專利名稱：含rgd的擬肽和其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的新穎環(huán)狀擬肽和其用途，例如用于癌癥診斷和治療中?？s寫AcOH，乙酸；Alloc，烯丙氧基羰基；Bpheide，細菌脫鎂葉綠酸；BTA(細菌脫鎂葉綠酸牛磺酸酰胺)，31-氧代-15-甲氧基羰基甲基-紅細菌綠素131- -磺乙基)酰胺；BTC，雙(三氯甲基)碳酸酯；Dab，二氨基丁酸；Dap，二氨基丙酸；DCM，二氯甲烷；Dde， 1-G，4-二甲基-2，6-二氧代亞環(huán)己基)乙基；DIC，二異丙基碳二亞胺；DIEA，二異丙基乙胺；DMBA，二甲基巴比妥酸；DMF, N, N-二甲基甲酰胺；DMS0，二甲亞砜；D0TA，1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸；DTPA，二亞乙基三胺五乙酸；Et2O，乙醚；FITC，異硫氰酸熒光素；Fmoc，芴甲氧羰基；GABA, γ-氨基丁酸；HATU，0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3， 3-四甲基-脲六氟磷酸鹽；HOAt，1-羥基-7-氮雜苯并三唑；HOBt，N-羥基苯并三唑；Lys， 賴氨酸；MeOH，甲醇；Nal，萘基丙氨酸；Orn，鳥氨酸；I^bf，2，2，4，6，7-五甲基-二氫苯并呋喃-5-磺?；?；PyBOP，苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-磷六氟磷酸鹽；RP-HPLC，反相高效液相色譜；RT，室溫；TFA，三氟乙酸；TFE，三氟乙醇；TIS，三異丙基硅烷。
背景技術：
例如纖維粘連蛋白(fibronectin)(Pierschbacher 和 Ruoslahti，1984)和玻璃粘連蛋白(vitronectin)等胞外基質(ECM)組分的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp ； RGD)基序可與整合素結合(Ruoslahti 和 Pierschbacher，1987 ；D' Souza SE 等人，1991 ； Joshi等人，1993 ；Koivunen等人，1994)。由整合素介導的粘附引起調控細胞存活、增殖和遷移的胞內(nèi)信號傳導事件。已知約25種整合素，且其中至少有8種結合作為其配體中主要識別序列的RGD基序。用于篩檢含RGD肽的噬菌體展示方法(Pasqualini和Ruoslahti，1996)所獲得的數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示所述肽與腫瘤血管內(nèi)皮層的選擇性結合(Ruoslahti，1996 ；Pasqualini等人，1997)。因為據(jù)報道整合素的表達在活化內(nèi)皮細胞(EC)上很高，但在休眠內(nèi)皮細胞上比較有限，所以已經(jīng)提出小型合成含R⑶肽作為抑制血管內(nèi)皮和腫瘤細胞生長的拮抗劑。RGD 肽還延遲信號傳輸，影響細胞遷移并誘導腫瘤細胞衰退或細胞凋亡(Su等人，2002)。RGD 類似物用于腫瘤成像(Haubner等人，2001)中、抗血管生成方法(Kawaguchi等人，2001 ； Pasqualini等人，2000)中以及放射性核素(van Hagen等人，2000)和化療藥物(Arap等人，1998 ；Zitzmann等人，2002)的腫瘤靶向中。整合素也在癌細胞上表達，且在癌細胞的侵入、轉移、增殖和凋亡中起重要作用。 腫瘤細胞轉移侵入優(yōu)選器官可能代表著細胞歸巢現(xiàn)象(cell-homing phenomena)，其取決于腫瘤細胞與器官特異性內(nèi)皮標志物之間的粘附相互作用(Ruoslahti和RajOtte，2000)。 通過與內(nèi)皮或腫瘤細胞的整合素結合，RGD肽能通過抑制轉移過程必需的腫瘤細胞-ECM和腫瘤細胞-EC連接來調節(jié)體內(nèi)細胞交通。一些研究已經(jīng)表明了含RGD的化合物可干擾體外
7(Goligorsky 等人，1998 ；Romanov 和 Goligorsky 1999)和體內(nèi)(Saiki 等人，1989 ；Hardan 等人，199 腫瘤細胞轉移過程。對個別整合素具有特異性的肽受到非常多的關注且在醫(yī)學上可能很重要。α νβ 3 整合素是顯示與腫瘤血管生成有關的第一種整合素。特異性地阻斷ανβ3整合素的RGD 肽有希望成為腫瘤和視網(wǎng)膜血管生成的抑制劑、骨質疏松的抑制劑和腫瘤血管系統(tǒng)的靶向藥物(Assa-Munt等人，2001)。抗癌藥多柔比星(doxorubicin)或促凋亡肽與ανβ3整合素結合RGD肽的偶合會產(chǎn)生在針對小鼠異種移植腫瘤測試時活性大于且毒性小于未經(jīng)修飾的藥物的化合物(Ruoslahti，2000 ；Arap等人，1998 ；Arap等人，2002 ；Ellerby等人， 1999)。因此，已經(jīng)在設計和制造整合素結合肽和擬肽方面進行了大量工作(Haubner等人， 1996 ；Locardi 等人，1999 ；Lark 等人，1999 ；Raboisson 等人，2006 ；Belvisi 等人，2005 ； Dijkgraaf 等人，2006 ；Banfi 等人，2007 ；US 5，849，692)。US 6, 576, 239,EP 0927045 和 WO 98/010795 公開了一種包含含氨基酸序列 RGD 或 NGR的腫瘤歸巢肽的結合物，所述肽與治療或診斷部分連接，前提是所述部分不是噬菌體粒子。治療部分可以是細胞毒性劑或癌癥化療劑，如多柔比星。結合物在體內(nèi)給藥時選擇性地歸巢于血管生成性血管系統(tǒng)。腫瘤歸巢肽可以是長度長達20或30個氨基酸或50-100 個氨基酸的線性或環(huán)狀肽。一種優(yōu)選的肽是環(huán)狀九肽⑶CRGDCFC或H-CyS*-ASp-CyS*-Arg-Gly-Asp-Cy s*-Phe_Cys*-NH2。WO 2008/023378公開了一種含RGD肽或RGD擬肽與選自卟啉、葉綠素或細菌葉綠
素的光敏劑的結合物。

發(fā)明內(nèi)容
在一方面，本發(fā)明涉及含RGD的環(huán)狀擬肽，其具有通式I :
權利要求
1.一種含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的環(huán)狀擬肽，其具有通式I
2.一種具有通式I的權利要求1的含RGD的環(huán)狀擬肽。
3.一種具有通式II的權利要求1的含RGD的環(huán)狀擬肽。
4.根據(jù)權利要求2所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中X是-NH-或-NH-R-，且R是衍生自直鏈C2-C6烷烴、C2-C6烯烴或C2-C6炔烴、優(yōu)選衍生自C2-C4烷烴、C2-C4烯烴或C2-C4炔烴、更優(yōu)選衍生自乙烷的亞烴基。
5.根據(jù)權利要求2所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中X是-NH-R-且R是衍生自經(jīng)2個 C1-C2烷基取代的C6-C14單環(huán)或多環(huán)芳香族烴的亞烴基，優(yōu)選1，3_ 二甲基苯-1，3- 二基。
6.根據(jù)權利要求2所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中X是-NH-R-且R與其連接的氮原子一起形成5或6元飽和或不飽和雜環(huán)，優(yōu)選哌啶-1，4- 二基。
7.根據(jù)權利要求2所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中X是-0-R-，且R是衍生自直鏈C2-C6 烷烴、C2-C6烯烴或C2-C6炔烴、優(yōu)選衍生自C2-C4烷烴、C2-C4烯烴或C2-C4炔烴、更優(yōu)選衍生自乙烷的亞烴基。
8.根據(jù)權利要求2所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中X是-S-或-S-R-，且R是衍生自直鏈C2-C6烷烴、C2-C6烯烴或C2-C6炔烴、優(yōu)選衍生自C2-C4烷烴、C2-C4烯烴或C2-C4炔烴、更優(yōu)選衍生自乙烷的亞烴基。
9.根據(jù)權利要求2或4至8中任一權利要求所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中A1是選自賴氨酸(Lys)、二氨基丙酸(Dap)、二氨基丁酸(Dab)、鳥氨酸(Orn)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸 (Asp)或氨基己二酸的氨基酸的殘基。
10.根據(jù)權利要求3所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中A1是選自賴氨酸(Lys)、二氨基丙酸(Dap)、二氨基丁酸(Dab)、鳥氨酸(Orn)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)或氨基己二酸的氨基酸的殘基；A2是選自苯丙氨酸(Wie)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、纈氨酸(Val)、甘氨酸(Gly) 或Asp的氨基酸的殘基；且A3是選自在C端經(jīng)酰胺化的Dap、Dab、0rn或Lys殘基的氨基酸殘基。
11.根據(jù)權利要求9所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中X是-NH-且A1是Dap。
12.根據(jù)權利要求9所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亞烴基,且 A1 是 Dap、Dab、Orn 或 Lys0
13.根據(jù)權利要求9所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中X是-NH-R-，R是衍生自丙烷、正丁烷或正己烷的亞烴基，且A1是Orn。
14.根據(jù)權利要求9所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中X是-0-R-，R是衍生自乙烷的亞烴基,且Aj Dap或Lys0
15.根據(jù)權利要求10所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中A1是Lys，A2是Wie、Val、D-Phe、 Gly或Asp，且A3是在C端經(jīng)酰胺化的Dap。
16.根據(jù)權利要求10所述的含RGD的環(huán)狀擬肽，其中A1是Lys，A2是Wie，且A3是在C 端經(jīng)酰胺化的Dab、Orn或Lys。
17.一種根據(jù)權利要求1至16中任一權利要求所述的含RGD的環(huán)狀擬肽和選自熒光探針、光敏劑、螯合劑或細胞毒性劑的有效載荷部分的結合物，所述有效載荷部分與所述擬肽中的氨基酸殘基A1連接，前提是當A1具有側鏈氨基時，所述有效載荷部分任選地通過間隔子與A1的α-或側鏈氨基連接，且當A1是二羧酸氨基酸殘基時，所述有效載荷部分任選地通過間隔子與A1的α -或側鏈羧基連接。
18.根據(jù)權利要求17所述的結合物，其中所述含RGD的環(huán)狀擬肽是權利要求1中的通式I的化合物。
19.根據(jù)權利要求17所述的結合物，其中所述含RGD的環(huán)狀擬肽是權利要求1中的通式II的化合物。
20.根據(jù)權利要求17至19中任一權利要求所述的結合物，其中所述間隔子選自天然或非天然氨基酸部分、具有不超過8個氨基酸的小肽部分、二胺殘基、C1-C25亞烴基或可溶性聚合物。
21.根據(jù)權利要求20所述的結合物，其中所述氨基酸選自甘氨酸(Gly)、β-丙氨酸(β-Ala)、苯丙氨酸(Phe)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、1-萘基丙氨酸(I-Nal)、D-I-萘基丙氨酸(D-I-Nal)、Y-氨基丁酸(GABA)或3_(氨基甲基)苯甲酸；所述二胺殘基是-HN- (CH2) 2-NH-或-HN- (CH2) 4_NH_ ；所述C1-C25亞烴基是C1-Cltl亞烷基或亞苯基，其經(jīng)2 個末端官能團例如0H、C00H、S03H、C0SH或NH2取代，從而形成醚、酯、酰胺、硫代酰胺或磺酰胺基團；且所述可溶性聚合物選自直鏈或支鏈聚乙二醇(PEG)或其共聚物、聚丙交酯(PLA) 或其共聚物、具有合適官能團的基于PLA、聚乙交酯(PGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)的聚酯或其共聚物、或基于聚甲基丙烯酰胺的聚酰胺或其共聚物，所述聚合物具有合適官能團。
22.根據(jù)權利要求17至19中任一權利要求所述的結合物，其中所述有效載荷是熒光探針。
23.根據(jù)權利要求22所述的結合物，其中所述熒光探針選自細菌脫鎂葉綠酸?；撬狨０?BPheide taurine amide，BTA)、異硫氰酸芴酯(fluorenyl isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、丹磺酰(dansyl)、羅丹明(rhodamine)、曙紅(eosin)或赤蘚紅(erythrosine)。
24.根據(jù)權利要求18所述的結合物，其中所述有效載荷是與A1直接連接的BTA，X 是-NH-且A1是Dap (結合物2)。
25.根據(jù)權利要求18所述的結合物，其中所述有效載荷是與A1直接連接的BTA，X 是-NH-R-，且(i)R是衍生自乙烷的亞烴基，且A1是通過其α -或側鏈氨基與所述BTA連接的Dap、 Dab、Orn或Lys (分別是結合物1、3、4、5和6)；(ii)R是衍生自丙烷、正丁烷或正己烷的亞烴基，且、是0111(分別是結合物24、25和 26)；或(iii)R是1，3- 二甲基苯-1，3- 二基或哌啶-1，4- 二基，且A1是Orn (分別是結合物15 和 23)。
26.根據(jù)權利要求18所述的結合物，其中所述有效載荷是與A1直接連接的丹磺酰，X 是-NH-R-，且(i)R是衍生自乙烷的亞烴基，且A1是Dap、0rn或Lys (分別是結合物19、18和16)；或(ii)R是衍生自正丁烷的亞烴基，且A1是Orn (結合物21)。
27.根據(jù)權利要求18所述的結合物，其中所述有效載荷是與A1直接連接的BTA，X 是-0-R-，R是衍生自乙烷的亞烴基，且A1是Dap或Lys (分別是結合物7和8)。
28.根據(jù)權利要求18所述的結合物，其中所述有效載荷是通過間隔子與A1連接的BTA， X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亞烴基，A1是Dap，且所述間隔子是Gly、β -Ala、GABA, Phe, D-PheU-Nal, D_l_Nal或3_ (氨基甲基)苯甲酸部分，或1，2_乙二胺或1，4-二氨基丁烷的殘基(分別是結合物9、10、11、27、28、29、30、31、32和33)。
29.根據(jù)權利要求18所述的結合物，其中所述有效載荷是通過間隔子與A1連接的 FITC，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亞烴基，且(DA1是Dap，且所述間隔子是β-Ala部分(結合物12)；或(U)A1是1^8，且所述間隔子是β-Ala或GABA部分(分別是結合物13和14)。
30.根據(jù)權利要求18所述的結合物，其中所述有效載荷是通過間隔子與A1連接的丹磺酰，X 是-NH-R-，且(i) R是衍生自乙烷的亞烴基，A1是Dap或Lys，且所述間隔子是Gly部分(分別是結合物20和17)；或(ii)R是衍生自正丁烷的亞烴基，~是0111，且所述間隔子是β-Ala部分(結合物22)。
31.根據(jù)權利要求19所述的結合物，其中所述有效載荷是與A1直接連接的BTA，A1是 Lys,且(i)A2是Phe, Val、D-Phe, Gly或Asp,且A3是在C端經(jīng)酰胺化的Dap (分別是結合物 41、42、43、44 和 45)；或(Ii)A2是Phe，且A3是在C端經(jīng)酰胺化的Dab、Orn或Lys (分別是結合物46、47和48)。
32.根據(jù)權利要求17至19中任一權利要求所述的結合物，其中所述有效載荷是光敏劑。
33.根據(jù)權利要求32所述的結合物，其中所述光敏劑選自卟啉、葉綠素或細菌葉綠素， 優(yōu)選葉綠素衍生物或細菌葉綠素衍生物，更優(yōu)選細菌葉綠素衍生物。
34.根據(jù)權利要求18所述的結合物，其中所述有效載荷是與A1直接連接的細菌葉綠素衍生物Pd-BTA，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亞烴基，且A1是Dap (結合物34)。
35.根據(jù)權利要求17至19中任一權利要求所述的結合物，其中所述有效載荷是螯合劑。
36.根據(jù)權利要求35所述的結合物，其中所述螯合劑是DTPA或DOTA。
37.根據(jù)權利要求18所述的結合物，其中所述有效載荷是與A1直接連接的DTPA或 DOTA，X是-NH-R-，R是衍生自乙烷的亞烴基，且A1是Dap (分別是結合物35和36)。
38.根據(jù)權利要求17至19中任一權利要求所述的結合物，其中所述有效載荷是細胞毒性劑。
39.根據(jù)權利要求38所述的結合物，其中所述細胞毒性劑是蒽環(huán)類化療劑，選自多柔比星(doxorubicin)、道諾霄素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星 (idarubicin)和米托蒽醌(mitoxantrone)，優(yōu)選多柔比星；有絲分裂抑制劑，優(yōu)選紫杉醇 (paclitaxel)；拓撲異構酶I抑制劑，優(yōu)選喜樹堿(camptothecin)；或拓撲異構酶II抑制齊U，優(yōu)選橢圓玫瑰樹堿(ellipticine)。
40.一種醫(yī)藥組合物，其包含如權利要求17至39中任一權利要求所定義的結合物或其藥學上可接受的鹽，和藥學上可接受的載劑。
41.根據(jù)權利要求40所述的醫(yī)藥組合物，其中所述有效載荷是熒光探針。
42.根據(jù)權利要求41所述的醫(yī)藥組合物，其包含選自結合物1-33和41-48的結合物。
43.根據(jù)權利要求41或42所述的醫(yī)藥組合物，其用于診斷目的。
44.根據(jù)權利要求43所述的醫(yī)藥組合物，其用于器官和組織顯像，或用于腫瘤診斷。
45.根據(jù)權利要求44所述的醫(yī)藥組合物，其用于利用動態(tài)熒光成像、放射診斷技術或分子磁共振成像(MRI)的腫瘤診斷。
46.根據(jù)權利要求45所述的醫(yī)藥組合物，其中所述放射診斷技術是正電子發(fā)射成像 (PET)或單光子發(fā)射成像(SPET)。
47.根據(jù)權利要求40所述的醫(yī)藥組合物，其中所述有效載荷是光敏劑。
48.根據(jù)權利要求47所述的醫(yī)藥組合物，其包含選自結合物34和37-40的結合物。
49.根據(jù)權利要求47或48所述的醫(yī)藥組合物，其用于光動力療法(PDT)。
50.根據(jù)權利要求49所述的醫(yī)藥組合物，其用于腫瘤或非腫瘤組織的PDT。
51.根據(jù)權利要求50所述的醫(yī)藥組合物，其中所述腫瘤是選自黑色素瘤、結腸癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、腦癌或頭頸癌的原發(fā)性腫瘤或轉移。
52.根據(jù)權利要求50所述的醫(yī)藥組合物，其用于治療老年性黃斑變性，或用于通過限制對脂肪組織的血管供應來治療肥胖癥。
53.根據(jù)權利要求40所述的醫(yī)藥組合物，其中所述有效載荷是螯合劑。
54.根據(jù)權利要求53所述的醫(yī)藥組合物，其包含結合物35或36。
55.根據(jù)權利要求53或M所述的醫(yī)藥組合物，其用于放射成像或放射療法中。
56.根據(jù)權利要求40所述的醫(yī)藥組合物，其中所述有效載荷是細胞毒性劑。
57.根據(jù)權利要求56所述的醫(yī)藥組合物，其用于靶向型化療中。
58.如權利要求17至39中任一權利要求所定義的結合物或其藥學上可接受的鹽在用于制備用于診斷目的、光動力療法(PDT)、放射成像或放射療法或靶向型化療的醫(yī)藥組合物中的用途。
59.根據(jù)權利要求17至39中任一權利要求所述的結合物或其藥學上可接受的鹽，其用于診斷目的、光動力療法(PDT)、放射成像或放射療法或靶向型化療。
全文摘要
本發(fā)明提供含RGD的環(huán)狀擬肽；所述擬肽與選自熒光探針、光敏劑、螯合劑或細胞毒性劑的有效載荷部分的結合物；和包含這些結合物的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的結合物可用于各種疾病、病癥和病狀的診斷目的和治療。更具體地說，包含熒光探針的結合物可用于診斷目的，例如器官和組織顯像和腫瘤診斷；包含光敏劑的結合物可用于腫瘤和非腫瘤組織的光動力療法；包含螯合劑的結合物可用于放射成像或放射療法；且包含細胞毒性劑的結合物可用于靶向型化療。
文檔編號C07K5/10GK102264756SQ200980152371
公開日2011年11月30日 申請日期2009年10月22日 優(yōu)先權日2008年10月23日
發(fā)明者D·埃倫, N·科迪諾瓦, T·葉切茲克爾, Y·薩利特拉 申請人:斯特巴生物技術股份有限公司