區(qū)域，或也如圖3(b)所示的允許結(jié)合至任何給定序列上的區(qū)域而實(shí)現(xiàn)。也可使用這些方案的組合。
由于標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件分子的匹配(以下所示的步驟1)，延伸過程中的第一步驟無需特殊結(jié)合區(qū)域。但隨后的步驟需要對(duì)標(biāo)識(shí)符分子足夠互補(bǔ)的結(jié)合區(qū)域以允許雜交，因?yàn)槊?，?yōu)選聚合酶必須能夠結(jié)合至雙螺旋上和進(jìn)行延伸。以下實(shí)例顯示編碼程序中的四個(gè)步驟。該延伸過程可繼續(xù)以得到合適的構(gòu)件轉(zhuǎn)移數(shù)。該實(shí)例中的結(jié)合區(qū)域包含6個(gè)核苷酸，但這可根據(jù)構(gòu)件的設(shè)計(jì)而變化。
在以前反密碼子中容納可能錯(cuò)配的可能性是使用通用核酸堿基，即能夠與一種以上的天然核酸堿基進(jìn)行堿基成對(duì)的核酸堿基?？赡艿膲A基是可與胞苷，胸腺嘧啶核苷，和腺苷形成堿基對(duì)的次黃嘌呤核苷(盡管次黃嘌呤核苷腺苷成對(duì)大概在雙鏈DNA中不十分正確地配合，因此當(dāng)螺旋在該嘌呤嘌呤成對(duì)處凸出時(shí)可能付出能量代價(jià))。原則上，可使用允許獨(dú)特密碼子延伸的任何設(shè)計(jì)。
標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件標(biāo)識(shí)符GCA CAC ATG CAT GAG CAC AC G步驟1的構(gòu)件庫CGT GTG TAC GTA CTC GTG TG CGT GTGNNNNNNTGA CTA步驟2的構(gòu)件庫CGT GTG TAC GTA CTC GTG TG CGT GTGIIIIIITGA CTANNNNNNTGC AAC步驟3的構(gòu)件庫CGT GTG TAC GTA CTC GTG TG CGT GTGIIIIIITGA CTAIIIIIITGC AACNNNNNNACT TTG步驟4的構(gòu)件庫CGT GTG TAC GTA CTC GTG TG CGT GTGIIIIIITGA CTAIIIIIITGC AACIIIIIIACT TTGNNNNNN GGC AAT ACG CAT TAC CGEcoRIN選自A，G，T，C的核酸堿基。
I次黃嘌呤核苷在每個(gè)步驟中通過轉(zhuǎn)移獨(dú)特密碼子而編碼和延伸編碼區(qū)域的例子1.
GCA CAC ATG CAT GAG CAC AC GCGT GTG TAC GTA CTC GTG TG CGT GTGTCGATGTGA CTA2.
GCA CAC ATG CAT GAG CAC AC GCA CACAGCTACACT GATCGT GTG TAC GTA CTC GTG TG CGT GTGTCGATGTGA CTA3.
GCA CAC ATG CAT GAG CAC AC GCA CACAGCTACACT GATCGT GTG TAC GTA CTC GTG TG CGT GTGIIIIIITGA CTACAATCGTGC AAC4.
GCA CAC ATG CAT GAG CAC AC GCA CACAGCTACACT GATGTTAGCACG TTGCGT GTG TAC GTA CTC GTG TG CGT GTGIIIIIITGA CTACAATCGTGC AAC5.
GCA CAC ATG CAT GAG CAC AC GCA CACAGCTACACT GATGTTAGCACG TTGCGT GTG TAC GTA CTC GTG TG CGT GTGIIIIIITGA CTAIIIIIITGC AACCTCTGTACT TTG6.
GCA CAC ATG CAT GAG CAC AC GCA CACAGCTACACT GATGTTAGCACG TTGGAGACATGA AACCGT GTG TAC GTA CTC GTG TG CGT GTGIIIIIITGA CTAIIIIIITGC AACCTCTGTACT TTG7.
GCA CAC ATG CAT GAG CAC AC GCA CACAGCTACACT GATGTTAGCACG TTGGAGACATGA AACCGT GTG TAC GTA CTC GTG TG CGT GTGIIIIIITGA CTAIIIIIITGC AACIIIIIIACT TTGTAAGCT GGC AAT ACG CAT TAC CGEcoRI8.
GCA CAC ATG CAT GAG CAC AC GCA CACAGCTACACT GATGTTAGCACG TTGGAGACATGA AACATTCGA CCG TTA TGC GTA ATG GCCGT GTG TAC GTA CTC GTG TG CGT GTGIIIIIITGA CTAIIIIIITGC AACIIIIIIACT TTGTAAGCT GGC AAT ACG CAT TAC CG
延伸使用60pmol引物和模板在延伸緩沖劑(20mM HEPES-KOH，40mM KCl，8mM MgCl2，pH＝7,4)和10mM DTT中進(jìn)行。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)中的延伸，使用20U AMV-RT(Promega M510b)。
MS分析使用約100pmol延伸混合物在一半體積的離子交換器樹脂中進(jìn)行和在25攝氏度下在振蕩器中孵育最低2h。在孵育之后，樹脂通過離心而被去除并將15μl上層清液與7μl水，2μl哌啶和咪唑(分別625mM)和24μl乙腈混合。樣品使用質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics，Esquire 3000plus)分析。
以上實(shí)例所示的在步驟3中的引物/模板組合的延伸在以下的數(shù)據(jù)MS圖中給出。分析顯示模板的質(zhì)量，15452.14Da(預(yù)期15453.86Da)和延伸的引物的質(zhì)量，15328.92(預(yù)期15331.90Da)。沒有鑒定出未延伸(或部分延伸)引物的質(zhì)量，表明引物完全延伸。該實(shí)驗(yàn)例證了將密碼子轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符分子上的可能性，即使反密碼子之前是另一反密碼子。
成分 解卷積質(zhì)量 分子絕對(duì)豐度 相對(duì)豐度A 15452.14 [M-H]- 161269100.00 -EKO46B 15328.92 [M-H]- 89333 55.39 -EXT.
在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，檢查如上所述在步驟7中的引物/模板組合的延伸。MS數(shù)據(jù)在下圖中給出。數(shù)據(jù)顯示出延伸的引物的質(zhì)量，28058.14Da(預(yù)期28052.30Da)。同樣，沒有鑒定出未延伸(或部分延伸)引物的質(zhì)量，表明引物完全延伸。該實(shí)驗(yàn)例證了將密碼子轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符分子上的可能性，即使反密碼子之前是多個(gè)反密碼子。因此，一種制造包含獨(dú)特密碼子的編碼區(qū)域的完整方法對(duì)于庫是可行的。
成分 解卷積質(zhì)量 分子絕對(duì)豐度 相對(duì)豐度A 16184.59[M+H]+ 48389 66.47B 28058.14[M+H]+ 64120 88.08+ETT.
總之，這些實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)使用具有包含次黃嘌呤核苷的螺旋的相鄰獨(dú)特密碼子時(shí)，聚合酶可延伸獨(dú)特反密碼子序列。這樣能夠在轉(zhuǎn)移功能實(shí)體的每個(gè)步驟中將獨(dú)特反密碼子轉(zhuǎn)移至標(biāo)識(shí)符分子上。該實(shí)驗(yàn)顯示可在將要在編碼過程中被延伸的反密碼子之前的反密碼子區(qū)域之后使用結(jié)合區(qū)域。相同的方案可用于連續(xù)步驟中以允許編碼帶有連接到連接實(shí)體上的多個(gè)功能實(shí)體的分子。
在庫已生成且已進(jìn)行第一輪選擇之后，所選的標(biāo)識(shí)符分子可用作用于下一輪庫的來源。所選的標(biāo)識(shí)符分子可使用例如PCR擴(kuò)增和如下所示的限制酶消化而用于隨后輪的選擇。
新標(biāo)識(shí)符分子的PCR產(chǎn)物GCA CACAGCTACACT GATGTTAGCACG TTGGAGACATGA AACATTCGA CCG TTA TGC GTA ATG GC用EcoRI切割以得到新標(biāo)識(shí)符分子GCA CACAGCTACACT GATGTTAGCACG TTGGAGACATGA AACATTCGAC該新標(biāo)識(shí)符分子包含編碼以前輪選擇中所選的被展示的分子的獨(dú)特密碼子。該標(biāo)識(shí)符分子引導(dǎo)下一庫的組裝以得到具有優(yōu)選的功能實(shí)體的庫。但正確的編碼仍通過延伸過程而確定。
實(shí)施例6.通過延伸程序編碼時(shí)的柔性接頭和環(huán)出結(jié)構(gòu)(loop-outstructure)。
編碼過程可被設(shè)計(jì)成允許在標(biāo)識(shí)符分子中形成環(huán)出區(qū)域。編碼過程也可使用在互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域和互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域之間的柔性接頭進(jìn)行。
環(huán)出技術(shù)在圖18中給出，其中標(biāo)識(shí)符區(qū)域退火至互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域上且結(jié)合區(qū)域退火至互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域上。這形成一段不直接參與退火過程的單鏈核苷酸。該退火允許通過延伸而轉(zhuǎn)移反密碼子區(qū)域和優(yōu)選另一可用于下一輪延伸的結(jié)合區(qū)域。結(jié)合區(qū)域應(yīng)該足夠長以確保正確退火和生產(chǎn)性延伸。如果結(jié)合區(qū)域太短，該延伸不完全。熟練技術(shù)人員能夠通過簡單的反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定結(jié)合區(qū)域的長度。通常5至7個(gè)核苷酸足夠用于結(jié)合區(qū)域。
另一例子是在互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域和互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域之間使用柔性接頭。這在圖19中顯示。標(biāo)識(shí)符區(qū)域確保構(gòu)件至標(biāo)識(shí)符上的有效退火。柔性接頭隨后確?；パa(bǔ)性結(jié)合區(qū)域退火至結(jié)合區(qū)域上以允許延伸。接頭可以是允許互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域和互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域之間間隔的任何種類的化學(xué)結(jié)構(gòu)，例如，聚乙二醇(PEG)，多胺，多核苷酸(如DNA，RNA，LNa)和聚碳水化合物。接頭長度可變化但標(biāo)識(shí)符區(qū)域和結(jié)合區(qū)域的同時(shí)退火必須是可能的。
使用柔性接頭的設(shè)置使用不同的PEG接頭和不同長度的互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域進(jìn)行了測試。用于該實(shí)例的PEG接頭(空間亞磷酰胺(spacephosphoramidite)9和18)得自Glen research(分別為目錄#10-1909和10-1918)。
以下顯示延伸的標(biāo)識(shí)符分子的序列。在標(biāo)識(shí)符區(qū)域和互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)域之間有21個(gè)核苷酸長的退火。因此有42個(gè)核苷酸的區(qū)域，表示以前輪編碼中的延伸密碼子。促進(jìn)延伸的互補(bǔ)性結(jié)合區(qū)域是9核苷酸區(qū)域，另外測試5和14核苷酸區(qū)域的延伸。最后有允許延伸的14核苷酸區(qū)域。
F引物 引發(fā)位點(diǎn) 延伸[----- 21-----------] [------------------------ 42 -----------------------] [-- 9 --] [----- 14 ----]ACCTCACCTGTGTATCGAGCG GCAGTAGCGGGCCTCGTACGACCTGTTCGGCTACTGCCGAGCCCGCATCGCTGGAGTCGACACATAGCTCGC-------------------------- X --------------------------GGCGTAGCG CATAG CGCAATCGC▲ ↑互補(bǔ)性 柔性接頭 互補(bǔ)性標(biāo)識(shí)符區(qū)結(jié)合區(qū)具有柔性接頭的構(gòu)件oligo使用標(biāo)準(zhǔn)程序(Promega，cat#4103)使用T4多核苷酸激酶用32P進(jìn)行5’-標(biāo)記。該標(biāo)識(shí)符分子與構(gòu)件在延伸緩沖劑(20mM Hepes，40mM KCl，8mM MgCl2，pH 7.4，10mM DTT)中通過加熱至80攝氏度2min并隨后慢慢冷卻至約20攝氏度而退火。延伸在30攝氏度下使用約20個(gè)單位的測序酶(USB)1小時(shí)而進(jìn)行。寡核苷酸復(fù)合物隨后使用微旋凝膠過濾(BioRad)純化。將甲酰胺染料加入樣品中，然后加載到10％脲聚丙烯酰胺凝膠上。該凝膠使用放射自顯影法(Kodak，BioMax膠卷)顯影。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖20中給出。
該凝膠顯示泳道1，在結(jié)合區(qū)域中有5、9或14個(gè)核苷酸的三個(gè)5’-標(biāo)記(32P)構(gòu)件oligo的混合物；泳道2，使用具有9空間接頭和18核苷酸結(jié)合區(qū)域的構(gòu)件oligo延伸；泳道3，使用具有9空間接頭和9核苷酸結(jié)合區(qū)域的構(gòu)件oligo延伸；泳道4，使用不具有接頭和具有9核苷酸結(jié)合區(qū)域的構(gòu)件oligo延伸；泳道5，使用具有9空間接頭和14核苷酸結(jié)合區(qū)域的構(gòu)件oligo延伸；泳道6，使用具有18空間接頭和14核苷酸結(jié)合區(qū)域的構(gòu)件oligo延伸；泳道7，使用不具有接頭和具有14核苷酸結(jié)合區(qū)域的構(gòu)件oligo延伸；泳道8，使用不具有接頭和具有5核苷酸結(jié)合區(qū)域的構(gòu)件oligo延伸。
結(jié)果顯示，有效延伸可使用柔性接頭以及結(jié)合區(qū)域而實(shí)現(xiàn)。結(jié)果還顯示，延伸在沒有柔性接頭和僅小(5個(gè)核苷酸)結(jié)合區(qū)域時(shí)是可能的。最后的結(jié)果是在該實(shí)施例開始處描述的環(huán)出設(shè)置的一個(gè)例子，其中環(huán)出區(qū)域是在以上序列中描述的42個(gè)核苷酸。
實(shí)施例7從通過chemeticsTM編碼的484-元小分子庫中選擇整合蛋白αVβ3配體程序的概述 DF藥物片段/功能實(shí)體B生物素SA鏈霉抗生物素蛋白用于生產(chǎn)雙功能復(fù)合物庫(其中庫的每個(gè)成員包含合成分子和可被解碼以確立合成分子的合成歷史的標(biāo)識(shí)符)的方法包括幾個(gè)步驟，例證如下。在第一步驟(一般程序1)中，四種不同的標(biāo)識(shí)符寡核苷酸被加載以支架分子或藥物片段。在該實(shí)施例中，加載使用在標(biāo)識(shí)符oligo上的氨基基團(tuán)作為用于藥物片段/支架分子的連接點(diǎn)而進(jìn)行。標(biāo)識(shí)符可被認(rèn)為是新生雙功能復(fù)合物。
為了制備構(gòu)件oligo，相同的載體(carrier)oligo起始使用一般程序2被加載以十一種不同的藥物片段。十一種加載的載體oligo隨后使用一般程序3被連接至第一和第二輪的反密碼子oligo上，這樣得到11種用于第一輪的構(gòu)件和十一種用于第二輪的構(gòu)件。
庫形成在一般程序4中詳細(xì)描述和包括將四種不同的標(biāo)識(shí)符oligo與第一輪的十一種不同的構(gòu)件混合。為了偏離庫，一種標(biāo)識(shí)符和一種第一輪構(gòu)件以低于其它組分量100倍的量加入。在提供用于標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件之間退火的條件下，標(biāo)識(shí)符oligo的支架分子和藥物片段之間進(jìn)行交聯(lián)。標(biāo)識(shí)符oligo隨后使用聚合酶和使用構(gòu)件反密碼子作為標(biāo)識(shí)符而延伸。在延伸之后，藥物片段通過斷裂藥物片段和oligo之間的鍵而從構(gòu)件中釋放。用過的構(gòu)件oligo通過鏈霉抗生物素蛋白珠粒被分離。
第二輪包括將構(gòu)件加入在第一輪中得到的新生標(biāo)識(shí)符-合成分子復(fù)合物中。為了偏離庫，將十一種第二輪構(gòu)件之一以低于10種其它構(gòu)件的用量100倍的量加入。第二輪遵循與第一輪上述的相同的方案。所形成的庫是4*11*11＝484個(gè)成員。已知是靶的配體的一個(gè)成員僅以3*108雙功能復(fù)合物之一的庫濃度出現(xiàn)。
庫隨后經(jīng)受選擇過程，例如公開于一般程序5。選擇包括將庫加入涂覆有固定靶的孔中。在該庫與靶孵育之后，將庫的未結(jié)合成員通過洗滌而去除并斷裂合成分子和標(biāo)識(shí)符之間的鍵。裂開的標(biāo)識(shí)符被收集和通過PCR而擴(kuò)增。擴(kuò)增的標(biāo)識(shí)符使用一般程序6解碼。
一般程序1標(biāo)識(shí)符oligo的加載將10μL三乙醇胺(TEA)(0.1M，在DMF中)與10μL具有戊-4-烯醛作為胺保護(hù)基團(tuán)的構(gòu)件(BB)(0.1M，在DMSO中)混合。從該混合物中取出6.7μL并與3.3μL EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽](0.1M，在DMF中)混合和在25攝氏度下孵育30分鐘。將10μL構(gòu)件-EDC-TEA混合物加入在0.1M HEPES緩沖劑((4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸，SIGMA)(pH 7.5)中的10μL氨基oligo并與oligo孵育30分鐘。
在該半小時(shí)過程中，將另一6.7μL BB-TEA混合物與3.3μLEDC(0.1M，在DMF中)混合和在25攝氏度下孵育30分鐘。將10μL該第二BB-EDC-TEA混合物與10μL 0.1M HEPES緩沖劑一起隨后加入氨基oligo混合物中以保持1∶1比率的DMSO/DMF∶H2O。隨后混合物被孵育30分鐘。
在該半小時(shí)過程中，將另一6.7μL BB-TEA混合物與3.3μLEDC(0.1M，在DMF中)混合和在25攝氏度下孵育30分鐘。將10μL該第三BB-EDC-TEA混合物與10μL 0.1M HEPES緩沖劑一起隨后加入氨基oligo混合物中以保持1∶1比率的DMSO/DMF∶H2O。隨后混合物被孵育30分鐘。
加載的oligo隨后通過使用以水平衡的柱(Biospin P-6，BioRad)進(jìn)行凝膠過濾而純化。戊-4-烯醛胺保護(hù)基團(tuán)隨后通過加入0.25倍體積的25mM I2(在1∶1水∶四氫呋喃(THF)中)和在37攝氏度下孵育2小時(shí)而去除。該混合物隨后通過使用以水平衡的旋轉(zhuǎn)柱(Biospin P-6，BioRad)進(jìn)行凝膠過濾而純化。加載的標(biāo)識(shí)符oligo通過ES-MS進(jìn)行分析。
實(shí)施例7.1.1標(biāo)識(shí)符oligo 1.1 N5′-氨基-修飾劑5(Glen research cat#10-1905-90)S間隔基C3 CPG(Glen research cat#20-2913-01)PPC Spacer亞磷酰胺(Glen research cat#10-4913-90)
加載的標(biāo)識(shí)符oligo 1.1通過ES-MS進(jìn)行分析預(yù)期的質(zhì)量11709Da觀察到的質(zhì)量11708Da實(shí)施例7.1.2標(biāo)識(shí)符oligo 1.25’NSPACCTCAGCTGTGTATCGAGCGGCAGCAGTGCCG-TCG-3’N5′-氨基-修飾劑5(Glen research cat#10-1905-90)S間隔基C3CPG(Glen research cat#20-2913-01)PPC Spacer亞磷酰胺(Glen research cat#10-4913-90) 加載的標(biāo)識(shí)符oligo 1.2通過ES-MS進(jìn)行分析預(yù)期的質(zhì)量11647Da觀察到的質(zhì)量11641Da實(shí)施例7.1.3標(biāo)識(shí)符oligo 1.35’-NSPACCTCAGCTGTGTATCGAGCGGCAGCGCACACG-TCG-3’N5′-氨基-修飾劑5(Glen research cat#10-1905-90)S間隔基C3 CPG(Glen research cat#20-2913-01)
PPC Spacer亞磷酰胺(Glen research cat#10-4913-90) 加載的標(biāo)識(shí)符oligo 1.2通過ES-MS進(jìn)行分析預(yù)期的質(zhì)量11761Da觀察到的質(zhì)量11759Da實(shí)施例7.1.4標(biāo)識(shí)符oligo 1.45’-NSPACCTCAGCTGTGTATCGAGCGGCAGCGGATACG-TCG-3’N5′-氨基-修飾劑5(Glen research cat#10-1905-90)S間隔基C3 CPG(Glen research cat#20-2913-01)PPC Spacer亞磷酰胺(Glen research cat#10-4913-90)加載的標(biāo)識(shí)符oligo 預(yù)期的質(zhì)量11775Da觀察到的質(zhì)量11775Da
一般程序2載體oligo的加載將10-15nmol載體oligo 2凍干和重新溶解在27.5μl H2O中。向其中加入7.5μl 1M HEPES pH 7.5，10μl 2-氨基-戊-4-烯醛保護(hù)(烯丙基甘氨酸)構(gòu)件(0.1M在二甲基亞砜中)，和5μl DMT-MM[4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-噻嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯化物](0.5M在水)?；旌衔镌?5-30攝氏度下孵育4-16小時(shí)。oligo通過凝膠過濾(Biospin P-6，BioRad)而純化。為了將構(gòu)件的甲基酯部分轉(zhuǎn)化成羧酸，加入5μl 0.4M NaOH并將混合物在80攝氏度下孵育20min?；旌衔镫S后通過加入10μl 0.5M HEPES pH 7.5和5μl 0.4M HCl而中和。加載的構(gòu)件oligo通過凝膠過濾(Biospin P-6，BioRad)而純化和通過ES-MS而分析。
載體oligo 23’-2GGAGTCGACACATAGCTCGCp-5’2羧基dT(Glen research cat#10-1035-90)p5’磷酸實(shí)施例7.2.1
加載的載體oligo 2.1通過ES-MS進(jìn)行分析預(yù)期的質(zhì)量6856Da觀察到的質(zhì)量6857Da實(shí)施例7.2.2 加載的載體oligo 2.2通過ES-MS進(jìn)行分析預(yù)期的質(zhì)量6944Da觀察到的質(zhì)量6945Da實(shí)施例7.2.3 加載的載體oligo 2.3通過ES-MS進(jìn)行分析預(yù)期的質(zhì)量6798Da觀察到的質(zhì)量6800Da
實(shí)施例7.2.4 加載的載體oligo 2.4通過ES-MS進(jìn)行分析預(yù)期的質(zhì)量6917Da觀察到的質(zhì)量6919Da
表I
一般程序3反密碼子低聚物與加載的載體oligo的連接將500pmol加載的載體oligo與750pmol反密碼子低聚物和750pmol夾板oligo混合。將混合物凍干和重新溶解在15μl水中。低聚物通過加熱和慢慢冷卻至20攝氏度而退火。加入15μl TaKaRa連接酶混合物(Takara Bio Inc)并將反應(yīng)體系在20攝氏度下孵育l小時(shí)。將混合物通過凝膠過濾(Biospin P-6，BioRad)純化并通過在NovexTBE-脲凝膠(Invitrogen)上跑膠等分試樣而檢測連接效率。
用于第一輪編碼的構(gòu)件oligo的實(shí)施例實(shí)施例7.3.1.1 2羧基dT(Glen research cat#10-1035-90)P5’磷酸X5’生物素連接效率＞95％
實(shí)施例7.3.1.2 連接效率＞95％實(shí)施例7.3.1.3 連接效率＞95％
表II
用于第二輪編碼的構(gòu)件oligo的實(shí)施例實(shí)施例7.3.2.1構(gòu)件oligo 3.2.1 連接效率＞95％實(shí)施例7.3.2.2
連接效率＞95％實(shí)施例7.3.2.3 連接效率＞95％
表III
一般程序4通過chemeticsTM編碼小分子庫實(shí)施例7.4.1通過chemeticsTM編碼484-元小分子庫實(shí)施例7.4.1.1第一編碼輪將2pmol加載的標(biāo)識(shí)符oligo 1.1與200pmol每個(gè)加載的標(biāo)識(shí)符oligo 1.2，1.3，和1.4合并(總共602pmol加載的標(biāo)識(shí)符oligo)。將這些與0.7pmol構(gòu)件oligo 3.1.3.，和10種不同的其它第一輪構(gòu)件oligo各72.7pmol混合(如3.1.1和3.1.2；總共727pmol加載的構(gòu)件oligo)。將oligo凍干和重新溶解在50μl延伸緩沖劑(EX)[20mMHEPES，150mM NaCl，8mM MgCl2]中?；旌衔锉患訜嶂?0攝氏度和慢慢冷卻至20攝氏度以使標(biāo)識(shí)符和構(gòu)件oligo有效退火。加入5μl 0.5M DMT-MM(在水中)并將混合物在37攝氏度下孵育4小時(shí)。
標(biāo)識(shí)符oligo在構(gòu)件oligo標(biāo)識(shí)符上的延伸通過加入3μl每種脫氧核苷酸三磷酸[dATP，dGTP，dCTP，dTTP]的10mM混合物和3μl 13個(gè)單位/μl測序酶(Amersham Biosciences)而進(jìn)行?；旌衔镫S后在30攝氏度孵育過夜。隨后將3μl 2M NaOH加入并將混合物在80攝氏度下孵育10分鐘，隨后通過加入3μl 2M HCl而中和。將該混合物隨后通過從凝膠過濾柱(Biospin P-6，BioRad)中經(jīng)過而純化。加入0.25倍體積的25mM I2(在1∶1THF∶水中)，混合和在37攝氏度下孵育2小時(shí)。加入60μl結(jié)合緩沖劑(BF)[100mM HEPES，150mM NaCl]和水300μl。
將混合物加入在BF緩沖劑中預(yù)洗滌3次的鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖珠粒(Amersham Biosciences)中并在室溫下孵育10分鐘，隨后在輕微攪拌下在冰上孵育10分鐘。珠粒隨后用水洗滌三次。延伸的標(biāo)識(shí)符oligo通過施用100μl NH3 1∶1(在水中)和在室溫下孵育5分鐘而從結(jié)合到鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖珠粒上的構(gòu)件oligo中脫離。
7.4.1.2第二編碼輪向洗脫物中加入0.36pmol第二輪加載的構(gòu)件oligo 3.2.2和各36.4pmol的10種不同的其它第二輪構(gòu)件oligo(如3.2.1和3.2.3；總共364pmol加載的第二輪構(gòu)件oligo)并將混合物凍干和重新溶解在50μl EX緩沖劑中。編碼基本上按照7.1.1所述而進(jìn)行。
7.4.1.3最終延伸將洗脫的標(biāo)識(shí)符oligo凍干和溶解在50μl EX緩沖劑中。隨后將200pmol引物E38[5’-XTTTTAGATGGCAGAT-3’，X＝CXS生物素]。退火通過將混合物在80攝氏度下加熱并慢慢冷卻至20攝氏度而進(jìn)行。標(biāo)識(shí)符oligo的延伸通過加入3μl每種脫氧核苷酸三磷酸[dATP，dGTP，dCTP，dTTP]的10mM混合物和3μl 13單元/μl測序酶而進(jìn)行?；旌衔镫S后在30攝氏度孵育2小時(shí)。將該混合物隨后通過從凝膠過濾柱(Biospin P-6，BioRad)中經(jīng)過而純化。該洗脫物用于選擇。取出等分試樣(樣品7.1.3)，用于分析選擇程序中的輸入。
一般程序5選擇Maxisorp ELISA孔(NUNC A/S，Denmark)在4攝氏度下用在PBS緩沖劑[2.8mM NaH2PO4，7.2mM Na2HPO4，0.15M NaCl，pH 7.2]中的各100μL的2μg/mL整合蛋白αVβ3(Bachem)包被過夜。隨后整合蛋白溶液被替換為200μl封閉緩沖劑[TBS，0.05％ Tween 20(SigmaP-9416)，1％牛血清白蛋白(Sigma A-7030)，1mM MnCl2]，在室溫下放置3小時(shí)。隨后孔用封閉緩沖劑洗滌10次并將編碼的庫在用封閉緩沖劑稀釋100倍之后加入至孔中。在室溫下2小時(shí)孵育之后，孔用封閉緩沖劑洗滌10次。在最終洗滌之后，清除孔的洗滌緩沖劑并隨后倒置并暴露于300-350nm的UV光30秒。隨后將100μl沒有Tween-20的封閉緩沖劑立即加入每個(gè)孔中，將孔振蕩30秒，并取出包含洗脫的標(biāo)識(shí)符的溶液用于PCR分析(樣品5.1)一般程序6選擇輸入和輸出的分析使用對(duì)應(yīng)于標(biāo)識(shí)符oligo的5’端的引物和E38引物針對(duì)選擇的輸入(樣品7.3.1)和輸出(樣品5.1)進(jìn)行PCR。PCR使用Ready-To-Go(RTG)PCR珠粒(Amersham Biosciences)和10pmol每種引物在25μl的反應(yīng)體積中進(jìn)行。PCR反應(yīng)包括，94攝氏度下2分鐘的起始變性步驟，隨后在94攝氏度下變性30秒、在58攝氏度下退火1分鐘和在72攝氏度下延伸1分鐘的30-45個(gè)周期。包括在72攝氏度下2分鐘的最終延伸步驟。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳而分離并將對(duì)應(yīng)于預(yù)期大小的帶從凝膠上切割并使用QIA快速凝膠提取試劑盒(QIAGEN)純化。
為了測序各個(gè)PCR片段，將純化PCR產(chǎn)物根據(jù)制造商的教導(dǎo)克隆到pCR4-TOPO載體(Invitrogen)中。所得混合物使用標(biāo)準(zhǔn)步驟用于轉(zhuǎn)化TOPl0大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)。細(xì)胞在包含100μg/ml氨芐西林的生長培養(yǎng)基上涂板和在37攝氏度下放置12-16小時(shí)。
挑取各個(gè)E.coli克隆并轉(zhuǎn)移至包含50μl水的PCR孔。這些孔隨后煮沸5分鐘并將來自每個(gè)孔的20μl混合物使用RTG PCR珠粒和5pmol每種M13正和反向引物根據(jù)制造商的教導(dǎo)用于PCR反應(yīng)。每種PCR產(chǎn)物的樣品隨后用外切核酸酶I(USb)和蝦堿性磷酸酶(USb)處理以去除降解的單鏈DNA和dNTPs并使用DYEnamic ET循環(huán)測序試劑盒(Amersham Biosciences)根據(jù)制造商的教導(dǎo)測序并在MegaBace 4000毛細(xì)管測序儀(Amersham Biosciences)上分析該反應(yīng)。序列輸出用ContigExpress軟件(Informax Inc.)分析。
存在于庫中的藥物片段的概述
表IV
該庫具有編碼來自3*108標(biāo)識(shí)符之一的整合蛋白αVβ3配體A(Feuston B.P.等人，Journal of Medicinal Chemistry，2002，45，5640-5648中的分子7)的能力。
從上表可以看出，該庫具有每3*108標(biāo)識(shí)符編碼一個(gè)配體A的能力(1×1×1＝1個(gè)/301×1001×1001約3*108個(gè))實(shí)施例7.6.1選擇步驟的輸入和選擇步驟的輸出的測序分析結(jié)果。
與編碼配體A相容的密碼子組合未在來自選擇之前的編碼庫的28個(gè)序列中發(fā)現(xiàn)，這與該密碼子組合預(yù)期的低豐度(3*108中的1個(gè))相符。
在整合蛋白αVβ3-包被的孔中進(jìn)行選擇之后，與配體A的編碼相容的密碼子組合存在于來自編碼庫的19個(gè)序列中的5個(gè)中。
這些數(shù)對(duì)應(yīng)于富集系數(shù)(3*108/(19/7))＝8*107。
實(shí)施例8使用大小排阻柱選擇編碼的分子該實(shí)施例說明可以使用柱分離針對(duì)各種靶進(jìn)行復(fù)合物選擇。在該實(shí)施例中，使用大小排阻層析(SEC)，但也可使用其它種類的層析，其中將靶結(jié)合的復(fù)合物從未結(jié)合的復(fù)合物中分離出來。
復(fù)合物在該實(shí)施例中以連接到具有預(yù)定序列的寡核苷酸序列上的生物素分子為例。因此，標(biāo)識(shí)符的核苷酸序列確定了作為生物素的合成分子的身份。編碼序列可具有任何長度且可被分成用于編碼各種構(gòu)件的離散區(qū)域，見本文在別處的討論。另外，展示分子可具有線性或支架結(jié)構(gòu)。
生物素-AATTCCGGAACATACTAGTCAACATGA生物素已知結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白。生物素與鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合可使標(biāo)識(shí)符與靶分子連接和因此改變標(biāo)識(shí)符的物理和化學(xué)性能，如表觀分子量。該改變可使用如大小排阻層析檢測將78pmol復(fù)合物分子加載到Superdex 200，PC 3.2/30柱(_KTA-FPLC，AmershamPharmaciaBiotech)上并在PBS沖劑中在流速0.050ml/min下分析。如下可看出，復(fù)合物分子停留時(shí)間是約35分鐘。如果靶(83pmol鏈霉抗生物素蛋白)在相同的條件下被分析，停留時(shí)間是約相同的。靶分子的低吸收是由于用于測量的波長(260nm)所致。在該波長下，消光系數(shù)對(duì)于復(fù)合物中的核苷酸是高的但對(duì)于蛋白質(zhì)靶是低的。
但如果復(fù)合物分子與靶分子(78pmol復(fù)合物和83pmol靶在PBS緩沖劑中溫育約1h)預(yù)混合以允許結(jié)合并隨后在相同的條件下分析，停留時(shí)間變化明顯(28分鐘)。該變化是由于復(fù)合物結(jié)合至靶上而導(dǎo)致的分子量(或流體力學(xué)體積)增加所致。這使得靶結(jié)合的復(fù)合物與未結(jié)合的復(fù)合物分離。包含復(fù)合物和靶分子的級(jí)分被合并并使用合適的引物擴(kuò)增。該擴(kuò)增的標(biāo)識(shí)符可隨后用于解碼所富集的展示分子的結(jié)構(gòu)。
對(duì)雙功能復(fù)合物的庫進(jìn)行柱選擇的策略具有兩個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)。首先，富集(靶結(jié)合的)的復(fù)合物在未結(jié)合的復(fù)合物之前被洗脫，這急劇降低來自未結(jié)合的復(fù)合物的背景。第二，在柱上的富集由于在基質(zhì)孔中的所有的分離步驟而是大程度的。
使用該方案對(duì)靶結(jié)合的復(fù)合物的分離取決于該復(fù)合物的分子量但主要是靶分子量。靶分子量可通過將靶連接至能夠增加表觀分子量的支持物上而調(diào)節(jié)。增加的分子量可通過減少在柱上的停留時(shí)間而提高分離作用。這可例如使用融合蛋白質(zhì)，抗體，珠粒，或以多聚體形式交聯(lián)靶而進(jìn)行。因此，靶蛋白質(zhì)可被表達(dá)為融合蛋白質(zhì)或特定抗體可用于增加分子量。靶可被固定在能夠允許分離的小珠粒上且靶可使用標(biāo)準(zhǔn)試劑交聯(lián)形成多聚體或交聯(lián)至載體分子，例如另一蛋白質(zhì)上。優(yōu)選，增加分子量使得靶分子在柱的外水體積中洗脫。
可使用的其它種類的柱分離的例子是親和層析，疏水相互作用層析(HIC)，和離子交換層析?？捎糜诖笮∨抛鑼游龅某齋uperdex之外的柱介質(zhì)的例子是Sephacryl，Sepharose或Sephadex。
實(shí)施例9通過分開-和-混合而形成25-元庫和配體選擇人整合蛋白受體αv/βIII涉及許多生物功能如炎癥反應(yīng)和血栓形成以及細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移瘤傳播。αv/βIII的天然配體包含與受體結(jié)合袋相互作用的RGD三-肽共有基序。因此，許多醫(yī)學(xué)研究集中于合成和鑒定對(duì)αv/βIII受體具有增加的親和性的小分子RGD-模擬物。包含偶聯(lián)至GD二肽上的精氨酸生物等排物(bioisostere)的一種模擬物，F(xiàn)euston 5(Feuston等人，J Med Chem.2002 Dec 19；45(26)5640-8.)與RGD-三肽相比具有10倍增加的αv/βIII(KD＝111nM)親和性。
在此，使用分開和混合方法合成25元小分子庫，其中包括Feuston 5配體和24種其它的小分子。庫根據(jù)與受體的相互作用而篩選且DNA通過PCR而擴(kuò)增，測序和鑒定相應(yīng)的小-分子配體。
方案庫生成圖22和圖23顯示用于合成庫的一般方案。起始，36nt寡核苷酸(ID)5′-XACCTCAGCTGTGTATCGAGCGGCAGCGGCCTCGTCG通過標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)(購自DNA Technology A/S Denmark)而合成，其中包含通過間隔基-PEGl8(Glen research目錄#10-1918-90)和光可斷裂的(Glen research目錄#10-4913)間隔基鍵接的5’-端氨基-基團(tuán)(Glen research目錄#10-1905-90)。1nmol ID寡核苷酸使用以下支架加載程序A加載上戊烯?；?Asp(OMe)-OH將1nmol ID寡核苷酸凍干并隨后溶解在20μl具有90mM磺基-N-羥基琥珀酰亞胺(sNHS，Merck)的100mM Na-硼酸鹽緩沖劑(pH 8.0)中。支架的預(yù)活化將15μl在DMSO中的100mM戊烯?；?Asp(OMe)-OH與15μl在DMF中的100mM1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，Merck)溫育并在加入至ID溶液之前在30攝氏度下溫育30min。在30攝氏度下溫育45min之后，加入另外30μl預(yù)活化支架并將溶液在30攝氏度下溫育另外45min。過量的支架，活化劑，溶劑和鹽通過雙凝膠過濾使用Bio-rad Microspin柱6去除在MS-級(jí)H2O中洗脫。加載通過電噴霧-MS(Bruker Inc)分析而檢驗(yàn)。隨后，氨基-保護(hù)基團(tuán)通過加入0.2倍體積的在混合物THF/H2O(1∶1)中的25mM碘并在37攝氏度下溫育2h而去除。過量碘通過加入20mM 2-巰基乙醇而淬滅，之后使用Bio-rad 6 Microspin柱進(jìn)行凝膠過濾純化。根據(jù)MS-分析，加載的和去保護(hù)的ID寡核苷酸被估計(jì)＞75％純(數(shù)據(jù)未示)。
500pmol D-加載的ID oligo通過在80攝氏度下變性2min隨后慢慢冷卻至環(huán)境溫度而被退火至500pmol具有序列5’-TGTGCGACGAGGCCGCTGC的互補(bǔ)性oligo上。具有4nt突出端(用于有效退火和連接)的雙鏈oligo對(duì)(ID-ds)使用以下步驟用于分開&混合反應(yīng)程序，以下示意給出加入第2位的密碼子和游離反應(yīng)物將500pmol ID-ds分成5個(gè)孔(在此，eppendorf管)。將100pmol具有以下序列的特定第二位密碼子寡核苷酸Z1-0pCACAAGTACGAACGTGCATCAGAG/pTCCTCTCTGATGCACGTTCGTACTZ1-1pCACATAGTCTCCTCCACTTCCATG/pTCCTCATGGAAGTGGAGGAGACTAZ1-2pCACATACATCGTTCCAGATACCG/pTCCTCATGGAAGTGGAGGAGACTAZ1-3pCACATCCAGTGCAAGACTGAACAG/pTCCTCTGTTCAGTCTTGCACTGGAZ1-4pCACAAGCATCACTACTCTGTCTGG/pTCCTCCAGACAGAGTAGTGATGCT
加入每個(gè)孔中并將oligo在20μl體積中使用連接緩沖劑[30mMTris-HCl(pH 7.9)，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP]和10個(gè)單位的T4-DNA連接酶在環(huán)境溫度下連接1小時(shí)。
隨后，將5種連接產(chǎn)物使用Biorad 6旋轉(zhuǎn)柱根據(jù)制造商的教導(dǎo)各個(gè)純化并凍干。然后，使特定反應(yīng)物與支架根據(jù)圖22所示的方案使用上述的加載方案A進(jìn)行反應(yīng)。過量游離反應(yīng)物，試劑和緩沖劑通過凝膠過濾而去除。將洗脫物合并，凍干和再懸浮在40μl H2O中，然后加入10μl 25mM碘(在THF/H2O中，比率1∶1)用于去保護(hù)。
N-戊烯?；Ｗo(hù)的甘氨酸反應(yīng)物與ID oligo反應(yīng)和隨后使用碘去保護(hù)。反應(yīng)在37攝氏度下溫育2h。過量碘通過加入1μl 1M 2-巰基乙醇而淬滅并在環(huán)境溫度下放置5min，然后使用spin-凝膠過濾(Bio-rad 6)而純化樣品。
樣品被分成5個(gè)孔用于使用下列密碼子寡核苷酸而加入第三位密碼子Z0-0pAGGACGAGCAGGACCTGGAACCTGGTGCGTTCCTCCACCACGTCTCCG/pGCACCAGGTTCCAGGTCCTGCTCGZ0-1pAGGACTCGACCACTGCAGGTGGAGCTCCGTTCCTCCACCACGTCTCCG/pGGAGCTCCACCTGCAGTGGTCGAGZ0-2pAGGACGTGCTTCCTCTGCTGCACCACCGGTTCCTCCACCACGTCTCCG/pCGGTGGTGCAGCAGAGGAAGCACGZ0-3pAGGACCTGGTGTCGAGGTGAGCAGCAGCGTTCCTCCACCACGTCTCCG/pGCTGCTGCTCACCTCGACACCAGGZ0-4pAGGACTCGACGAGGTCCATCCTGGTCGCGTTCCTCCACCACGTCTCCG/pGCGACCAGGATGGACCTCGTCGAGp＝5’磷酸。
然后與游離反應(yīng)物反應(yīng)，方式如在第二位時(shí)描述的或在圖22中給出的，只是以下不同F(xiàn)3反應(yīng)物使用方案A不能有效地反應(yīng)，因?yàn)镕3在有機(jī)溶劑中的溶解度差。因此，F(xiàn)3使用以下方案(方案B)進(jìn)行反應(yīng)將連接的和凍干的樣品溶解在35μl 100mM Na-硼酸鹽緩沖劑(pH8.0)中，然后加入10μl在水中的100mM F3反應(yīng)物和5μl 500mM 4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯化物(DMT-MM，羧酸活化劑)并在25攝氏度下溫育2h。在偶聯(lián)反應(yīng)之后，過量反應(yīng)物，試劑和鹽通過凝膠過濾而去除，方式如描述于方案A中的。剩余的步驟如對(duì)于位置2所述的方式而進(jìn)行。
在進(jìn)行選擇步驟之前，進(jìn)行鏈交換反應(yīng)以確保沒有組裝錯(cuò)誤退火的oligo。鏈-交換通過總共體積80μl的包含200μM脫氧核糖核苷酸(dNTP)的測序酶緩沖劑中退火200pmolAH361oligo(5’-CGGAGACGTGGTGGAGGAAC-3’)，然后加入20個(gè)單位的測序酶和在30攝氏度下溫育1h而進(jìn)行。在延伸之后，反應(yīng)混合物用于選擇步驟而沒有進(jìn)一步純化。
選擇Maxisorp ELISA孔(NUNC A/S，Denmark)分別用在PBS緩沖劑[2.8mM NaH2PO4，7.2mM Na2HPO4，0.15M NaCl，pH 7.2]中的100μL 2μg/mL整合蛋白αVβ3(Bachem)在4攝氏度下包被過夜。隨后將整合蛋白溶液替換為200μl封閉緩沖劑[TBS，0.05％Tween 20(Sigma P-9416)，1％牛血清白蛋白(Sigma A-7030)，1mM MnCl2]，在室溫下置1小時(shí)。隨后將孔用250μl封閉緩沖劑洗滌2次并在用封閉緩沖劑稀釋編碼庫20倍之后將5μl編碼庫加入孔中。在室溫下2小時(shí)孵育之后，孔用20×250μl封閉緩沖劑洗滌。
洗脫在最終洗滌之后，清除孔的洗滌緩沖劑并隨后倒置并使用被設(shè)定為70％功率的透過式照明器(trans-illuminator)使孔暴露于300-350nm的UV光30秒將100μl沒有Tween-20的封閉緩沖劑立即加入每個(gè)孔中，將孔振蕩30秒，并取出包含洗脫模板的溶液用于PCR分析。
PCR擴(kuò)增關(guān)于輸入和輸出的PCR使用對(duì)應(yīng)于Frw-27oligo(ACCTCAGCTGTGTATCGAG)的5’端的引物和AH361引物。5μl洗脫的DNA用于25μl反應(yīng)體系的PCR，其中使用10μl Eppendorphhotmastermix 2.5×和AH361&Frw-27各10pmol。進(jìn)行PCR(ENRICH30)94攝氏度2min，隨后30周期[94攝氏度30sec，58攝氏度1min，72攝氏度1min]，隨后72攝氏度10min。
克隆和測序?qū)OP0-TA(Invitrogen Cat#K4575-J10)連接物與4μl PCR產(chǎn)物，1μl鹽溶液，1μl載體反應(yīng)。反應(yīng)物在RT下孵育30min。將熱休克的感受態(tài)TOPl0大腸桿菌細(xì)胞融化并放在冰上。加入5μl連接反應(yīng)物。在冰上30min之后，在42攝氏度水中熱休克30sec，隨后放在冰上。加入250μl SOC并將細(xì)胞在37攝氏度下孵育1h，然后鋪展在LB-氨芐青霉素板上，隨后在37攝氏度下孵育過夜。
挑選大腸桿菌單克隆并轉(zhuǎn)移至包含50μl水的PCR孔。菌落在94攝氏度下孵育5分鐘并將20μl用于與各5pmol的TOP0引物M13前&M13反(AH365/AH366)和Ready-To-Go PCR珠粒(Amersham)在25μl PCR反應(yīng)中使用，其中使用PCR程序EK 05094攝氏度2min，隨后30×(94攝氏度4sec，50攝氏度30sec，72攝氏度1min)，隨后72攝氏度10min。
引物和游離核苷酸通過將1μl EXO/SAP混合物1∶1加入2μl PCR產(chǎn)物中而降解。孵育在37攝氏度下進(jìn)行15min并隨后在80攝氏度下進(jìn)行15min。加入5pmol T7引物(AH368)并加入水至12μl.隨后，加入8μl DYEnamic ET循環(huán)測序終止劑混合物，隨后使用30輪(95攝氏度20sec，50攝氏度15sec，60攝氏度1min)進(jìn)行PCR-循環(huán)。純化使用seq96 spin板(Amersham)進(jìn)行，隨后在MegaBace排序器上進(jìn)行分析。
庫序列輸出
18個(gè)成功的序列提供來自選擇步驟的分離DNA的信息并在以下給出輸出序列 在1位上被加亮的5聚體序列對(duì)應(yīng)于天門冬氨酸，在2位(中心)上的加亮20聚體序列對(duì)應(yīng)于甘氨酸和加亮的20聚體序列(距連接突出物+4個(gè)堿基)對(duì)應(yīng)于F3構(gòu)件。因此，18個(gè)序列中的16個(gè)鑒別出確切的Feuston-5配體(F3-G-D)為結(jié)合整合蛋白αv/βIII受體的單個(gè)優(yōu)勢小分子。注意，僅F3 BB在3位上被鑒別，這支持了向該精氨酸生物等排物的非常強(qiáng)的偏移。
數(shù)據(jù)表明，小分子庫的化學(xué)合成，標(biāo)記，選擇和鑒別法在使用本技術(shù)時(shí)是高度有效的，預(yù)期可容易地規(guī)?；涂蓱?yīng)用于包含超過108-1010種不同分子的庫。
圖22顯示對(duì)庫生成的概述，其中使用加載有D(天冬氨酸)的獨(dú)特的第一位oligo，在第二位上5種不同的反應(yīng)物/oligo對(duì)和在第三位上5種不同的反應(yīng)物/oligo對(duì)。最終，組裝成由1×5×5＝25種分別連接到其相應(yīng)的獨(dú)特DNA密碼子上的不同三聚體組成的庫。箭頭表示連接的位置。
實(shí)施例9編碼的多組分反應(yīng)(MCR)產(chǎn)物9.1使用4-羧基苯甲醛制備包含醛的支架-oligo將4-羧基苯甲醛(支架)在DMF(25μL，150mM)中的溶液與25μLEDC在DMF中的150mM溶液混合?；旌衔镌?5攝氏度下放置30min。加入50μL在100mM HEPES緩沖劑pH 7.5中的氨基oligo(10nmol)并將反應(yīng)混合物在25攝氏度下放置20min。過量支架通過用EtOAc(500μL)提取而去除并將剩余的EtOAc通過在speedvac中旋轉(zhuǎn)10min而真空去除。該混合物隨后通過使用水平衡的旋轉(zhuǎn)柱(BiospinP-6，BioRad)進(jìn)行凝膠過濾而純化。加載的oligo通過ES-MS而分析。
成分 解卷積質(zhì)量 分子絕對(duì)豐度 相對(duì)豐度A 6716.11[M-H]- 301899100.00←—B 6737.93[M-H]- 50426 16.70
氨基oligo L1.1用于章節(jié)9.2Mw＝7154L1.15’-5CG ATG GTA CGT CCA GGT CGC AX3′X＝3′生物素5′5＝5’氨基C6(Glen research目錄#10-1906-90)氨基oligo L1.2用于章節(jié)9.3Mw＝6585L1.25’-GCG ACC TGG AGC ATC CAT CGX3′X＝氨基-C2-dT-3′-PO4(Glen research目錄#10-1037-90)9.2多組分反應(yīng)將苯甲醛加載的L1.1 oligo(200pmol)的溶液凍干和重新溶解在10μl H2O中。加入在甲醇中的2-甲氧基乙基胺(10μl，40mM)，在甲醇中的3-呋喃-2-基-丙烯酸(10μl，40mM)，和在甲醇中的環(huán)己基異氰化物(10μl，40mM)并在37攝氏度下孵育過夜。將反應(yīng)混合物用40H2O稀釋并通過凝膠過濾使用以水平衡的旋轉(zhuǎn)柱(Biospin P-6，BioRad)純化。oligo上的MCR-產(chǎn)物通過ES-MS而分析。
起始苯甲醛加載的L1 oligo(A)在MS-光譜中與UGI產(chǎn)物(B)一起被鑒定。
成分 解卷積質(zhì)量 分子 絕對(duì)豐度 相對(duì)豐度A 7205.25 [M-H]- 25420 100.00B 7599.64 [M-H]- 52950 70.20C 7307.54 [M-H]- 30545 90.50D 7463.73 [M-H]- 25475 33.77
9.3多組分反應(yīng)將苯甲醛加載的L1.2 oligo(320pmol)的溶液凍干和重新溶解在10μL H2O中。加入在甲醇中的2-氨基乙醇(10μL，40mM)，在甲醇中的3-甲氧基-丙酸(10μL，40mM)，和在甲醇中的異氰基乙酸乙酯(10μL，40mM)和在37攝氏度下孵育過夜。將反應(yīng)混合物用40μL H2O稀釋并通過凝膠過濾使用以水平衡的旋轉(zhuǎn)柱(Biospin P-6，BioRad)純化。oligo上的MCR-產(chǎn)物通過ES-MS而分析。
起始苯甲醛加載的L1 oligo(A)在MS-光譜中與三種產(chǎn)物，B二酮基哌嗪，C UGI產(chǎn)物和H胺產(chǎn)物一起被鑒別。
成分 解卷積質(zhì)量 分子絕對(duì)豐度 相對(duì)豐度A 6716.10 [M-E]- 27984 100.00B 6845.98 [M-H]- 13154 47.01C 6976.15 [M-H]- 8913 31.85D 6818.39 [M-H]- 10156 36.29E 6887.71 [M-H]- 10187 36.40F 6872.09 [M-H]- 8871 31.70G 6913.59 [M-H]- 5551 19.84H 6894.50 [M-H]- 4579 16.36
9.4編碼過量反應(yīng)物，活化劑，溶劑和鹽通過雙凝膠-過濾使用Bio-rad微旋柱(Microspin column)6而去除并在MS-級(jí)H2O中洗脫，并且加載通過電噴霧-MS(Bruker Inc)分析而確認(rèn)，然后編碼連接到寡核苷酸L1上的展示分子。
將已與其它三種組分反應(yīng)形成如上所述的展示分子的章節(jié)9.2中的苯甲醛加載的寡核苷酸L1.1與密碼子寡核苷酸L2，L3和L4以及夾板寡核苷酸S1，S2和S3(下示的序列)混合和使用連接酶(T4 DNA連接酶)連接。連接使用以下條件進(jìn)行。雙鏈寡核苷酸通過將編碼鏈(L1，L2，L3和L4)與夾板寡核苷酸(S1，S2和S3)混合形成7寡核苷酸雜交產(chǎn)物(用于有效退火和連接)而實(shí)現(xiàn)。使用各約50pmol的特定寡核苷酸并將寡核苷酸在20μl的體積中使用連接緩沖劑[30mM Tris-HCl(pH7.9)，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP]和10個(gè)單位的T4-DNA連接酶在環(huán)境溫度下連接1小時(shí)。
L15′-CGATGGTACGTCCAGGTCGCA-3′S15′-ATCGTGCTGCGACCT-3′L25′-GCACGATATGTACGATACACTGA-3′S25′-GTGCCATTCAGTGT-3′L35′-ATGGCACTTAATGGTTGTAATGC-3′S35′-TGTATGCGCATTAC-3′L45′-GCATA AAATCGATAATGCAC-3′包含標(biāo)簽的標(biāo)識(shí)符使用正向(FP)和反向(RP)引物使用以下條件擴(kuò)增5μl連接的標(biāo)識(shí)符寡核苷酸在使用10μl Eppendorphhotmastermix 2.5×和各10pmol的AH361&Frw-27的25μl反應(yīng)體系中用于PCR。進(jìn)行PCR(ENRICH30)94攝氏度2min，隨后30個(gè)周期的[94攝氏度30sec，58攝氏度1min，72攝氏度1min]，隨后72攝氏度10min。
FP5′-CGATGGTACGTCCAGGTCGCA-3′RP5′-GTGCATTATCGATTTGTATGC-3′
擴(kuò)增的標(biāo)識(shí)符寡核苷酸被克隆以確認(rèn)組裝的寡核苷酸包含密碼子區(qū)域(CGTCC，GTACG，AATGG和TCGAT)。將TOP0-TA(InvitrogenCat#K4575-J10)連接物與4μl PCR產(chǎn)物，1μl鹽溶液，lμl載體反應(yīng)。反應(yīng)在RT下孵育30min。將熱休克的感受態(tài)TOP10大腸桿菌細(xì)胞融化并放在冰上。加入5μl連接反應(yīng)物。在冰上30min之后，在42攝氏度水中熱休克30sec，并隨后放在冰上。加入250μl SOC并將細(xì)胞在37攝氏度下孵育1h，然后鋪展在LB-氨芐青霉素板上，隨后在37攝氏度下孵育過夜。
挑選大腸桿菌單克隆并轉(zhuǎn)移至包含50μl水的PCR孔。菌落在94攝氏度下孵育5分鐘并將20μl與各5pmol的TOP0引物M13正&M13反(AH365/AH366)和Ready-To-Go PCR珠粒(Amersham)用于25μl PCR反應(yīng)，其中使用PCR程序94攝氏度2min，隨后30×(94攝氏度4sec，50攝氏度30sec，72攝氏度1min)，隨后72攝氏度10min。
引物和游離核苷酸通過將1μl EXO/SAP混合物1∶1加入2μl PCR產(chǎn)物中而降解。孵育在37攝氏度下進(jìn)行15min并隨后在80攝氏度下進(jìn)行15min。加入5pmol T7引物(AH368)并加入水至12μl.隨后，加入8μl DYEnamic ET循環(huán)測序終止劑混合物，隨后使用30輪(95攝氏度20sec，50攝氏度15sec，60攝氏度1min)進(jìn)行PCR-循環(huán)。純化使用seq96 spin板(Amersham)進(jìn)行，隨后在MegaBace測序器上進(jìn)行分析。
實(shí)施例10實(shí)體加載到標(biāo)簽上。
步驟將25μL在DMF中的150mM構(gòu)件溶液與25μL在DMF中的150mM EDC溶液混合?；旌衔镌?5攝氏度下放置30min。加入50μL 100mM HEPES緩沖劑pH 7.5中的氨基oligo(10nmol)并將反應(yīng)混合物在25攝氏度下放置20min。過量的構(gòu)件通過用EtOAc(500μL)提取而去除。過量EtOAC在減壓下在speedvac中被去除。構(gòu)件加載的氨基oligo使用NH40ac經(jīng)乙醇沉淀兩次并通過電噴霧質(zhì)譜(ES-MS)而分析。
實(shí)施例11以下實(shí)施例說明標(biāo)記(tagging)原理用于鑒別從實(shí)體庫中分離的具有期望的性能的實(shí)體的用途。該原理在圖1中示意給出。
用于鑒別與整合蛋白受體αV/β3結(jié)合的復(fù)合物的肽的DNA-標(biāo)記(tagging)。
材料·純化的人整合蛋白αV/β3(Chemicon Inc.)·鏈霉親合素Sepharose 6B(AmershamPharmacia)·Nunc Immuno moduleU8 Maxisorp(Biotecline cat#Nun-475078)·剪切的鯡魚DNA(Sigma)·Taq-聚合酶(Promega)和10X Taq-pol緩沖劑·結(jié)合緩沖劑[100mM NaCl，5mM MgCl2，50mM Tris-HCl，pH 7.5]·UV-透過式照明器(transilluminator)·SPDP[N-琥珀酰亞胺基3(2-吡啶基二硫代)丙酸酯](MolecularProbes，CatS-1531)·Micro Bio-Spin 6(Bio-Rad cat732-6221)·具有以下序列的6種標(biāo)記寡核苷酸TO#15’-XCTATGCGGACTGACTGGTAC-3’TO#25’-XCTATGATGCTTAGGCGGTAC-3’TO#35’-XCTATGTACCGTACGTGGTAC-3’TO#45’-XCTATGAATGCTAGCTGGTAC-3’TO#55’-XCTATGGATTGCGCGTGGTAC-3’TO#66’-XCTATGCCACTATTAGGGTAC-3’
其中X＝適用于連接功能實(shí)體如肽，小分子或聚合物的5’C6氨基修飾劑(Glen research cat#10-1916-90)。
·具有以下序列的互補(bǔ)性(模板)寡核苷酸CO#15’-BPTATAGGATCCGTACCAGTCAGTCCGCATAGGAATTCTAGT-3’CO#25’-BPTATAGGATCCGTACCGCCTAAGCATCATAGGAATTCTAGT-3’CO#35’-BPTATAGGATCCGTACCACGTACGGTACATAGGAATTCTAGT-3’CO#45’-BPTATAGGATCCGTACCAGCTAGCATTCATAGGAATTCTAGT-3’CO#55’-BPTATAGGATCCGTACCACGCGCAATCCATAGGAATTCTAGT-3’CO#65’-BPTATAGGATCCGTACCCTAATAGTGGCATAGGAATTCTAGT-3’其中，B＝5’-生物素(Glen research Cat#10-1953-95)和P＝光可斷裂的接頭(Glen research cat#10-4913-90)。
下劃線的10核苷酸序列對(duì)于每種標(biāo)記寡核苷酸都是獨(dú)特的且具有獨(dú)特的互補(bǔ)性寡核苷酸對(duì)應(yīng)物。
粗體加亮的序列適用于克隆目的。
·用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸AO#15’-BPTATAGGATCCGTACC-3’AO#25’-ACTAGAATTCCTATG-3’·具有以下組成的6種肽P#1GRGDSPCP#2GRADSPCP#3GRGESPCP#4GDGRSPCP#5CKKKP#6CFFKKKA＝丙氨酸，G＝甘氨酸，R＝精氨酸，D＝天門冬氨酸，P＝脯氨酸，F(xiàn)＝苯丙氨酸，K＝賴氨酸和E＝谷氨酸鹽。所有肽通過N-端羧基化和C-端酰胺化而封端。肽由Schafer-N A/S，DK-Denmark供給。
方案步驟1用特定寡核苷酸(TO#1-6)標(biāo)記肽#1-6。
每個(gè)TO寡核苷酸包含單個(gè)5’末端氨基親核試劑(X)，后者可在以下反應(yīng)中使用異雙官能交聯(lián)劑SPDP被共價(jià)鍵接至肽的半胱氨酸硫醇-基團(tuán)上。
方法將5nmol氨基-寡核苷酸干燥和重新懸浮在160μl 100mMHepes-OH，(pH 7.5)中。加入40μl 20mM SPDP(在DMSO中)和在30攝氏度下溫養(yǎng)2h。樣品用3×500μl乙酸乙酯提取和在speedvac中干燥10min。樣品使用以100mM Hepes-OH平衡的Micro bio-spin 6柱純化。添加10μl 0.1M肽和在25攝氏度下溫育2h。用2M NH4OAC/乙醇沉淀兩次。重新溶解在50μl H2O中和通過電噴霧-MS分析(BrukerInc.)而確認(rèn)標(biāo)記。
步驟2將互補(bǔ)性寡核苷酸(CO#1-6)退火至來自步驟1的TO-肽復(fù)合物上。
方法將10pmol加載了相應(yīng)的肽的TO#1-6加入在結(jié)合緩沖劑[100mMNaCl，5mM MgCl2，50mM Hepes-OH，pH 7.5]中包含CO#1-6各20pmol和總體積100μl的混合物。樣品在80攝氏度下加熱2分鐘并經(jīng)30分鐘慢慢冷卻至室溫。
步驟3純化雙鏈DNA-肽復(fù)合物(可有可無的！)。
在退火之后，僅已被退火至其互補(bǔ)性寡核苷酸序列上的標(biāo)記分子包含功能實(shí)體和生物素把手(參見圖1)。因此，為了減少選擇步驟中的“噪音”，單鏈標(biāo)記分子可在預(yù)選步驟中使用生物素把手從庫中被去除。
方法將50μl鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖6B漿在3×1ml結(jié)合緩沖劑中洗滌，然后將珠粒重新懸浮在100μl結(jié)合緩沖劑中。將CO/TO-肽退火混合物加入鏈霉抗生物素蛋白珠粒中和在25攝氏度下在攪拌下溫育30min。隨后，沉淀鏈霉抗生物素蛋白珠粒，丟棄上層清液并將珠粒用1ml結(jié)合緩沖劑洗滌三次。將珠粒重新懸浮在100μl結(jié)合緩沖劑中并最后使用光斷裂方法釋放CO/TO-肽復(fù)合物。光斷裂反應(yīng)通過將樣品在Vilber-Lourmat UV-透過照明器TFX-20M上以70％效能溫養(yǎng)30秒而進(jìn)行。將洗脫的CO/TO-肽復(fù)合物移出至新管。
步驟4針對(duì)與整合蛋白αV/β3受體結(jié)合的配體富集文庫。
測試分子庫與固定在塑料表面上的整合蛋白αV/β3受體的結(jié)合。
方法將Nunc 8板的單個(gè)孔在標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽-緩沖鹽水(PBS)中與100μl的1μg/ml整合蛋白受體溫育過夜。將該孔用100μl PBS洗滌五次，隨后使用100μl在PBS-緩沖劑中的0.5mg/ml剪切的鯡魚DNA在室溫下封閉2h。
最后將該孔使用100μl整聯(lián)蛋白結(jié)合連接緩沖劑[Tris-HCl(pH7.5)，137mM NaCl，1mM KCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2和1mM MnCl2]洗滌五次。
將CO/TO-肽復(fù)合物加入固定的整合蛋白中和在37攝氏度下溫育30min。上層清液被去除并將固定的整合蛋白使用100μl整合蛋白結(jié)合緩沖劑洗滌5次。洗脫CO/TO-配體復(fù)合物，其中將樣品在80攝氏度下加熱5min。樣品被冷卻至室溫。1μl樣品用于PCR擴(kuò)增，中在包含10mM Tris-HCl pH 9.0，50mM KCl，1mM MgCl2，0.1％TritonX-100，dATP，dCTP，dGTP和dTTP各250mM的反應(yīng)體系中使用AO#1和2各10pmol作為外部引物。樣品起始在94攝氏度下變性2min接著進(jìn)行30個(gè)周期在94攝氏度下變性30秒，在44攝氏度下退火30秒和在72攝氏度上延伸15秒。最后，樣品被沉淀。
步驟5分離單鏈模板。
為了隨后的選擇和擴(kuò)增輪，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的非模板鏈應(yīng)該被去除。該步驟通過生物素化的模板oligo的特定純化而進(jìn)行。
方法將50μl鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖6B用1ml結(jié)合緩沖劑洗滌三次。將洗滌的珠粒與25μl(＜10pmol)來自步驟4的PCR產(chǎn)物在100μl結(jié)合緩沖劑中在25攝氏度下溫育30min。短暫地離心樣品以收集珠粒。去除上層清液并使用800μl H2O洗滌五次。珠粒在室溫下被重新懸浮在500μl 10mM NaOH中2min。將上層清液去除并將珠粒重新懸浮在100mM生物素(在100μl H2O中)中。為了洗脫，將樣品在95攝氏度下在攪拌下溫育10min。隨后，過量的生物素通過Micro-spin凝膠-過濾而去除。
步驟6將模板oligo的新群體與來自步驟1的標(biāo)記肽庫退火。
單鏈模板寡核苷酸的新群體如步驟2所述與來自步驟1的標(biāo)記肽庫退火并進(jìn)行另一輪選擇和擴(kuò)增，其中所述寡核苷酸新群體中富集了代表整合蛋白αV/β3受體的配體的序列。
選擇和擴(kuò)增步驟(步驟2-6)重復(fù)5輪。
步驟7配體的鑒別。
對(duì)一個(gè)或多個(gè)配體實(shí)體特異的、富集的雙鏈DNA片鏈的身份通過在M13mp18質(zhì)粒載體中進(jìn)行DNA克隆和序列分析檢查各個(gè)克隆而確立。為了統(tǒng)計(jì)目的，將30個(gè)以上的克隆測序以在克隆的序列標(biāo)簽集合內(nèi)鑒別占優(yōu)勢的序列。因?yàn)榭寺〉膬?yōu)勢DNA序列對(duì)應(yīng)于配體，該序列偏離直接鑒別適用于進(jìn)一步檢查的配體候選物。
實(shí)施例12以下實(shí)施例說明如何應(yīng)用標(biāo)記原理鑒別代表從序列庫中分離的小分子的DNA序列。該原理在圖中示意給出。
用于鑒別與鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的復(fù)合物的生物素和谷胱甘肽的DNA-標(biāo)記。
材料·鏈霉抗生物素蛋白Sepharose 6B(AmershamPharmacia)·Taq-聚合酶(Promega)和10X Taq-pol緩沖劑·結(jié)合緩沖劑[100mM NaCl，5mM MgCl2，50mM Tris-HCl，pH 7.5]·SPDP[N-琥珀酰亞胺基3(2-吡啶基二硫代)丙酸酯](MolecularProbes，CatS-1531)·N-羥基琥珀酰亞胺基酯-生物素(Fluka#14405)·谷胱甘肽(Sigma)·Micro Bio-Spin 6(Bio-Rad cat732-6221)·T7外切核酸酶(基因6)和5x緩沖劑·具有以下序列的標(biāo)記寡核苷酸TO#15’-XCTATGCGGACTGACTGGTAC-3’TO#25’-XCTATGANNNNNNNNCGGTAC-3’，(65.536種序列的組合)其中X＝適用于連接功能實(shí)體如肽，小分子或聚合物的5’C6氨基修飾劑(Glen research cat#10-1039-90)。N是G，A，T或C·具有以下序列的互補(bǔ)性(模板)寡核苷酸CO#15’-TsAsTsGGATCCGTACCAGTCAGTCCGCATAGGAATTCTAGT-3’CO#25’-TsAsTsAGGATCCGTACCGNNNNNNNNTCATAGGAATTCTAGT-3’其中，S表示硫代磷酸酯在DNA主鏈中的位置。
下劃線的10核苷酸序列對(duì)于每種標(biāo)記寡核苷酸或標(biāo)記寡核苷酸集合是獨(dú)特的且具有獨(dú)特的互補(bǔ)性寡核苷酸對(duì)應(yīng)物。粗體加亮的序列適用于克隆目的。
·用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸AO#15’-TsAsTsAGGATCCGTACC-3′AO#25’-ACTAGAATTCCTATG-3′
其中，S表示硫代磷酸酯在DNA主鏈中的位置。
方案步驟1用TO#1標(biāo)記生物素和用TO#2標(biāo)記谷胱甘肽。
所有的TO寡核苷酸包含可以用于共價(jià)連接小分子的單個(gè)5’末端氨基親核試劑(X)。生物素使用NHS-生物素(Merck)在以下反應(yīng)中鍵接至TO#1氨基-基團(tuán)上。
谷胱甘肽使用雜雙功能交聯(lián)劑SPDP在以下反應(yīng)中鍵接至寡核苷酸集合上。
方法用TO#1標(biāo)記生物素將5nmol TO#1寡核苷酸干燥并重新懸浮在80μl 100mM Hepes-OH緩沖劑(pH 7.5)中。將20μl 50mM NHS-生物素(在DMSO中)加入寡核苷酸中并將樣品在30攝氏度下溫育2小時(shí)。樣品使用200μl乙酸乙酯提取兩次，然后在Micro-spin 6柱上純化。生物素的標(biāo)記使用電噴霧-MS(Bruker Inc.)確認(rèn)。
用TO#2標(biāo)記谷胱甘肽(GSH)將5nmol TO#2干燥和重新懸浮在160μl 100mM Hepes-OH，(pH 7.5)中。加入40μl 20mM SPDP(在DMSO中)并將樣品在30攝氏度下溫育2h。樣品用3×500μl乙酸乙酯提取和在speedvac中干燥10min。樣品使用以100mM Hepes-OH平衡的Micro bio-spin 6柱純化。加入10μl 0.1M GSH并將樣品在25攝氏度下溫育2h。用2M NH4OAc/乙醇沉淀兩次。重新溶解在50μl H2O中和通過電噴霧-MS分析(BrukerInc.)而確認(rèn)標(biāo)記。
單個(gè)生物素序列標(biāo)簽和65.536種不同的谷胱甘肽序列標(biāo)簽構(gòu)成總共65.537種不同的序列標(biāo)簽。將庫混合成包含等-摩爾量的每種序列標(biāo)簽。因此，該庫由相對(duì)于標(biāo)記生物素而言65.536-倍過量的標(biāo)記谷胱甘肽組成。
步驟2將互補(bǔ)性寡核苷酸(CO#1&2)退火至來自步驟1的TO復(fù)合物上。
方法將總共10pmol標(biāo)記庫分子加入在結(jié)合緩沖劑[100mM NaCl，5mMMgCl2，50mM Hepes-OH，pH 7.5]中包含20pmol模板分子(CO#1&2)(相對(duì)于CO#1包含65.536倍過量的CO#2)且總體積100μl的混合物中。樣品在80攝氏度下加熱2分鐘并經(jīng)30分鐘慢慢冷卻至室溫。
步驟3純化雙鏈DNA復(fù)合物(可有可無的！)。
在退火之后，僅已被退火至其互補(bǔ)性寡核苷酸序列上的標(biāo)記分子包含功能實(shí)體和硫代磷酸酯主鏈把手(參見圖1)。因此，為了減少選擇步驟中的“噪音”，單鏈標(biāo)記-分子可在預(yù)選擇步驟中使用硫代磷酸酯把手從庫中去除。
方法將50μl活化的硫代丙基-瓊脂糖漿在3×1ml結(jié)合緩沖劑中洗滌，然后將珠粒重新懸浮在100μl結(jié)合緩沖劑中。將CO/TO-退火混合物加入硫代丙基-瓊脂糖珠粒中和在30攝氏度下在攪拌下溫育30min。隨后，沉淀珠粒，丟棄上層清液并將珠粒用1ml結(jié)合緩沖劑洗滌三次。將珠粒重新懸浮在100μl結(jié)合緩沖劑中和最后將CO/TO復(fù)合物通過與100μl 50mM DTT在結(jié)合緩沖劑中溫育而釋放。洗脫的CO/TO復(fù)合物被移出至新管。
步驟4針對(duì)與鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的配體富集文庫。
測試分子庫與鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖6B的結(jié)合。
方法將50μl鏈霉抗生物素蛋白-瓊脂糖6B漿用1ml結(jié)合緩沖劑洗滌三次。將10μl在步驟3中洗脫的庫分子與鏈霉抗生物素蛋白在100μl結(jié)合緩沖劑中在25攝氏度下在攪拌下溫育10分鐘。隨后，樣品使用1ml結(jié)合緩沖劑洗滌五次。配體DNA通過將樣品在100μl H2O中在95攝氏度下溫育5分鐘而洗脫。樣品被冷卻至室溫。1μl樣品用于PCR擴(kuò)增，其中在包含10mM Tris-HCl pH 9.0，50mM KCl，1mM MgCl2，0.1％Triton X-100，dATP，dCTP，dGTP和dTTP各250mM的反應(yīng)體系中使用AO#1和2各10pmol作為外部引物。樣品起始在94攝氏度下變性2min之后進(jìn)行30個(gè)周期在94攝氏度下變性30秒，在44攝氏度下退火30秒和在72攝氏度延伸15秒。最后，樣品被沉淀步驟5分離單鏈模板。
對(duì)于隨后選擇和擴(kuò)增輪，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的非模板鏈應(yīng)該被去除。該步驟使用包含硫代磷酸酯主鏈的模板oligo鏈的特殊純化而進(jìn)行。
方法雙鏈PCR產(chǎn)物使用噬菌體T7(基因6)外切核酸酶進(jìn)行外切核酸酶消化。該酶是一種雙鏈特異性5’外切核酸酶，受到存在于DNA主鏈中的硫代磷酸酯的抑制。將20μl來自步驟4的雙鏈PCR產(chǎn)物在外切核酸酶T7緩沖劑中溫育，然后加入50單位的T7外切核酸酶。樣品在30攝氏度下溫育10分鐘。樣品用100μl苯酚提取一次，然后使用NH4-乙酸鹽/乙醇沉淀。將樣品再懸浮在H2O中。
步驟6將模板oligo的新群體與來自步驟1的標(biāo)記分子的文庫退火。
將針對(duì)代表鏈霉抗生物素蛋白的配體的序列而富集的單鏈模板寡核苷酸的新群體如步驟2所述與來自步驟1的標(biāo)記分子庫退火并進(jìn)行另一輪的選擇和擴(kuò)增。
選擇和擴(kuò)增步驟(步驟2-6)重復(fù)5輪。
步驟7配體的鑒定。
對(duì)一種或多種配體實(shí)體特異的富集的雙鏈DNA片段的身份通過在M13mp18質(zhì)粒載體中進(jìn)行DNA克隆和序列分析檢查各個(gè)克隆而確立。
為了統(tǒng)計(jì)目的，對(duì)30個(gè)以上的克隆測序以在克隆的序列標(biāo)簽集合內(nèi)鑒定出優(yōu)勢序列。因?yàn)榭寺〉膬?yōu)勢DNA序列對(duì)應(yīng)于配體，該序列偏離直接鑒別適用于進(jìn)一步檢查的配體候選物。
實(shí)施例13使用分開的隔室編碼法(模式2)在得自集合編碼(pool-encoding)法(模式1)的標(biāo)識(shí)符上編碼。
該實(shí)施例描述用于在包含已使用模式1編碼而得到的密碼子的標(biāo)識(shí)符上進(jìn)行反應(yīng)物的模式2編碼的試驗(yàn)條件。模式1編碼如以前實(shí)施例，尤其是實(shí)施例7所述而進(jìn)行。本實(shí)施例說明組合編碼模式1和2的一般原理。
編碼的標(biāo)識(shí)符的延伸和反應(yīng)物的轉(zhuǎn)移在分開的孔中進(jìn)行，其中將一種特定拉鏈構(gòu)件和一種特定反密碼子寡核苷酸混合，后者編碼被加載到拉鏈構(gòu)件上的功能實(shí)體。該方案也可用于游離反應(yīng)物。
使用編碼模式2的延伸。
在該實(shí)施例中，如下所示，放射性活性標(biāo)記的標(biāo)識(shí)符寡核苷酸(E57)與特定拉鏈構(gòu)件(E32)和具有反密碼子序列(反密碼子1)的反密碼子寡核苷酸(CD-M-8-0172-0001)混合。在另一實(shí)驗(yàn)中，具有不同的反密碼子序列(反密碼子X)的不同的反密碼子寡核苷酸(E60)用作參考樣品。
寡核苷酸組合(如下所示)在分開的隔室中混合在一起以允許成對(duì)的拉鏈構(gòu)件和反密碼子寡核苷酸的特異退火。延伸在延伸緩沖劑(20mM Hepes，8mM MgCl，150mM NaCl)中使用1pmol標(biāo)識(shí)符寡核苷酸，2pmol拉鏈構(gòu)件，2pmol反密碼子在10μl的最終體積中進(jìn)行。在PCR-機(jī)器中寡核苷酸被加熱并隨后慢慢地從80攝氏度再退火至20攝氏度。在退火之后，加入0.5mM dNTP和13U測序酶的混合樣品(～20μl)并在30攝氏度下延伸1h。樣品隨后通過10％尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳而分析，如圖31A所示。
凝膠分析顯示，標(biāo)識(shí)符用長反密碼子1(道2)和較短的反密碼子X(道3)完全延伸。結(jié)果還表明，在反密碼子寡核苷酸之間沒有出現(xiàn)雜亂，如果它們首先被允許退火至標(biāo)識(shí)符寡核苷酸上，然后再被混合和延伸的話(道4)。
交聯(lián)。
試劑在模式1編碼的分子上的模式2編碼使用具有三種密碼子和展示分子的標(biāo)識(shí)符而測試。反應(yīng)物的轉(zhuǎn)移在本實(shí)施例中通過拉鏈構(gòu)件上的反應(yīng)物交聯(lián)至標(biāo)識(shí)符寡核苷酸中的展示分子上而說明。轉(zhuǎn)移通過交聯(lián)而測試以在凝膠上簡化該分析，但并不限于這類反應(yīng)。
如下所示的功能實(shí)體(化學(xué)結(jié)構(gòu))被鍵接至oligo上以形成可以通過互補(bǔ)性區(qū)域退火至標(biāo)識(shí)符寡核苷酸上的拉鏈構(gòu)件(CX-1)。該拉鏈構(gòu)件與具有如下所示的反密碼子序列(反密碼子1)的反密碼子寡核苷酸(CD-M-8-0172-0001)一起使用。在另一(對(duì)照)實(shí)驗(yàn)中，不同的拉鏈構(gòu)件(E32)與具有不同的反密碼子序列(反密碼子X)的不同的反密碼子寡核苷酸(E60)一起使用。
寡核苷酸組合在分開的隔室中混合在一起以允許成對(duì)的拉鏈構(gòu)件和反密碼子寡核苷酸的特異退火。退火在延伸緩沖劑(20mM Hepes，8mM MgCl，150mM NaCl)中使用1pmol標(biāo)識(shí)符寡核苷酸，2pmol拉鏈構(gòu)件，2pmol反密碼子在10μl的最終體積中進(jìn)行。寡核苷酸在PCR-機(jī)器中被加熱并隨后慢慢地從80攝氏度再退火至20攝氏度。交聯(lián)通過加入5mM DMT-MM試劑和37攝氏度下溫育2h而進(jìn)行。樣品隨后通過10％尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳而分析，如圖31B所示。
凝膠分析顯示，拉鏈構(gòu)件(CX-1)上的功能實(shí)體交聯(lián)至包含該密碼子的標(biāo)識(shí)符寡核苷酸上(道2)，而缺少該試劑的拉鏈構(gòu)件(E32)不能與標(biāo)識(shí)符寡核苷酸反應(yīng)。結(jié)果還表明，在拉鏈構(gòu)件寡核苷酸之間不會(huì)出現(xiàn)雜亂，如果它們首先被允許退火至標(biāo)識(shí)符寡核苷酸上，然后再被混合和交聯(lián)的話(道4)。
盡管本發(fā)明已根據(jù)特定方法和實(shí)施方案進(jìn)行描述，但可以理解，可進(jìn)行各種改變和變化而不背離本發(fā)明。
實(shí)施例14來自展示整合蛋白受體avβ3配體的雙官能復(fù)合物的編碼部分的富集。
實(shí)施例14.1 L1-RGD和L1-cRGD的形成寡核苷酸L1-NH2用于分別標(biāo)記cRGD肽和RGD肽，其中將4nmolL1-NH2混入80μl 500mM Hepes KOH，pH 7.5和20μL在DMSO中的25mM BMPS的混合物中并隨后在30攝氏度下溫育2小時(shí)。將BMPS活化的L1-NH2寡核苷酸用EtOAc洗滌三次，以去除未鍵接BMPS，并將過量的EtOAc通過真空蒸餾而蒸發(fā)掉。加入10μL 100mM cRGD或RGD肽并將反應(yīng)體系在室溫下溫育過夜。在溫育之后，通過凝膠過濾去除cRGD或RGD標(biāo)記的寡核苷酸中的過量未鍵接肽。肽的標(biāo)記通過質(zhì)譜分析而證實(shí)并將標(biāo)記產(chǎn)物分別稱作L1-cRGD和L1-RGD。
材料L1-NH2(6-8-CAGCTTGGACACCACGTCATAC，6＝LH193，8＝PCspacer)得自DNA-Technology，Aarhus，DENMARK，PCspacer是一種光可斷裂的間隔基(Glen research產(chǎn)品cat#10-4913)，BMPS(N-[β-馬來酰亞氨基丙基氧基]琥珀酰亞胺酯)得自Pierce(cat#22298)。LH193(二異丙基-氨基磷酸2-氰基-乙基酯2-[2-(2-{2-[2-(2-{[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲基]氨基)-乙氧基)-乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙基酯)根據(jù)以下方法合成 市售六甘醇使用TBDMS-C1，咪唑和DMAP選擇性地單TBDMS保護(hù)，57％產(chǎn)率。將游離醇官能團(tuán)通過標(biāo)準(zhǔn)三步驟程序而轉(zhuǎn)化成胺官能團(tuán)用甲苯磺酰氯在吡啶中活化，隨后用疊氮化鈉在DMF中親核置換和隨后使用Pd/C和H2還原，總體產(chǎn)率95％(對(duì)于三個(gè)步驟)。胺官能隨后用4-單甲氧基三苯甲基(MMT)保護(hù)，99％產(chǎn)率，并將TBDMS基團(tuán)使用TBAF去除。游離羥基官能最后與氰基乙基-N，N，N’，N’-四異丙基磷酰二胺在四唑催化下反應(yīng)并得到所需化合物，82％產(chǎn)率。31Pnmr(CDCl3)＝148.5ppm。
14.2 L1-F5的形成將5nmol L1-NH2，50mM DMTMM和10mM F5在100mM Na-BoratpH 8.0中的50μL混合物在30攝氏度下溫育過夜并通過凝膠過濾去除寡核苷酸標(biāo)記的F5中過量的未鍵接F5.隨后將加載的oligo通過速度真空蒸餾(speed vacucom distillation)而干燥并重新懸浮在50μL 100mM NaOH中，然后在50攝氏度下放置過夜以對(duì)F5分子進(jìn)行去保護(hù)(酯斷裂和N-乙酰胺斷裂)。在去保護(hù)之后，將懸浮液用HCl中和并通過質(zhì)譜分析而確認(rèn)F5的加載。F5的標(biāo)記通過質(zhì)譜分析而確認(rèn)。標(biāo)記產(chǎn)物被稱作L1-F5。
材料DMTMM(4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯化物)由市售N-甲基嗎啉和2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪根據(jù)Kaminski等(JOC(1998)，63，4248-55)而制成。
F5(酯和N-乙?；苌?根據(jù)以下方法合成
標(biāo)記產(chǎn)物L(fēng)1-F5攜帶游離羧酸(高甘氨酸部分)和游離氨基基團(tuán)(環(huán)氨基吡啶)。
使用4-硝基苯甲酰氯，市售四甘醇被4-硝基苯甲酸單保護(hù)，67％產(chǎn)率。使用TEMPO，亞氯酸鹽和次氯酸鹽的混合物隨后將剩余的伯醇氧化成相應(yīng)的羧酸，81％產(chǎn)率。將化合物連接到2-氯三苯甲基氯樹脂上和隨后與KCN在MeOH-DMF(1∶5)中反應(yīng)以去保護(hù)4-硝基苯甲酰基酯。N-(2-硝基苯基磺酰基)活化的β-丙氨酸甲基酯使用Mitsunobu方案連接。4-硝基苯基磺?；鶊F(tuán)通過用過量巰基乙醇/DBU處理而去除并使用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc-化學(xué)將所形成的胺用兩個(gè)隨后構(gòu)件酰化。最終分子通過用在醚-DCM(1∶4)中的0.4M HCl處理而從樹脂上切下。[M+H]+(計(jì)算值)＝595.30.[M+H]+(實(shí)測值)＝595.28。
14.3庫組分1的形成。
雙鏈標(biāo)記L1-cRGD(稱作L1-cRGD-T1)的形成將200pmol DNA模板，T1(GCTAGAGACGTGGTGGAGGAAGTCTTCCTAGAAGCTGGATATCACCACATCTCTAGCAGCTAGTATGACGTGGTGTCCAAGCTG)退火至50pmol L1-cRGD上。隨后L1-cRGDoligo通過DNA聚合酶(測序酶)進(jìn)行延伸。
測序酶得自Upstate Biotechnology(Cat#70775Y)。
14.4庫組分2的形成。
雙鏈標(biāo)記L1-RGD。稱作L1-RGD-T2將200pmol T2(GCTAGAGACGTGGTGGAGGAAGTCTTCCTAGAAGCTGGATATCAGGTCTTCTGTCTTCTTCCGTATGACGTGGTGTCCAAGCTG)退火至50pmol L1-RGD上。隨后L1-RGDoligo通過DNA聚合酶如上所述而延伸。
14.5庫組分3的形成。
雙鏈L1-F5。稱作L1-F5-T3將200pmol T3(GCTAGAGACGTGGTGGAGGAAGTCTTCCTAGAAGCTGGATATCTTCAGTTCTCGACTCCTGAGTATGACGTGGTGTCCAAGCTG)退火至50pmol L1-F5上。隨后L1-F5oligo通過DNA聚合酶如上所述而延伸。
14.6庫組分4的形成。
雙鏈L1-NH2。稱作L1-NH2-T4將50pmol T4(GCTAGAGACGTGGTGGAGGAAGTCTTCCTAGAAGCTGGATATCTGACGTGTTGACGTACACAGTATGACGTGGTGTCCAAGGTG)退火至200pmol L1-NH2上。隨后L1-NH2oligo通過DNA聚合酶如上所述而延伸。
總共生產(chǎn)出每種庫組分L1-cRGD-T1，L1-RGD-T2，L1-F5-T3和L1-NH2-T4各50pmol。
14.7富集整合蛋白結(jié)合復(fù)合物的富集通過在Nunc Immunomodule U8Maxisorp孔(Biotecline cat#nun-47507)中涂覆0.04mg/孔整合蛋白受體avβ3而進(jìn)行。
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)(圖32)中，L1-cRGD-T1，L1-RGD-T2，L1-F5-T3和L1-NH2-T4按照1pmol L1-NH2-T4復(fù)合物，1/1000000pmolL1-cRGD-T1復(fù)合物，1/100000pmol L1-RGD-T2復(fù)合物和1/10000pmolL1-F5-T3復(fù)合物的比率在100μl緩沖劑A(Tris緩沖鹽水，0.05％Tween 20，1％牛血清白蛋白，0.1mg/mL鯡魚精子DNA)中混合。在整合蛋白包被的孔中在25攝氏度下進(jìn)行90min溫育。在配體結(jié)合之后，所有的孔用250μL緩沖劑A在1小時(shí)洗滌20次。然后將100μL緩沖劑A應(yīng)用于每個(gè)孔并將孔暴露于350納米UV光30秒以斷裂PCspacer，這樣從配體分子上釋放DNA模板。在暴露于UV光之后，立即取出洗脫物質(zhì)并通過定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)而分析DNA鏈T1，T2，T3和T4的存在。
在類似實(shí)驗(yàn)(圖33)中，L1-cRGD-T1，L1-RGD-T2，L1-F5-T3和L1-NH2-T4按照1pmol L1-NH2-T4復(fù)合物，1/10000pmol L1-cRGD-T1復(fù)合物，1/10000pmol L1-RGD-T2復(fù)合物和1/10000pmol L1-F5-T3復(fù)合物的比率在100μL緩沖劑A中混合。其它分析條件如上所述。
對(duì)于5mL預(yù)混物(用于一種96孔板)，將2.5mL TaqmanUniversal PCR Master Mix(Applied Biosystems)與450μLRPv2(GTCAGAGACGTGGTGGAGGAA)(10pmol/μl)，25μL Taqman探針(6-FAM-TCCAGCTTCTAGGAAGAC-MGBNFQ；50μM)和1075μL H2O混合。
將40.5μL預(yù)混物等分到每個(gè)孔中并加入4.5μL相關(guān)上游PCR引物(FPv2(CAGCTTGGACACCACGTCATAC)(用于標(biāo)準(zhǔn)曲線)或模板特異引物P1(GTCATACTAGCTGCTAGAGATGTGGTGATA)(對(duì)T1特異)，P-2(CATACGGAAGAAGACAGAAGACCTGATA)(對(duì)T2特異)，P-3(TCATACTCAGGAGTCGAGAACTGAAGATA)(對(duì)T3特異)或P-4(CATACTGTGTACGTCAACACGTCAGATA)(對(duì)T4特異)之一；10pmol/μL)和5μL樣品(對(duì)于陰性對(duì)照，在孔中為H20)。
用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品通過稀釋T4至108拷貝/5μL和隨后對(duì)該樣品進(jìn)行10-倍系列稀釋而制成。5μL用于每個(gè)Q-PCR反應(yīng)。
熱循環(huán)/熒光的測量在Applied Biosystems ABI Prism 7900HT實(shí)時(shí)儀器上進(jìn)行，其中采用循環(huán)參數(shù)95攝氏度10min，40周期95攝氏度15sec及64攝氏度1min。
從圖32可以看出，如果與富集輸出比率比較來考慮輸入比率，雙鏈DNA復(fù)合物L(fēng)i-cRGD-T1，L1-RGD-T2，L1-F5-T3相對(duì)L1-NH2-T4復(fù)合物分別被富集約1百萬倍，100000倍和30000倍。L1-cRGD-T1，L1-RGD-T2和L1-F5-T3在沒有整合蛋白受體的孔中孵育之后不能被檢出。
圖33分別顯示L1-cRGD-T1，L1-RGD-T2和L1-F5-T3的富集。配體DNA復(fù)合物被各異地富集。這最可能是由于三種分子具有不同的解離常數(shù)。L1-cRGD-T1，L1-RGD-T2和L1-F5-T3在沒有整合蛋白受體的孔中孵育之后不能被檢出。
權(quán)利要求
1.一種用于得到包含展示分子部分和編碼部分的雙功能復(fù)合物的方法，其中包含化學(xué)反應(yīng)部位和用于酶加入標(biāo)簽的引發(fā)部位的新生雙功能復(fù)合物在化學(xué)反應(yīng)部位上與一種或多種反應(yīng)物反應(yīng)，并使用一種或多種酶向此新生雙功能復(fù)合物在引發(fā)部位上提供標(biāo)識(shí)反應(yīng)物的各自的標(biāo)簽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將在權(quán)利要求1中得到的雙功能復(fù)合物進(jìn)一步與反應(yīng)物反應(yīng)一次或多次并提供各自的標(biāo)識(shí)標(biāo)簽，以得到作為雙功能復(fù)合物一部分的反應(yīng)產(chǎn)物和包含標(biāo)簽的編碼部分，所述標(biāo)簽編碼已參與形成該反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)物的身份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，2或3的方法，其中標(biāo)簽是核酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽采用酶延伸反應(yīng)被提供在新生雙功能復(fù)合物的引發(fā)部位。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的方法，其中用連接部分連接化學(xué)反應(yīng)部位和引發(fā)部位。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中連接部分是其長度適于與互補(bǔ)性寡核苷酸雜交的核酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中連接部分通過包含可選擇性地?cái)嗔训慕宇^的間隔基被連接到化學(xué)反應(yīng)部位上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中化學(xué)反應(yīng)部位是包含具有一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)或這些反應(yīng)基團(tuán)的前體的化學(xué)結(jié)構(gòu)的化學(xué)支架。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的方法，其中兩種或多種反應(yīng)物參與和化學(xué)反應(yīng)部位的反應(yīng)，并在該反應(yīng)之前或之后向引發(fā)部位提供標(biāo)識(shí)反應(yīng)物的各自的標(biāo)簽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)的方法，其中引發(fā)部位包含核苷酸的3’-OH或5’-磷酸基團(tuán)，或其功能衍生物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的方法，其中標(biāo)簽的加入通過選自聚合酶，連接酶，激酶，重組酶，或其組合的酶而進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中標(biāo)簽的加入在反應(yīng)物與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)之前進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)的方法，其中雙功能復(fù)合物的核酸部分在反應(yīng)物與化學(xué)反應(yīng)部位反應(yīng)時(shí)是雙鏈。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中反應(yīng)物是游離反應(yīng)物。
15.權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)的方法，其中反應(yīng)物包含核酸序列和能夠在化學(xué)反應(yīng)部位上反應(yīng)的功能實(shí)體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中反應(yīng)物是包含與連接部分足夠互補(bǔ)以允許雜交的寡核苷酸，可轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體，和標(biāo)識(shí)功能實(shí)體的反密碼子的構(gòu)件。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16任一項(xiàng)的方法，其中標(biāo)簽包含用于標(biāo)識(shí)反應(yīng)物的密碼子而且反標(biāo)簽包含與該密碼子互補(bǔ)的核酸序列(反密碼子)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中標(biāo)簽進(jìn)一步包含提供相關(guān)反應(yīng)物已反應(yīng)的合成歷史的時(shí)間點(diǎn)信息的構(gòu)架序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中標(biāo)簽包含3、5、8、11、15、20、30或更多個(gè)核苷酸的寡核苷酸。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中雙功能復(fù)合物包含不同長度的密碼子。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20任一項(xiàng)的方法，其中包含與標(biāo)簽寡核苷酸互補(bǔ)的序列的寡核苷酸被固定。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，替代采用標(biāo)簽的酶促加入，應(yīng)用與標(biāo)簽的末端和包含引發(fā)部位的雙功能復(fù)合物一部分互補(bǔ)的引導(dǎo)寡核苷酸使得末端相互鄰近，將標(biāo)簽化學(xué)連接至引發(fā)部位上。
23.一種用于得到包含展示分子部分和編碼部分的雙功能復(fù)合物的方法，包括步驟a)提供包含反應(yīng)基團(tuán)和寡核苷酸標(biāo)識(shí)符區(qū)域的新生雙功能復(fù)合物，b)提供構(gòu)件，該構(gòu)件包含與標(biāo)識(shí)符區(qū)域足夠互補(bǔ)以允許雜交的寡核苷酸，可轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體，和標(biāo)識(shí)功能實(shí)體的反密碼子，c)將新生雙功能復(fù)合物和構(gòu)件在雜交條件下混合以形成雜交產(chǎn)物，d)通過涉及新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)基團(tuán)的反應(yīng)將構(gòu)件的功能實(shí)體轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上，和e)酶促延伸寡核苷酸標(biāo)識(shí)符區(qū)域以得到連接到已接受功能實(shí)體的雙功能復(fù)合物上的密碼子。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，進(jìn)一步包括步驟f)分離雜交產(chǎn)物的組成成分和回收該復(fù)合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求23和24的方法，所述展示分子部分包含功能實(shí)體和起始復(fù)合物的反應(yīng)基團(tuán)的反應(yīng)產(chǎn)物，其中步驟c)至f)根據(jù)需要重復(fù)。
26.根據(jù)任何權(quán)利要求23至25的方法，其中新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)基團(tuán)是化學(xué)支架的一部分。
27.根據(jù)任何權(quán)利要求23至26的方法，其中用于生產(chǎn)密碼子的酶是聚合酶。
28.根據(jù)任何權(quán)利要求23至27的方法，其中反密碼子是獨(dú)特的。
29.方法和權(quán)利要求23至28的方法，其中反密碼子的核苷酸的類似組合不出現(xiàn)在攜帶另一功能實(shí)體的另一構(gòu)件上。
30.一種用于產(chǎn)生雙功能復(fù)合物庫的方法，包括步驟a)提供一種或多種不同的包含反應(yīng)基團(tuán)和寡核苷酸標(biāo)識(shí)符區(qū)域的新生雙功能復(fù)合物，b)提供多個(gè)不同的構(gòu)件，每個(gè)構(gòu)件包含與標(biāo)識(shí)符區(qū)域足夠互補(bǔ)從而允許雜交的寡核苷酸，可轉(zhuǎn)移的功能實(shí)體，和用于標(biāo)識(shí)功能實(shí)體的反密碼子，c)將新生雙功能復(fù)合物和多個(gè)構(gòu)件在雜交條件下混合以形成雜交產(chǎn)物，d)通過涉及新生雙功能復(fù)合物的反應(yīng)基團(tuán)的反應(yīng)將構(gòu)件的功能實(shí)體轉(zhuǎn)移至新生雙功能復(fù)合物上，e)酶促延伸該寡核苷酸標(biāo)識(shí)符區(qū)域，以得到連接到已接受化學(xué)實(shí)體的雙功能復(fù)合物上的密碼子，f)分離雜交產(chǎn)物的組成成分和回收復(fù)合物，g)根據(jù)需要重復(fù)步驟c)至f)一次或多次。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中反密碼子是獨(dú)特的。
32.權(quán)利要求30和31的方法，其中反密碼子的核苷酸的類似組合不出現(xiàn)在攜帶另一功能實(shí)體的另一構(gòu)件上。
33.一種用于產(chǎn)生包含展示分子部分和編碼部分的雙功能復(fù)合物的庫的方法，所述方法包括步驟在分開的隔室中提供新生雙功能復(fù)合物，每個(gè)復(fù)合物包含化學(xué)反應(yīng)部位和用于酶加入標(biāo)簽的引發(fā)部位，并按照任何順序在每個(gè)隔室中在化學(xué)反應(yīng)部位和一種或多種反應(yīng)物之間進(jìn)行反應(yīng)，和使用一種或多種酶在引發(fā)部位上加入一種或多種標(biāo)識(shí)所述一種或多種反應(yīng)物的各自的標(biāo)簽。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中兩個(gè)或多個(gè)隔室的內(nèi)容物被匯集在一起。
35.權(quán)利要求33或34的方法，其中將雙功能復(fù)合物使用雙功能復(fù)合物作為新生雙功能復(fù)合物進(jìn)行另外一個(gè)或多個(gè)周期的根據(jù)權(quán)利要求33或34的方法，以得到雙功能復(fù)合物的庫，其中該庫的每個(gè)成員包含試劑特異性反應(yīng)產(chǎn)物和相應(yīng)的標(biāo)簽，所述標(biāo)簽編碼已參與形成反應(yīng)產(chǎn)物的每種反應(yīng)物的身份。
36.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的用于產(chǎn)生雙功能復(fù)合物庫的方法，其中每個(gè)成員包含通過涉及化學(xué)反應(yīng)部位和兩種或多種反應(yīng)物的反應(yīng)而形成的展示分子部分，和包含編碼該兩種或多種反應(yīng)物的身份的相應(yīng)密碼子的編碼部分，該方法包括步驟選擇根據(jù)權(quán)利要求30-32或33-35的方法和在選自根據(jù)權(quán)利要求30-32的方法和根據(jù)權(quán)利要求33-35的方法的方法中使用雙功能復(fù)合物的所得早期庫作為不同的新生雙功能復(fù)合物的集合。
37.一種用于鑒定具有預(yù)選性質(zhì)的展示分子的方法，包括步驟i)將按照權(quán)利要求30至36任一項(xiàng)形成的庫經(jīng)受這樣的條件，其中將具有預(yù)定性質(zhì)的展示分子或展示分子的亞群與該庫的剩余部分分開，和ii)通過解碼復(fù)合物的編碼部分而鑒定具有預(yù)選性質(zhì)的展示分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種合成包含反應(yīng)產(chǎn)物和編碼區(qū)域的雙功能復(fù)合物的方法。該復(fù)合物是新生雙功能復(fù)合物和構(gòu)件之間的雜交產(chǎn)物。新生雙功能復(fù)合物包含連接到寡核苷酸標(biāo)識(shí)符區(qū)的連接實(shí)體，構(gòu)件包含和與該標(biāo)識(shí)符區(qū)足夠互補(bǔ)以允許雜交的寡核苷酸連接的功能實(shí)體。然后，功能實(shí)體可通過化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)移到連接實(shí)體上。互補(bǔ)標(biāo)識(shí)符區(qū)還包含獨(dú)特密碼子，它明確地標(biāo)識(shí)該功能實(shí)體。該密碼子在使用酶(例如聚合酶)延伸該標(biāo)識(shí)符區(qū)域時(shí)用作模板以形成獨(dú)特密碼子。獨(dú)特密碼子可用于解碼幾輪功能實(shí)體轉(zhuǎn)移后反應(yīng)產(chǎn)物的合成歷史。
文檔編號(hào)C07B61/00GK1720331SQ200380104764
公開日2006年1月11日 申請日期2003年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月30日
發(fā)明者P-O·弗里斯克加德, T·弗朗奇, A·H·古利艾夫, M·D·倫多夫, J·費(fèi)爾丁, E·K·奧爾森, A·霍爾特曼, S·N·雅克布森, C·薩姆斯, S·S·格萊德, K·B·延森, H·佩德森 申請人:紐韋盧森公司