專利名稱：用于制造寡核苷酸的方法
用于制造寡核苷酸的方法 本申請要求2008年4月24日提交的U. S.申請?zhí)?0/047524的權(quán)益，其全部內(nèi)容 通過引用結(jié)合在此。本發(fā)明涉及一種用于制造寡核苷酸的方法。寡核苷酸及其衍生物是例如用于癌癥 治療的有用的候選藥物。在寡核苷酸的合成過程中，特別是通過亞磷酰胺方法時，氰乙基保護(hù)基常見的 是用作磷的保護(hù)基。將這些氰乙基團(tuán)進(jìn)行脫保護(hù)是為了到達(dá)最終產(chǎn)物的一個步驟。US專利6，858，715和7，199，236 (其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在本說明書中)描述 了一種將氰乙基保護(hù)基進(jìn)行脫保護(hù)的方法，其中必須使用一種胺，該胺的共軛酸具有 一個從約8到約11 WpKa。Eritja et al. Helv. Chim. Acta, Vol 83 (2000) ρ· 1417-1423 披露了使用 DBU 在乙 腈中的0. 5Μ濃溶液將用β -氰乙基保護(hù)的寡核苷酸進(jìn)行脫保護(hù)的方法?，F(xiàn)在已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，即便是其共軛酸具有大于11. 5(例如約12)的pKa的 強(qiáng)堿，也可以在特定條件下引起對(例如)氰乙基保護(hù)基的實質(zhì)上完全的脫保護(hù)，而同 時基本上避免氰乙基到核堿基(特別是胸苷)的多種加合物的形成。本發(fā)明因此涉及一種制造寡核苷酸的方法，該方法包括至少一個步驟，該步驟是 去除消除的保護(hù)磷的基團(tuán)，特別是來自一種受保護(hù)的寡核苷酸的氰乙基保護(hù)基，其 中所述去除包括使該受保護(hù)的寡核苷酸與一種胺溶液在一種溶劑中進(jìn)行接觸，該溶劑優(yōu)選 不包含吡啶，其中該胺的共軛酸具有一個大于11.5的pKa，并且其中該胺在該溶液中的濃 度是小于0.5摩爾/升。已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的方法允許以高的選擇性和產(chǎn)率對磷受保護(hù)的 多種寡核苷酸(特別是對氰乙基保護(hù)基)進(jìn)行特別有效的脫保護(hù)。在脫保護(hù)的過程中 所不希望的副反應(yīng)可以基本上避免。該胺在溶液中的濃度是高于0摩爾/升。它優(yōu)選等于或高于0. 03摩爾/升。胺 在溶液中的濃度經(jīng)常是低于或等于0. 4，優(yōu)選低于或等于0. 3摩爾/升，更優(yōu)選低于或等于 0. 25摩爾/升。這種優(yōu)選的濃度可以為，例如，低于或等于0. 15摩爾/升，或者低于或等于 0. 1摩爾/升。約0. 05摩爾/升的一種胺濃度給出了良好的結(jié)果。與該受保護(hù)的寡核苷酸相接觸的胺的總量可以變化。在一個實施方案中，該量是 使該胺與這些有待被去除的保護(hù)基(特別是氰乙基保護(hù)基)之間的摩爾比為等于或大 于1。在另一個實施方案中，與該受保護(hù)的寡核苷酸相接觸的胺的總量是使該胺與這些 有待被去除的保護(hù)基(特別是β-氰乙基保護(hù)基)之間的摩爾比為等于或大于0.01并且 等于或小于0.9，優(yōu)選約0. 1。術(shù)語“寡核苷酸”在本發(fā)明的框架中具體是指多個核苷單體單元(包括多個連接 到核堿基上的糖單元)的一種寡聚物，所述核苷單體單元通過多個核苷酸間鍵相連接。一 個“核苷酸間鍵”具體是指兩個核苷部分之間的一個化學(xué)連接，例如典型地在天然發(fā)現(xiàn)的 核酸中存在的磷酸二酯連接，或者典型地在多種合成核酸以及核酸類似物中存在的其他連接。這種核苷酸間鍵可以，例如，包括一個磷酸(phospho)或亞磷酸酯基團(tuán)，并且可能包括 一些連接，在這些連接中磷酸或亞磷酸基團(tuán)的一個或多個氧原子或被一個取代基修飾、或 被其他原子取代，例如硫原子或者單或二烷基氨基中的氮原子。典型的核苷酸間鍵是磷酸 的二酯類或其衍生物，例如磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硫代磷酰胺酯。術(shù)語“核 苷”應(yīng)理解為具體是指由一個核堿基連接到一個糖上所構(gòu)成的一種化合 物。糖類包括但不限于呋喃糖環(huán)，如核糖、2’ -脫氧核糖，以及非呋喃糖環(huán)，如環(huán)己烯基、脫 水己糖醇、嗎啉基。在核苷中所包括的糖中，在下文中指出的修飾、取代以及位置是參考呋 喃糖而討論的，但是相同的修飾和位置也適用于其他糖環(huán)的類似的位置。該糖可以被進(jìn)一 步修飾。作為糖的修飾的非限制性例子，值得注意地可以提及例如在2’ -或3’ -位置的修 飾，特別是在一個呋喃糖環(huán)的2’ -位置的修飾，包括例如氫；羥基；烷氧基，如甲氧基、乙氧 基、烯丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、甲氧乙基、烷氧基、苯氧基；疊氮基；氨基；烷氨 基；氟、氯和溴；2’ _4’ -和3’ _4’ -連接的呋喃糖環(huán)修飾，在該呋喃糖環(huán)中的修飾包括例如 針對環(huán)的4’ -0被S、CH2、NR、CHF或CF2取代。術(shù)語“核堿基”應(yīng)理解為具體是指一個含氮的雜環(huán)部分，該部分能夠與一個(特別 是互補的)核堿基或核堿基類似物進(jìn)行配對。典型的核堿基是天然存在的核堿基，包括嘌 呤堿基中的腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基中的胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧 啶(U)，以及修飾過的核堿基；包括其他合成和天然核堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、 5_羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷 基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和 2_硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、以及嘧啶堿基的其他 炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫代尿嘧啶、 8-鹵代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代 特別是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺 嘌呤、2-氟-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮鳥嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫 氮腺嘌呤、3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤、以及氟化的堿基。進(jìn)一步被修飾的核堿基包括 三環(huán)的嘧啶類，例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噁嗪-2(3H)_酮)、吩噻嗪 胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噻嗪_2 (3H)_酮)，G字夾型物例如一種被取代的吩噁 嗪胞苷(如9-(2_氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噁嗪-2(3H)_酮)、咔唑胞 苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)，吡啶吲哚胞苷(H-吡啶并[3’，2’ 4,5]吡咯并[2， 3-d]嘧啶-2-酮)。其他可能的合適堿基包括通用堿基、疏水堿基、混雜堿基(promiscuous bases)禾口尺寸擴(kuò)大減基(size-expanded bases) 0在根據(jù)本發(fā)明的方法中，該溶劑經(jīng)常包括一種鹵化的化合物，例如含有1或2個碳 原子的氯代烷，例如二氯甲烷或1，2_ 二氯乙烷。二氯甲烷作為含氯溶劑是優(yōu)選的。包含氰烷基化合物的溶劑是優(yōu)選的。乙腈作為氰烷基化合物是優(yōu)選的。一種主要包含上述化合物的溶劑是優(yōu)選的。更具體地，該溶劑優(yōu)選包含乙腈。在本發(fā)明中使用的由特定的β-消除的保護(hù)磷的基團(tuán)(Rt)保護(hù)的核苷酸間鍵可 以在以下化學(xué)式I中表示
權(quán)利要求
1.一種用于制造寡核苷酸的方法，包括從受保護(hù)的寡核苷酸上去除β-消除的保護(hù)磷 的基團(tuán)，特別是β-氰乙基保護(hù)基，其中所述去除包括使該受保護(hù)的寡核苷酸與胺溶液在 溶劑中進(jìn)行接觸，該溶劑優(yōu)選不是由吡啶組成，其中該胺的共軛酸的PKa優(yōu)選大于11. 5，并 且其中該胺在該溶液中的濃度小于0. 5摩爾/升。
2.一種用于制造寡核苷酸的方法，該寡核苷酸選自BNA、LNA、ENA、UNA以及它們的衍生 物，該方法至少包括從受保護(hù)的BNA、LNA、ENA或UNA-寡核苷酸上去除β -消除的保護(hù)磷的 基團(tuán)、特別是氰乙基保護(hù)基的步驟，其中，所述去除包括使該受保護(hù)的寡核苷酸與胺在 溶劑中進(jìn)行接觸，其中該胺的共軛酸的PKa大于11. 5，并且該溶劑優(yōu)選不是由吡啶組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該胺在該溶液中的濃度為0.03至0. 25摩爾 /升。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該溶劑包含鹵化物或氰烷基化合物或者其基 本上由商化物或氰烷基化合物組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中該溶劑包含乙腈或其基本上由乙腈組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項所述的方法，其中使該寡核苷酸與該胺溶液接觸3 至360分鐘的反應(yīng)時間。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中該反應(yīng)時間少于30分鐘，優(yōu)選等于或少于20分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任何一項所述的方法，其中該去除是在10°C到60°C的溫度下 進(jìn)行的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任何一項所述的方法，其中該受保護(hù)的寡核苷酸被附連到固 體載體上。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一項所述的方法，其中使用了胺，其共軛酸的PKa為 11. 5至12. 5，優(yōu)選約12。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中該胺是DBU(1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一 碳-7-烯)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1、或3至9中任何一項所述的方法，其中使用了胺，其共軛酸的pKa 為8至11. 5。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任何一項所述的方法，其中與該受保護(hù)的寡核苷酸相接觸 的胺的總量是如下的量，使得該胺與這些有待去除的保護(hù)基、特別是氰乙基保護(hù)基的 摩爾比為等于或大于1。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任何一項所述的方法，其中與該受保護(hù)的寡核苷酸相接 觸的胺的總量是如下的量，使得該胺與這些有待在脫保護(hù)過程中被去除的保護(hù)基、特別是 β -氰乙基保護(hù)基的摩爾比為等于或大于0. 01，并且等于或小于0. 9，優(yōu)選約0. 1。
15.根據(jù)權(quán)利要求1、或3至14中任何一項所述的方法，其中該寡核苷酸選自DNA、RNA、 BNA、LNA、ΕΝΑ、UNA以及它們的衍生物。
全文摘要
一種用于制造寡核苷酸的方法，該方法包括從一種受保護(hù)的寡核苷酸上去除β-消除的保護(hù)磷的基團(tuán)，特別是β-氰乙基保護(hù)基，其中所述去除包括使該受保護(hù)的寡核苷酸與一種胺溶液在一種溶劑中進(jìn)行接觸，該溶劑優(yōu)選不包含吡啶，其中該胺的共軛酸優(yōu)選具有一個大于11.5的pKa，并且其中該胺在該溶液中的濃度是小于0.5摩爾/升。
文檔編號C07H21/04GK102076703SQ200980123166
公開日2011年5月25日 申請日期2009年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月24日
發(fā)明者凱文·詹姆斯·芬恩, 哈根·克拉默, 塔德烏什·克日什托夫·維爾奇凱維奇, 朱輝赫 申請人:集潤德斯股份公司