專(zhuān)利名稱(chēng)：人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基中蟲(chóng)草素提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基中提取蟲(chóng)草素的工藝。
背景技術(shù)：
冬蟲(chóng)夏草(Cw辦ce戸w'"e"W"為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，蟲(chóng)草素(cordycepin,
3'-脫氧腺嘌呤核苷)被認(rèn)為是冬蟲(chóng)夏草的活性成分之一，其純品在國(guó)際市場(chǎng)上 的售價(jià)約為25000美圓/g。蛹蟲(chóng)草(0^4^戸附//^^),又稱(chēng)北冬蟲(chóng)夏草，為 蟲(chóng)草屬的重要種，作為冬蟲(chóng)夏草的代替品之一，據(jù)西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué) 版)，2003， 33(5): 569出版甘志杰，孫文基，陳千良著作"HPLC法測(cè)人 工蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中蟲(chóng)草素"報(bào)道其蟲(chóng)草素的含量為冬蟲(chóng)夏草中蟲(chóng)草素含量的 3-5倍。目前人工培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草技術(shù)已經(jīng)非常成熟，其子實(shí)體的售價(jià)為2000元 /kg，子實(shí)體中蟲(chóng)草素的含量可達(dá)7%。，(見(jiàn)文《中國(guó)中藥雜志》，1998， 23(4): 236郭澄，朱杰著"高效液相色譜法測(cè)定人工蟲(chóng)草中腺苷和蟲(chóng)草素的含量"。) 而從人工蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中提取蟲(chóng)草素的工藝研究文獻(xiàn)報(bào)道也很多，例如《中 國(guó)藥師》2004， 7(12): 929汪宇，于榮敏，楊光照等著"人工培養(yǎng)蟲(chóng)草子座 中核苷類(lèi)化合物的提取工藝研究"?！督K蠶業(yè)》，2003， 25(2): 13潘中華， 貢成良，范雪峰著"蠶蛹蟲(chóng)草中蟲(chóng)草素的提取及純化工藝研究"。生產(chǎn)企業(yè)一 般也只收割人工蛹蟲(chóng)草的子實(shí)體，培養(yǎng)基殘基只用于喂養(yǎng)家畜。
目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道蟲(chóng)草素能夠人工合成，也可以從冬蟲(chóng)夏草中提取，但 產(chǎn)量低，且價(jià)格昂貴。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基也有一定含 量的蟲(chóng)草素，但傳統(tǒng)做法往往是將其遺棄，造成浪費(fèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為充分、合理地利用蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基，提供一種從蛹 蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基中提取蟲(chóng)草素的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 一種人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘 基中蟲(chóng)草素提取工藝，包括對(duì)人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基脫脂，然后調(diào)節(jié)等電點(diǎn)、 除色素、柱洗脫四個(gè)步驟。
所述脫脂步驟中可采取熱水提取或熱乙醇提取，其中優(yōu)選方案為熱乙醇
提取；脫脂后對(duì)殘基回收乙醇轉(zhuǎn)入水溶進(jìn)行調(diào)節(jié)等電點(diǎn)，調(diào)節(jié)到PH3.5，除去部分蛋白質(zhì)及雜質(zhì)；所述除色素步驟先采用添加活性碳吸附，然后對(duì)樣品 過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；所述柱洗脫步驟開(kāi)始時(shí)流速控制在不大于5滴/秒，并少 量多次收集洗脫液，等大部分雜質(zhì)洗脫完畢后，流速即可加快，最后可得到
較純的蟲(chóng)草素。
本發(fā)明方法可以按下述具體步驟操作:先取1000克干燥的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基 1經(jīng)粉碎后用4-8升石油醚室溫浸泡12-36小時(shí)脫脂，過(guò)濾，得到殘基2;將 殘基2烘干，用4-8升乙醇50-10(TC提取6-24小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，減壓回收 溶劑至千，得到20-30克浸膏；將浸膏用250-500毫升蒸餾水熱溶，不溶物 過(guò)濾。濾液中滴加1.0-2.5mol/LHCl，直至溶液PH為3.0-4.0時(shí)，停止滴加， 有沉淀產(chǎn)生，過(guò)濾，得到濾液l;在濾液1中按重量比1-8%加入活性碳，超 聲振蕩1-10小時(shí)，過(guò)濾，得到濾液2;將濾液加入到經(jīng)處理好732-型陽(yáng)離子 交換樹(shù)脂，并用2-5倍柱體積PH3.0-4.0的鹽酸平衡液固定蟲(chóng)草素，再用5-15 升的蒸餾水過(guò)柱，去除雜質(zhì)；最后用0.10-0.20mol/L的NH3H2O洗脫液洗脫， 流速為5滴/秒，開(kāi)始時(shí)每20毫升收集一瓶，后改為每50毫升收集一瓶，HPLC 檢測(cè)，以蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，直至蟲(chóng)草素洗脫完畢；合并以蟲(chóng)草素為主成分 的流份，減壓濃縮至小體積，冰箱放置，過(guò)夜，析出蟲(chóng)草素。
所述蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基1經(jīng)粉碎后用4-8升石油醚脫脂、過(guò)濾時(shí)分兩次進(jìn)行， 每次用一半溶劑；所述殘基2烘干后用4-8升乙醇提取時(shí)，分兩次進(jìn)行，每 次用一半溶劑。
采用本發(fā)明所述的技術(shù)方案通過(guò)四個(gè)簡(jiǎn)單的步驟就可以最大程度地從人
工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基中提取分離得到高純度的蟲(chóng)草素，達(dá)到出口標(biāo)準(zhǔn)。由于 該技術(shù)僅使用水-乙醇溶劑，所得產(chǎn)品無(wú)有害溶劑殘留。本技術(shù)操作簡(jiǎn)單易行， 利于企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。


圖l所示為本發(fā)明工藝步驟圖2所示為蟲(chóng)草素洗脫液HPLC檢測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明主要包括對(duì)人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基脫脂，然后調(diào)節(jié)等電點(diǎn)、除色 素、柱洗脫四個(gè)步驟。如圖1所示，先取干燥的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基1經(jīng)粉碎
后用石油醚室溫浸泡脫脂，過(guò)濾，得到殘基2;將殘基2烘干，用熱乙醇提 取得到甲醇提取物，用熱水溶解，不溶物過(guò)濾；調(diào)節(jié)PH為3.0-4.0，過(guò)濾， 得到濾液l;在濾液l中加入活性碳，超聲振蕩，過(guò)濾，得到濾液2;將濾液
2加入到經(jīng)處理好732-型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，并用鹽酸平衡液固定蟲(chóng)草素，再 用蒸餾水過(guò)柱，去除雜質(zhì)；最后用NH3H20洗脫液洗脫，析出蟲(chóng)草素。
下面是幾個(gè)具體實(shí)施例。
實(shí)施例1
先取1000克干燥的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基1經(jīng)粉碎后用4升(分兩次，每次2升) 石油醚室溫浸泡18小時(shí)脫脂，過(guò)濾，得到殘基2;將殘基2烘干，用5升(2 X3L)乙醇7(TC提取IO小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，減壓回收溶劑至干，得到25克 浸膏；將浸膏用350毫升蒸餾水熱溶，不溶物過(guò)濾。濾液中滴加1.5mol/LHCl， 直至溶液PH3.0時(shí)，停止滴加，有沉淀產(chǎn)生，過(guò)濾，得到濾液1;在濾液1 中按重量比3%加入12克活性碳，超聲振蕩2.5小時(shí)，過(guò)濾，得到濾液2; 將濾液加入到經(jīng)處理好732-型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，并用2.5倍柱體積PH3.5的 鹽酸平衡液固定蟲(chóng)草素，再用8升的蒸餾水過(guò)柱，去除雜質(zhì);最后用0.10mol/L 的NH;H20洗脫液洗脫，流速為5滴/秒，幵始時(shí)每20毫升收集一瓶，后改 為每50毫升收集一瓶，HPLC檢測(cè)，以蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，直至蟲(chóng)草素洗脫 完畢；合并以蟲(chóng)草素為主成分的流份，減壓濃縮至小體積，冰箱放置，過(guò)夜， 析出蟲(chóng)草素。
實(shí)施例2
先取1000克干燥的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基1經(jīng)粉碎后用6升(分兩次)石油醚室溫 浸泡24小時(shí)脫脂，過(guò)濾，得到殘基2;將殘基2烘干，用6升(分兩次，每 次3升)乙醇8(TC提取12小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，減壓回收溶劑至干，得到28 克浸膏；將浸膏用400毫升蒸餾水熱溶，不溶物過(guò)濾。濾液中滴加2mol/LHCl， 直至溶液PH3.5時(shí)，停止滴加，有沉淀產(chǎn)生，過(guò)濾，得到濾液l;在濾液l 屮按重量比5%加入15克活性碳，超聲振蕩3小時(shí)，過(guò)濾，得到濾液2;將 濾液加入到經(jīng)處理好732-型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，并用3倍柱體積PH3.5的鹽酸 平衡液固定蟲(chóng)草素，再用10升的蒸餾水過(guò)柱，去除雜質(zhì)；最后用0.15mol/L 的NHvH20洗脫液洗脫，流速為5滴/秒，開(kāi)始時(shí)每20毫升收集一瓶，后改 為每50毫升收集一瓶，HPLC檢測(cè)，以蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，直至蟲(chóng)草素洗脫 完畢；合并以蟲(chóng)草素為主成分的流份，減壓濃縮至小體積，冰箱放置，過(guò)夜， 析出蟲(chóng)草素。
實(shí)施例3
先取1000克干燥的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基1經(jīng)粉碎后用6升(分兩次)石油醚室溫 浸泡36小時(shí)脫脂，過(guò)濾，得到殘基2;將殘基2烘干，用8升(分兩次，每
次4升)乙醇9(TC提取18小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，減壓回收溶劑至干，得到30 克浸膏；將浸膏用500毫升蒸熘水熱溶，不溶物過(guò)濾。濾液中滴加2.5mol/L HC1，直至溶液PH4.0時(shí)，停止滴加，有沉淀產(chǎn)生，過(guò)濾，得到濾液l;在濾 液l中按重量比8。/。加入20克活性碳，超聲振蕩3.5小時(shí)，過(guò)濾，得到濾液 2;將濾液加入到經(jīng)處理好732-型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，并用3.5倍柱體積PH3.5 的鹽酸平衡液固定蟲(chóng)草素，再用15升的蒸餾水過(guò)柱，去除雜質(zhì)；最后用 0.20mol/L的NH3H20洗脫液洗脫，流速為5滴/秒，開(kāi)始時(shí)每20毫升收集一 瓶，后改為每50毫升收集一瓶，HPLC檢測(cè)，以蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，直至蟲(chóng) 草素洗脫完畢；合并以蟲(chóng)草素為主成分的流份，減壓濃縮至小體積，冰箱放 置，過(guò)夜，析出蟲(chóng)草素。
如圖2所示，在上述實(shí)施例1、2、3中，蟲(chóng)草素的洗脫液經(jīng)高壓液相(HPLC) 檢測(cè)，純度不低于80%，達(dá)到出口標(biāo)準(zhǔn)，總得率不低于1%。。
權(quán)利要求
1、一種人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基中蟲(chóng)草素提取工藝，其特征是包括對(duì)人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基脫脂，然后調(diào)節(jié)等電點(diǎn)、除色素、柱洗脫四個(gè)步驟。
2、 如權(quán)利要求1所述的人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基中蟲(chóng)草素提取工藝，其特 征是所述脫脂步驟中可采取熱水提取或熱乙醇提取，其中優(yōu)選方案為熱乙醇 提??；脫脂后對(duì)殘基回收乙醇轉(zhuǎn)入水溶進(jìn)行調(diào)節(jié)等電點(diǎn)，調(diào)節(jié)到PH3.5，除 去部分蛋白質(zhì)及雜質(zhì)；所述除色素步驟先采用添加活性碳吸附，然后對(duì)樣品 過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；所述柱洗脫步驟開(kāi)始時(shí)流速控制在不大于5滴/秒，并少 量多次收集洗脫液，等大部分雜質(zhì)洗脫完畢后，流速即可加快，最后可得到 較純的蟲(chóng)草素。
3、 如權(quán)利要求2所述的人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基中蟲(chóng)草素提取工藝，其特 征是先取1000克干燥的蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基1經(jīng)粉碎后用4-8升石油醚室溫浸泡 12-36小時(shí)脫脂，過(guò)濾，得到殘基2;將殘基2烘干，用4-8升乙醇50-100。C 提取6-24小時(shí)，冷卻后過(guò)濾，減壓回收溶劑至干，得到20-30克浸膏；將浸 膏用250-500毫升蒸餾水熱溶，不溶物過(guò)濾。濾液中滴加1.0-2.5mol/LHCl， 直至溶液PH為3.0-4.0時(shí)，停止滴加，有沉淀產(chǎn)生，過(guò)濾，得到濾液l;在 濾液1中按重量比1-8%加入活性碳，超聲振蕩1-10小時(shí)，過(guò)濾，得到濾液2; 將濾液加入到經(jīng)處理好732-型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，并用2-5倍柱體積PH3.0-4.0 的鹽酸平衡液固定蟲(chóng)草素，再用5-15升的蒸餾水過(guò)柱，去除雜質(zhì)；最后用 0.10-0.20mol/L的NH3'H20洗脫液洗脫，流速為5滴/秒，開(kāi)始時(shí)每20毫升收 集一瓶，后改為每50毫升收集一瓶，HPLC檢測(cè)，以蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，直 至蟲(chóng)草素洗脫完畢；合并以蟲(chóng)草素為主成分的流份，減壓濃縮至小體積，冰 箱放置，過(guò)夜，析出蟲(chóng)草素。
4、 如權(quán)利要求3所述的人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基中蟲(chóng)草素提取工藝，其特 征是所述蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基1經(jīng)粉碎后用4-8升石油醚脫脂、過(guò)濾時(shí)分兩次進(jìn)行， 每次用一半溶劑；所述殘基2烘干后用4-8升乙醇提取時(shí)，分兩次進(jìn)行，每
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基中蟲(chóng)草素提取工藝，包括對(duì)人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基脫脂，然后調(diào)節(jié)等電點(diǎn)、除色素、柱洗脫四個(gè)步驟。采用本發(fā)明所述的技術(shù)方案通過(guò)四個(gè)簡(jiǎn)單的步驟就可以最大程度地從人工蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基殘基中提取分離得到高純度的蟲(chóng)草素，達(dá)到出口標(biāo)準(zhǔn)。由于該技術(shù)僅使用水-乙醇溶劑，所得產(chǎn)品無(wú)有害溶劑殘留。本技術(shù)操作簡(jiǎn)單易行，利于企業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H19/00GK101200481SQ20061012839
公開(kāi)日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者劉吉開(kāi), 麻兵繼 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)