專利名稱：人源化的FcγR小鼠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域是缺失內(nèi)源鼠Fe YR基因的遺傳修飾的非人動物，包括內(nèi)源Fe YR基因被人Fe Y R基因替代的遺傳修飾的動物，包括能夠表達(dá)至少2、3、4或5種功能性人低親和力Fe Y R基因的小鼠，以及包括包含不表達(dá)內(nèi)源低親和力Fe Y R基因的免疫細(xì)胞的遺傳修飾的小鼠。背景Fe受體(FcR)是在哺乳動物的進(jìn)行免疫系統(tǒng)的多種功能的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的表面上發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。FcR以多種類型存在于多種細(xì)胞上，并且介導(dǎo)多種免疫功能，例如結(jié)合附著至被感染的細(xì)胞或侵襲性病原體的抗體、刺激吞噬細(xì)胞或細(xì)胞毒性細(xì)胞以通過抗體介導(dǎo)的吞噬作用或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)破壞微生物或感染的細(xì)胞。
ADCC是這樣的過程免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞裂解被抗體結(jié)合的靶細(xì)胞。該過程依賴于對外源抗原或細(xì)胞的先行接觸，從而產(chǎn)生抗體應(yīng)答。ADCC可通過效應(yīng)細(xì)胞例如天然殺傷(NK)細(xì)胞，通過效應(yīng)細(xì)胞表面上表達(dá)的FcR對本身結(jié)合至外源抗原或細(xì)胞的抗體的Fe部分的結(jié)合來介導(dǎo)。由于FcR在免疫應(yīng)答中起著中心作用，因此需要有共表達(dá)多種人FcR的有用的非人動物，包括共表達(dá)多種人低親和力FcR的非人動物。存在對用于研究和闡明人疾病治療(特別是抗腫瘤治療和用于治療自身免疫疾病的治療)和藥物開發(fā)(特別是在人抗體藥劑的開發(fā)、設(shè)計和測試中)的人FcR功能和人的ADCC過程的非人動物模型。附圖
概述圖I是小鼠的野生型低未和力Fe Y R基因座的不意圖，顯不了小鼠Fe Y RIIB，F(xiàn)e Y RIV和Fe Y RIII基因以及用于這些基因的靶向缺失的小鼠Fe Y R靶向載體，其包括側(cè)翼連接有位點特異性重組位點的新霉素盒。圖2顯示了就B細(xì)胞(抗-⑶19)，NK細(xì)胞(抗_NKp46)和巨噬細(xì)胞(抗-F4/80)門控的脾細(xì)胞的直方圖，包括野生型和低親和力FcYRa鏈基因缺陷型小鼠(mFcYR K0)的內(nèi)源mFc YRII和mFc YRIII基因的表達(dá)。圖3A-3D顯示了在人源化⑶20小鼠(h⑶20)和培育成Fe Y R敲除小鼠的人源化
0)20小鼠(hQ)20/Fc Y R K0)中在幾個淋巴細(xì)胞區(qū)室(lymphocyte compartment):骨髓(圖3A)、血液(圖3B)、淋巴結(jié)(圖3C)和脾(圖3D)中利用具有小鼠Fe (Ab 168)或人Fe (Ab735)的人抗-人CD20抗體對B細(xì)胞進(jìn)行的體內(nèi)耗盡。對于每一個圖，y_軸顯示門控的B細(xì)胞(B220+/IgM+或B220+/CD19+)的百分比，x_軸顯示每一個動物組的抗體劑量10mg/kg對照抗體(C), 2mg/kg人抗-人0)20抗體(2Ab和10mg/kg人抗-人0)20抗體(IOAb)。圖4是低親和力小鼠Fe Y R基因座的新霉素靶向缺失和用于將兩個人低親和力Fe Y R基因插入缺失的小鼠基因座的第二靶向載體的示意性描述，所述第二靶向載體包括側(cè)翼連接有位點特異性重組位點的潮霉素盒。為了在血小板上表達(dá)hFc Y RIIA,使用了可操作地連接于人Fe Y RIIIA-IIA靶向載體的hFc Y RIIA基因的延長的啟動子區(qū)域；為了阻止在血小板上表達(dá)hFc Y RIIA，刪除或?qū)嵸|(zhì)上刪除所述啟動子區(qū)域。
圖5A顯示針對NK細(xì)胞(抗-NKp46和巨噬細(xì)胞(抗-F4/80)的門控的脾細(xì)胞的直方圖，包括野生型和人Fe Y RIIIA-IIA純合子小鼠(人FcyRIIIA/FcyRIIA HO)的人FcyRIIIA的表達(dá)。圖5B顯示針對嗜中性粒細(xì)胞(抗_Ly6G)和巨噬細(xì)胞(抗-F4/80)的門控的脾細(xì)胞的直方圖，包括野生型和人Fe Y RIIIA-IIA純合子小鼠(人Fe yRIIIA/Fc YRIIA HO)的AFcyRIIA的表達(dá)。圖6為包括兩個低親和力人Fe Y R基因(hFc Y RIIIA和hFc Y RIIA)的插入的低親和力小鼠Fe Y R基因座的潮霉素靶向缺失以及用于插入3個額外的低親和力人Fe Y R基因(hFc Y RIIB、hFc Y RIIIB和hFc y RIIC)的第三靶向載體和側(cè)翼連接有位點特異性重組位點的新霉素盒的不意圖。圖7顯示針對B細(xì)胞(抗-CD19)和嗜中性粒細(xì)胞(抗_Ly6G)的門控的脾細(xì)胞的直方圖，包括野生型和人Fe Y RmA-IIlB-IIA-IIB-IIC純合子小鼠(人Fe Y RIIIA/Fe Y RIIIB/Fc y RIIA/Fc y RIIB/Fc y RIIC HO)的人 Fe y RIIB 和人 Fe y RIIIB 的表達(dá)。 概述提供了遺傳修飾的細(xì)胞、非人胚胎、非人動物以及用于產(chǎn)生和使用它們的方法和組合物。在不同的方面，非人動物包含人Fe Y R受體、內(nèi)源低親和力Fe Y R受體的缺失和/或人Fe Y R受體在內(nèi)源小鼠低親和力Fe Y R基因座上對內(nèi)源Fe Y R受體的替代。在一個方面，提供了包含功能性FcR Y鏈的遺傳修飾的細(xì)胞、非人胚胎和非人動物，其中所述細(xì)胞、胚胎和動物包含進(jìn)一步修飾，包括用一個或多個低親和力人Fe Y R基因序列(例如，選 S Fcy RIIA, Fe y RIIB、Fe y RIIC、Fe y RIIIA、Fe y RIIIB 及其組合)對低親和力內(nèi)源非人Fe Y R基因序列(例如，F(xiàn)e Y RIIB、Fe Y RIV和FcyRIII)的替代。在一個實施方案中，細(xì)胞、非人胚胎和非人動物為鼠。在一個實施方案中，功能性FcRy鏈為小鼠FcRy鏈。在一個實施方案中，小鼠FcR Y鏈為對于小鼠、細(xì)胞或胚胎而言是內(nèi)源性的FcR Y鏈。在一個實施方案中，細(xì)胞、胚胎和動物為小鼠，并且小鼠表達(dá)人低親和力Fe YR受體的功能性α鏈和功能性內(nèi)源小鼠Y鏈。在一個方面，提供了遺傳修飾的小鼠，其中小鼠不表達(dá)選自Fe YRIIBa鏈、FcyRIVa鏈、FcYRIIIa鏈及其組合的內(nèi)源α鏈；其中小鼠表達(dá)功能性內(nèi)源小鼠Y鏈。在具體的實施方案中，小鼠不表達(dá)功能性Fe Y RIIB α鏈，不表達(dá)功能性FcyRIVa鏈，并且不表達(dá)功能性Fe Y RIII α鏈。在一個實施方案中，小鼠基因組包含內(nèi)源FcYRIIBa鏈的缺失、內(nèi)源Fe Y RIV a鏈的缺失和內(nèi)源Fe Y RIII α鏈的缺失。在一個實施方案中，小鼠包括內(nèi)源Fe YRIIBa鏈的缺失、內(nèi)源Fe Y RIV α鏈的缺失和內(nèi)源Fe YRIII α鏈的缺失，并且還包括與野生型小鼠對于相同抗原的能力相比較減小的對抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力。在一個實施方案中，減小的免疫應(yīng)答包括減小的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。在一個實施方案中，減小的免疫應(yīng)答包括在細(xì)胞殺傷測定中減小的實現(xiàn)抗體依賴性NK細(xì)胞殺傷的能力。在具體的實施方案中，ADCC或抗體依賴性NK細(xì)胞殺傷的減小為至少50%，在一個實施方案中是至少75%，在一個實施方案中是至少90%。
在一個實施方案中，小鼠包含內(nèi)源Fe Y RIIBa鏈的缺失、內(nèi)源Fe Y RIV α鏈的缺失和內(nèi)源Fe Y RIII α鏈的缺失，以及還包括在用抗原免疫后與野生型小鼠例如不包含缺失的相同或相似品系的小鼠相比較，增強(qiáng)的體液抗體應(yīng)答。在一個實施方案中，增強(qiáng)的體液抗體應(yīng)答為野生型小鼠的2倍。在一個實施方案中，增強(qiáng)的體液抗體應(yīng)答為野生型小鼠的3倍。在一個實施方案中，增強(qiáng)的體液抗體應(yīng)答為野生型小鼠的5倍。在一個實施方案中，增強(qiáng)的體液抗體應(yīng)答為野生型小鼠的7倍。在一個實施方案中，增強(qiáng)的體液抗體應(yīng)答為野生型小鼠的10倍。在具體的實施方案中，體液抗體應(yīng)答通過每微克小鼠的血清蛋白特異性結(jié)合抗原(已用其免疫小鼠的)的抗體的微克數(shù)來測量。在一個實施方案中，增強(qiáng)的體液抗體應(yīng)答是就野生型小鼠對其展示耐受性的抗原或野生型小鼠對其展示較弱或最小的體液免疫應(yīng)答的抗原而言的。在具體的實施方案中，抗原是小鼠抗原。在具體的實施方案中，抗原是展示與小鼠蛋白具有至少約95%、96%、97%、98%或99%的同一性的人抗原。 在一個方面，提供了包含低親和力人Fe Y Ra鏈基因?qū)Φ陀H和力小鼠Fe Y Rα鏈基因的替代的遺傳修飾的小鼠，其中所述替代在內(nèi)源小鼠Fe YRa鏈基因基因座上。在一個實施方案中，低親和力小鼠Fe Y Ra鏈基因選自Fe Y RIIB、Fe Y RIV和Fe Y RIII α鏈基因。在具體的實施方案中，提供了遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠表達(dá)內(nèi)源FcRy鏈，并且其中低親和力人FcYRa鏈基因為FcYRIIIAa鏈。在另一個具體的實施方案中，遺傳修飾的小鼠在NK細(xì)胞上表達(dá)內(nèi)源FcR Y鏈和功能性人Fe Y RIIIA α鏈。在具體的實施方案中，NK細(xì)胞上的Fe Y RIIIA α鏈的功能性反映在人抗體介導(dǎo)的NK殺傷(例如，由人抗體介導(dǎo)的ADCC)。在一個方面，提供了遺傳修飾的細(xì)胞、非人胚胎或非人動物，其中所述遺傳修飾包括人FcYRa鏈基因?qū)χ辽僖粋€內(nèi)源低親和力Fe Y Ra鏈基因的替代，并且所述細(xì)胞、胚胎或動物表達(dá)功能性FcR Y鏈。在一個實施方案中，功能性FcRy鏈為內(nèi)源FcR Y鏈。在一個實施方案中，低親和力人Fe YRa鏈基因選自Fe YRIIAa鏈基因、Fe YRIIIAa鏈基因及其組合。在具體的實施方案中，人FcyRIIA基因包含多態(tài)性，其中多態(tài)性選自131His低應(yīng)答者多態(tài)性和131Arg高應(yīng)答者多態(tài)性。在具體的實施方案中，F(xiàn)e YRIIA多態(tài)性為131His低應(yīng)答者多態(tài)性。在一個實施方案中，F(xiàn)e Y RIIIA基因為特定等位基因變體，其中等位基因變體選自158Val變體和158Phe變體。在具體的實施方案中，F(xiàn)e Y RIIIA等位基因變體為158Val 變體。在一個實施方案中，低親和力人Fe YR基因選自Fe yRIIB、FcyRIIC, FcyRIIIB基因及其組合。在具體的實施方案中，人Fe Y RIIB基因包含氨基酸置換，其中所述置換選自232Ile或232Thr置換。在另一個具體的實施方案中，氨基酸置換為232Ile置換。在具體的實施方案中，F(xiàn)e Y RIIIB基因為特定等位基因變體，其中所述等位基因變體選自NAl變體和NA2變體。在另一個具體的實施方案中，F(xiàn)e Y RIIIB等位基因變體為NA2變體。在一個實施方案中，低親和力人FcyRa鏈基因選自Fe Y RIIA、Fe Y RIIB、Fe Y RIIC、Fe Y RIIIA、FcyRIIIBa 鏈基因及其組合。在一個實施方案中，低親和力小鼠Fe YRIVa鏈基因和Fe Y RIII α鏈基因被至少一個低親和力人Fe YRa鏈基因替代。在一個實施方案中，低親和力小鼠Fe YRIVa鏈基因和Fe Y RIIB α鏈基因被至少一個低親和力人Fe Y R α鏈基因替代。在一個實施方案中，低親和力小鼠Fe YRIIBa鏈基因和Fe Y RIII α鏈基因被至少一個低親和力人Fe Y R a鏈基因替代。在具體的實施方案中，至少一個低親和力人FcYRa鏈基因選自FcyRIIA、Fe Y RIIB,Fe y RIIC.Fc y RIIIA.Fc y RIIIB a鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，至少一個低親和力人Fe YRa鏈基因選自FcyRIIAa鏈基因、FcyRIIIAa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，至少一個低親和力人Fe Y R α鏈基因選自Fe Y RIIB、FcyRIIC, FcyRIIIBa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，低親和力小鼠Fe Y R基因被人Fe Y RIIA α鏈基因和人Fe Y RIIIA α鏈基因替代。在另一個具體的實施方案中，低親和力人Fe Y RIIA和Fe YRIIIAa鏈基因包含變體，其中Fe Y RIIA α鏈基因包含131把8變體并且？(￥1 11從(1鏈基因包含158Val變體。在另一個具體的實施方案中，低親和力小鼠Fe YRa鏈基因被下列低親和力人Fe YRa鏈基因替代Fe Y RIIB、Fe Y RIIC和FcyRIIIB0在另一個具體的實施方案中，低親和力人Fe Y RIIB α鏈基因和Fe Y RIIIB a鏈基因包含變體，其中Fe YRIIBa鏈基因包含232Ile變體并且Fe Y RIIIB α鏈基因包含NA2變體。在一個實施方案中，遺傳修飾包括小鼠和人染色體I的共線(syntenic)基因組序列的替代。在具體的實施方案中，遺傳修飾包括包含低親和力人Fe Y R基因的基因組片段對包含內(nèi)源低親和力小鼠Fe Y R基因的基因組片段的替代。在另一個具體的實施方案中，來自染色體1:172，889，983至染色體1:172，989，911的小鼠基因組被包含人染色體
I 161，474，729至染色體1:161，620，458的人基因組片段替代。在一個方面，提供了遺傳修飾的細(xì)胞、非人胚胎或非人動物，其中遺傳修飾包括一個或多個內(nèi)源低親和力受體α鏈基因的敲除、包含一個或多個人Fe Y Ra鏈基因的附加體的存在。在具體的實施方案中，所述細(xì)胞、胚胎或動物表達(dá)功能性FcR Y鏈。在具體的實施方案中，附加體為微小染色體。在一個實施方案中，功能性FcRy鏈對于所述細(xì)胞、胚胎或動物是內(nèi)源的。在一個方面，提供了遺傳修飾的小鼠，包括用低親和力人Fe Y Ra鏈基因替代低親和力小鼠Fe Y Ra鏈基因，小鼠包含小鼠FcRy鏈基因，并且小鼠表達(dá)功能性人低親和力Fe Y R受體。在一個實施方案中，功能性低親和力Fe Y R受體在其中低親和力Fe YR受體在人中表達(dá)的細(xì)胞類型上表達(dá)。在具體的實施方案中，功能性人低親和力Fe Y R受體為Fe YRIIIA并且Fe Y RIIIA在NK細(xì)胞上表達(dá)。在一個實施方案中，小鼠包含兩個小鼠Fe YRa鏈基因的缺失。在另一個實施方案中，小鼠包含3個小鼠Fe Y R α鏈基因的缺失。在一個實施方案中，小鼠包括用至少I個人Fe YRa鏈基因?qū)?個小鼠Fe Y R a 鏈基因的替代。在另一個實施方案中，小鼠包括用至少I個FcYRa鏈基因?qū)?個小鼠FcyRa鏈基因的替代。在具體的實施方案中，小鼠包括用至少2個人Fe Y Ra鏈基因?qū)?個小鼠Fe YRa鏈基因的替代。在另一個具體的實施方案中，用3個人Fe Y Ra鏈基因替代3個小鼠Fe Y Ra鏈基因。在另一個具體的實施方案中，小鼠包括用至少2個人Fe Y Ra鏈基因?qū)?個小鼠Fe YRa鏈基因的替代。在另一個具體的實施方案中，用至少3個人FcyRa鏈基因替代2個小鼠Fe Y Ra鏈基因。在一個實施方案中，低親和力小鼠FcyRa鏈基因選自Fe Y RIIB、Fe Y RIV、FcyRIIIa鏈基因及其組合。在一個實施方案中，低親和力人FcyRa鏈基因選自Fe Y RIIA、Fe Y RIIB、Fe y RIIC, Fe y RIIIA, Fe y RIIIB α鏈基因及其組合。在一個實施方案中，低親和力人FcyRa鏈基因選自Fe Y RIIA、FeyRIII冬(X鏈基因及其組合。在一個實施方案中，低親和力人Fe YRa鏈基因選自Fe YRIIB，F(xiàn)c YRIIC、Fc YRIIIBa鏈基因及其組合。在一個實施方案中，用至少I個人Fe YRa鏈基因替代低親和力小鼠Fe Y RIV a鏈基因和Fe Y RIII α鏈基因。在一個實施方案中，用至少I個人Fe Y Ra鏈基因替代低親和力小鼠Fe Y RIV α鏈基因和Fe Y RIIB α鏈基因。在一個實施方案中，用至少I個人FcyRa鏈基因替代低親和力小鼠Fe YRIIBa鏈基因和Fe Y RIIIB α鏈基因。在具體的實施方案中，至少I個人Fe YRa鏈基因選自Fe yRIIA、Fc yRIIB、Fc yRIIC、Fc YRIIIA、FcyRIIIBa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，至少I個人Fe Y R α鏈基因選自Fe Y RIIA、FcYRIIIAa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，至少I個人FcyRa鏈基因選自Fe YRIIB、Fc YRIIC、Fc YRIIIBa鏈基因及其組合。在另一個具體的實施方案中，用下列人FcYRa鏈基因=FcyRIIA和Fe Y RIIIA替代小鼠α鏈基因。在另一個具體的實施方案中，用下列人Fe YRa鏈基因？0^1 118、？(3￥1 11(和？(3￥1 1118替代小鼠α鏈基因。 在一個方面，提供了包含低親和力人Fe Y Ra鏈和小鼠FcRy鏈亞基的遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠在選自嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板、朗格漢斯細(xì)胞、樹突細(xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞及其組合的細(xì)胞上表達(dá)人FcYRa鏈。在一個實施方案中，小鼠在選自嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、血小板、樹突細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞及其組合的細(xì)胞上表達(dá)人Fe Y RIIA a
鏈。在一個實施方案中，小鼠能夠進(jìn)行通過表達(dá)的人FcyRIlAa鏈起始或介導(dǎo)的吞噬作用、ADCC和細(xì)胞活化。在一個實施方案中，小鼠表達(dá)在選自巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、至少一種T細(xì)胞類型及其組合的細(xì)胞上表達(dá)人Fe Y RIIIA α鏈。在一個實施方案中，小鼠能夠進(jìn)行通過在NK細(xì)胞上表達(dá)的人FcyRin^a鏈介導(dǎo)的ADCC。在具體的實施方案中，小鼠展示響應(yīng)于包含人Fe的抗體的hFc Y RIIIA-介導(dǎo)的 ADCC。在一個實施方案中，小鼠表達(dá)人Fe YRIIAa鏈和人FcyRIIIAa鏈。在一個實施方案中，人Fe YRIIAa鏈在血小板上表達(dá)并且人Fe Y RIIIA α鏈在NK細(xì)胞上表達(dá)。在一個實施方案中，小鼠能夠進(jìn)行由包含人Fe的抗體介導(dǎo)的ADCC，其中所述介導(dǎo)通過在輔助細(xì)胞表面上表達(dá)的人Fe Y RIIA α鏈或人Fe Y RIIIA α鏈來進(jìn)行。在一個實施方案中，人FcyRIIAa鏈不在血小板上表達(dá)。在其中人Fe Y RIIA α鏈不在血小板上表達(dá)的具體實施方案中，小鼠缺失或?qū)嵸|(zhì)上缺失可操作地連接于人基因組中的人Fe Y RIIAa鏈的人啟動子序列。在一個實施方案中，小鼠在選自B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞及其組合的細(xì)胞上表達(dá)人Fe Y RIIB a鏈。在具體的實施方案中，小鼠在B細(xì)胞和肥大細(xì)胞上表達(dá)人Fe Y RIIB α鏈。在另一個具體的實施方案中，小鼠能夠進(jìn)行通過表達(dá)的人Fe Y RIIB α鏈介導(dǎo)的免疫復(fù)合物的吞噬作用。在一個實施方案中，小鼠在選自嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、血小板、樹突細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞及其組合的細(xì)胞上表達(dá)人Fe Y RIIC α鏈。在具體的實施方案中，小鼠能夠進(jìn)行通過表達(dá)的人Fe YRIICa鏈啟始的吞噬作用、ADCC和細(xì)胞活化。在一個實施方案中，小鼠在嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞上表達(dá)人FcyRinpa鏈。在具體的實施方案中，小鼠能夠進(jìn)行細(xì)胞活化、吞噬作用、ADCC和脫粒，其中活化、吞噬作用、ADCC和脫粒通過表達(dá)的人FcyRI丨丨Pa鏈介導(dǎo)。在一個方面，提供了包含內(nèi)源FcyRIIB、FcyRIV和FcyRIII基因的缺失和人Fe Y RIIA、Fe Y RIIB、Fe Y RI 1C、Fe Y RIIIA和Fe y RIIIB基因的插入的小鼠，其中所述小鼠包含功能性小鼠FcR Y鏈基因。在一個實施方案中，小鼠包含由內(nèi)源Fe Y RIIB、Fe Y RIV和Fe Y RIII基因編碼的α 鏈的缺失和由人 Fe Y RIIA,Fe Y RIIB、Fc Y RIIC,Fe Y RIIIA 和 Fe Y RIIIB 基因編碼的 a鏈的插入。在一個實施方案中，人？(^1 1從、？(^1 118、？(^1 11(、？(^1 11從和Fe Y RII IBa鏈基因的插入位于小鼠基因組的隨機(jī)位置。 在一個實施方案中，人？(^1 1從、？(^1 118、？(^1 11(、？(^1 11從和Fe Y RIIIBa鏈基因的插入位于內(nèi)源小鼠低親和力Fe Y Ra鏈基因座。在一個實施方案中，小鼠在NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)人Fe Y RIIIA。在具體的實施方案中，來自小鼠的脾細(xì)胞樣品的所有或大體上所有NK細(xì)胞表達(dá)人Fe Y RIIIA。在具體的實施方案中，來自小鼠的脾細(xì)胞樣品的所有或大體上所有巨噬細(xì)胞表達(dá)人Fe Y RIIIA0在一個實施方案中，小鼠在選自嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其組合的細(xì)胞類型上表達(dá)選自人Fe Y RIIA、人Fe YRIIIA及其組合的人Fe y R0在具體的實施方案中，小鼠在小鼠的脾細(xì)胞樣品的全部或大體上全部嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)人Fe Y RIIA和人
Fe Y RIIIAo在一個實施方案中，小鼠在來自小鼠的B細(xì)胞門控的脾細(xì)胞樣品的B細(xì)胞和B細(xì)胞的嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)人Fe Y RIIB和人Fe Y RIIIB0在具體的實施方案中，小鼠在來自小鼠的B細(xì)胞門控的脾細(xì)胞樣品的全部或大體上全部B細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)Fe Y RIIIB 和 Fe Y RIIB0在一個實施方案中，小鼠還包含人源化⑶20基因。在一個實施方案中，還包含人源化CD20基因的小鼠在用包含F(xiàn)e的抗-CD20結(jié)合蛋白處理后展示B細(xì)胞的(體內(nèi))耗盡。在一個實施方案中，所述耗盡存在于選自骨髓、血液、淋巴結(jié)、脾及其組合的區(qū)室中。在一個實施方案中，F(xiàn)e為人Fe。在一個實施方案中，F(xiàn)e為小鼠Fe。在一個實施方案中，抗-CD20結(jié)合蛋白為抗-CD20抗體。在一個方面，提供了包含本文中描述的遺傳修飾的細(xì)胞。在一個實施方案中，所述細(xì)胞選自胚胎干細(xì)胞(ES)、多能細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能細(xì)胞和全能細(xì)胞。在一個實施方案中，細(xì)胞選自小鼠細(xì)胞和大鼠細(xì)胞。在具體的實施方案中，細(xì)胞為ES細(xì)胞。在更具體的實施方案中，細(xì)胞為小鼠ES細(xì)胞。在一個方面，提供了包含本文中描述的遺傳修飾的非人胚胎。在一個實施方案中，非人胚胎選自小鼠胚胎和大鼠胚胎。在一個方面，提供了測定治療劑的功效的方法。在一個實施方案中，治療劑為包含人Fe的抗體(例如，單、雙、三、多特異性的)。在一個實施方案中，治療劑為人抗體。在一個實施方案中，功效為治療劑介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷(例如，ADCC)的功效。在具體的實施方案中，人治療劑是包含人免疫球蛋白重鏈的Fe的融合蛋白。在一個實施方案中，給本文中描述的小鼠施用治療劑并且測量治療劑依賴性ADCC的水平。在一個實施方案中，通過給小鼠施用治療劑，隨后檢測(例如，從獲自動物的樣品(例如，血液)進(jìn)行體外檢測)治療劑對表達(dá)FcyR的細(xì)胞上的人低親和力Fe Y R的結(jié)合來將小鼠用于評估治療劑的ADCC活性。在具體的實施方案中，從小鼠分離小鼠的輔助細(xì)胞，并且測試其在治療劑存在和不存在的情況下介導(dǎo)治療劑依賴性ADCC的能力。在一個方面，提供了用于確定低親和力Fe Y R是否與人疾病或障礙相關(guān)的方法，包括測定根據(jù)本發(fā)明的小鼠的與人疾病或障礙相關(guān)的性狀的步驟。在一個實施方案中，所述性狀為與一個或多個低親和力Fe Y R的功能的不存在或喪失相關(guān)的表型。在具體的實施 方案中，疾病或障礙為自身免疫疾病或障礙。在具體的實施方案中，自身免疫疾病或障礙選自類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、I型糖尿病、Guillain-Barre綜合征、硬化癥、多發(fā)性硬化、Goodpasture’ s綜合征、Wegener’ s肉芽腫病和實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)。在具體的實施方案中，小鼠包含低親和力Fe Y R中的多態(tài)性，并且性狀選自與大部分不具有多態(tài)性的人群相比較增強(qiáng)的介導(dǎo)ADCC的能力以及與大部分不具有多態(tài)性的人群相比較減小的介導(dǎo)ADCC的能力。在一個方面，提供了用于在小鼠中產(chǎn)生抗-人FcRa鏈抗體的方法，包括將根據(jù)本發(fā)明的小鼠與本文中描述的人FcR接觸。在一個實施方案中，識別人的FcR的抗體分離自小鼠。在另一個實施方案中，鑒定和克隆了編碼識別人FcR的抗體的全部或部分可變區(qū)的核酸序列。在一個方面，提供了用于測定抗-人FcR抗體將分子靶向表達(dá)FcR的細(xì)胞以吞噬靶分子的能力的方法，包括將本文中描述的小鼠與包含抗-人FcR抗體的試劑接觸，并且測量革G分子的吞曬。在一個方面，提供了用于在小鼠中產(chǎn)生針對抗原的抗體的方法，所述抗原在對于一種或多種Fe Y R為野生型的小鼠中具有差的免疫原性，所述方法包括將本文中描述的缺失小鼠低親和力FcR但表達(dá)Fe Y R Y鏈的小鼠與在對于一種或多種Fe Y R為野生型的小鼠中具有差免疫原性的抗原接觸，并鑒定識別所述差抗原性的抗原的抗體。在一個實施方案中，所述方法包括從小鼠分離抗體。在另一個實施方案中，鑒定和克隆了編碼抗體的全部或部分可變區(qū)的核酸序列。在一個方面，提供了用于產(chǎn)生能夠產(chǎn)生包含人可變區(qū)的抗體的小鼠的方法，包括將本文中描述的第一小鼠與第二小鼠交配的步驟，所述第二小鼠包含(a) —個或多個人免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段和一個或多個人恒定區(qū)基因；或(b)可操作地連接于小鼠恒定區(qū)基因的一個或多個人免疫球蛋白可變區(qū)基因區(qū)段，其中所述人基因區(qū)段在小鼠可變區(qū)基因區(qū)段的基因座上替代可變區(qū)基因區(qū)段。在一個實施方案中，第二小鼠(a)包含含有一個或多個人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段和人輕鏈恒定基因的轉(zhuǎn)基因和含有一個或多個人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因區(qū)段和一個或多個人重鏈恒定基因的轉(zhuǎn)基因。在一個實施方案中，包含一個或多個人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因區(qū)段的轉(zhuǎn)基因包兩個或更多個重鏈恒定基因并且能夠進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換(class switching)。在具體的實施方案中，小鼠包含失活的內(nèi)源輕鏈基因座和/或失活的內(nèi)源重鏈基因座。在具體的實施方案中，小鼠包含內(nèi)源輕鏈基因座的缺失和/或內(nèi)源重鏈基因座的缺失。在一個實施方案中，第二小鼠(b)分別在小鼠重鏈和輕鏈基因座上包含人重鏈和人輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段。在一個方面，提供了用于選擇抗腫瘤抗體的方法，包括測定抗體介導(dǎo)ADCC的能力的步驟，其中通過測定由本文中描述的小鼠的細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC來測試抗體介導(dǎo)ADCC的能力，如果抗體利用本文中描述的遺傳修飾的小鼠的細(xì)胞介導(dǎo)ADCC，則選擇該抗體。在具體的實施方案中，測定抗體對遺傳修飾的小鼠的細(xì)胞的結(jié)合，并且就其結(jié)合細(xì)胞上的人Fe Y R的能力選擇抗腫瘤抗體。在具體的實施方案中，人Fe Y R為低親和力Fe Y R0在一個實施方案中，抗腫瘤抗體通過與抗腫瘤抗體通過野生型小鼠的細(xì)胞介導(dǎo)ADCC的能力相比較的增強(qiáng)的通過小鼠的細(xì)胞介導(dǎo)ADCC的能力來進(jìn)行鑒定。在具體的實施方案中，抗腫瘤抗體通過其通過NK細(xì)胞介導(dǎo)ADCC的能力來進(jìn)行鑒定。在具體的實施方案中，所述NK細(xì)胞表達(dá)人Fe Y RIIIA。 在一個實施方案中，提供了用于選擇抗腫瘤試劑的方法，包括給第一非人動物施用包含人Fe或修飾的人Fe的試劑的步驟，其中第一非人動物按照本發(fā)明進(jìn)行了遺傳修飾并且包含人腫瘤；給包含腫瘤的第二非人動物施用試劑的步驟；和測定第一非人動物和第二非人動物在施用試劑后延緩人腫瘤生長的能力，其中如果試劑在第一非人動物中但非在第二非人動物中展示增強(qiáng)的延緩人腫瘤生長的能力，則其被選擇為抗腫瘤試劑。在一個實施方案中，第一非人動物經(jīng)修飾包含內(nèi)源FcRa -亞基的缺失，并且經(jīng)修飾包含選自 Fe YRiiAa -亞基、FcyRIIBa -亞基、-FcyRE^a 亞基、Fe Y RIl IA a -亞基、Fe YRIIIBa-亞基及其組合的人FcR a -亞基。在一個實施方案中，第二動物為野生型動物。在一個實施方案中，第一非人動物表達(dá)內(nèi)源FcRy鏈。在一個實施方案中，第一非人動物表達(dá)功能性內(nèi)源Fe YRI。在一個方面，提供了用于產(chǎn)生小鼠的方法，所述小鼠缺失低親和力小鼠FcY R，表達(dá)功能性 FcR Y 鏈并且包含編碼人Fe Y RIIA,Fe y RIIB、Fc y RIIC,Fe y RIIIA和 Fe y RIIIB的α鏈的基因，包括用人FcYRa鏈在小鼠FcYRa鏈基因座上替代低親和力小鼠FcyRa鏈的步驟。在一個實施方案中，第一步驟包括缺失內(nèi)源Fe Y RIIB、Fe Y RIV和Fe Y RIII基因的α鏈和插入人Fe Y RIIA和Fe Y RIIIA基因的α鏈；第二步驟包括將人Fe Y RIIB、Fe Y RIIC和Fe Y RIIIB基因的α鏈插入由第一步驟產(chǎn)生的小鼠的基因組；其中所述小鼠包含功能性小鼠FcRy鏈基因.在具體的實施方案中，第二步驟的人Fe Y RIIB、FcyRIIC和Fe Y RIIIB基因的α鏈插入在相對于第一步驟的人Fe Y RIIA和Fe Y RIIIA基因的a鏈的5’。在一個方面，提供了用于測定人治療劑在非靈長類動物中的細(xì)胞殺傷的方法，包括將細(xì)胞、非人胚胎或非人動物與包含人Fe的人治療劑接觸的步驟，其中所述細(xì)胞、胚胎或動物包含功能性FcR Y鏈并包含一個或多個人Fe Y Ra鏈對一個或多個內(nèi)源低親和力FcyRa鏈基因的替代，以及測定人治療劑通過細(xì)胞、胚胎或動物的低親和力人Fe Y R介導(dǎo)細(xì)胞殺傷的能力。在一個實施方案中，非靈長類動物為小鼠。在具體的實施方案中，內(nèi)源小鼠Fe y Ra 鏈基因 Fe Y RIIB、Fc Y RIV 和 Fe Y RIII 被人Fe γ Ra 鏈基因 Fe Y RIIA、Fc Y RIIB、Fe y RIIC、Fe y RIIIA 和 Fe y RIIIB 替代。在一個實施方案中，細(xì)胞選自B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞及其組合。在具體的實施方案中，細(xì)胞為NK細(xì)胞并且測定通過人或人源化抗體產(chǎn)生的NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC。在具體的實施方案中，低親和力人FcyR為人Fe Y RIIIA0在一個方面，提供了用于測定治療劑依賴性血栓形成的方法，包括將在血小板上表達(dá)人Fe Y RIIA的第一非人動物與治療劑接觸；將不在血小板上表達(dá)人Fe Y RIIA的第二非人動物與所述治療劑接觸；在第一非人動物和第二非人動物中測量治療劑依賴性血栓形成的量；和測定治療劑依賴性血栓形成的差異。在一個實施方案中，非人動物選自小鼠和大鼠。
在一個實施方案中，將治療劑依賴性血栓形成的測定的差異用于鑒定與向人施用該治療劑相關(guān)的風(fēng)險。在一個實施方案中，測定的差異導(dǎo)致治療劑給有此需要的人患者的施用的改變。發(fā)明詳述本發(fā)明不限于描述的特定方法和實驗條件，因為這樣方法和條件可改變。本文中使用的術(shù)語僅為了描述特定的實施方案，無意起限制作用，因為本發(fā)明的范圍將僅由權(quán)利要求限定。除非另外定義，否則本文中使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于實施或測試本發(fā)明，但現(xiàn)在描述特定的方法和材料。本文中提及的所有出版物通過引用方式全文并入本文。短語“靶向構(gòu)建體”包括含有靶向區(qū)域的多核苷酸分子。靶向區(qū)域包含與靶細(xì)胞、組織或動物中的序列實質(zhì)上同源的序列并且提供了靶向構(gòu)建體至細(xì)胞、組織或動物的基因組內(nèi)的位置的整合。在具體的實施方案中，靶向構(gòu)建體還包括特定目標(biāo)核酸序列或基因、選擇標(biāo)記、控制和/或調(diào)節(jié)序列以及允許通過蛋白質(zhì)的外源添加介導(dǎo)的重組的其它核酸序列，所述蛋白質(zhì)幫助或促進(jìn)牽涉這類序列的重組。在另一個具體的實施方案中，靶向構(gòu)建體還包含目標(biāo)基因，其中所述目標(biāo)基因為編碼與由內(nèi)源序列編碼的蛋白質(zhì)具有相似功能的蛋白質(zhì)的異源基因。除非另外明確地指出，否則術(shù)語“替代”包括其中將DNA序列以這樣的方式置于細(xì)胞的基因組內(nèi)用異源序列(例如，小鼠中的人序列)在基因組序列的基因座上替代基因組中的序列。這樣放置的DNA序列可包括作為用于獲得這樣放置的序列的源DNA的一部分的一個或多個調(diào)控序列(例如，啟動子、增強(qiáng)子、5’-或3’-非翻譯區(qū)等)。例如，在不同的實施方案中，替代是異源序列對內(nèi)源序列的置換，該置換導(dǎo)致基因產(chǎn)物從這樣放置的DNA序列(包括異源序列)產(chǎn)生，但不表達(dá)內(nèi)源序列；替代是用DNA序列置換內(nèi)源基因組序列，所述DNA序列編碼具有與內(nèi)源基因組序列編碼的蛋白質(zhì)相似的功能的蛋白質(zhì)(例如，內(nèi)源基因組序列編碼低親和力小鼠Fe Y R受體，DNA片段編碼一種或多種人低親和力Fe Y R受體，例如 Fe Y RIIC 和 / 或 Fe Y RIIIB)。術(shù)語“Fe Y R”包括Fe、例如IgG免疫球蛋白的Fe部分的受體。Fe Y R基因包括α鏈，所述α鏈在細(xì)胞表面上表達(dá)并且用作配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并與FcR Y鏈的同二聚體或FcRy鏈與δ鏈的異二聚體結(jié)合。存在幾種不同的FcyR基因并且可根據(jù)在免疫復(fù)合物中與IgG的優(yōu)先結(jié)合將它們分成低親和力和高親和力類型。人的低親和力Fe Y R基因包括Fe Y RIIA,Fe Y RIIB、Fc y RIIC,Fe y RIIIA和Fe y RIIIB,并且已在患有自身免疫疾病的人受試者中描述了在大多數(shù)此類基因內(nèi)天然存在的遺傳差異或多態(tài)性。在閱讀本公開內(nèi)容后本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到基因組中的一個或多個內(nèi)源低親和力Fe Y R基因(或全部)可被一個或多個異源低親和力Fe Y R基因(例如，變體或多態(tài)性例如等位基因形式、來自另一物種的基因、嵌合形式等)替代。術(shù)語“等位基因變體”包括基因的正常序列的變異，其導(dǎo)致同一基因的一系列不同形式。所述不同形式可在來自基因的蛋白質(zhì)序列中包含至多20個氨基酸的差異。例如，等位基因可被理解為相同物理基因基因座上的可選擇的DNA序列，其可以導(dǎo)致或可以不導(dǎo)致不同的性狀(例如，可遺傳的表型特征)、例如對某些疾病或病況的易感性，其不導(dǎo)致相同基因的其它等位基因或在不同程度上導(dǎo)致其它等位基因。
“輔助細(xì)胞”包括參與免疫應(yīng)答的效應(yīng)子功能的免疫細(xì)胞。示例性免疫細(xì)胞包括淋巴樣或骨髓樣來源的細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、血小板、郎格漢斯細(xì)胞、樹突細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。輔助細(xì)胞通過在它們的表面上表達(dá)的受體例如FcR進(jìn)行免疫系統(tǒng)的特定功能。在具體的實施方案中，輔助細(xì)胞能夠觸發(fā)通過在細(xì)胞表面上表達(dá)的FcR例如低親和力Fe Y R介導(dǎo)的ADCC。例如，表達(dá)FcR的巨噬細(xì)胞參與吞噬作用和破壞抗體包被的細(xì)菌。輔助細(xì)胞還可能能夠釋放介導(dǎo)其它免疫過程的試劑。例如，肥大細(xì)胞可被結(jié)合至FcR的抗體激活以在感染的部位釋放顆粒例如炎癥分子(例如，細(xì)胞因子)。在不同的其它實施方案中，F(xiàn)cR在輔助細(xì)胞上的表達(dá)可受其它因子(例如，細(xì)胞因子)調(diào)節(jié)。例如，F(xiàn)e Y RI和Fe Y RIII表達(dá)可通過利用干擾素-Y (IFN- Y )的刺激誘導(dǎo)。小鼠和人FcR免疫球蛋白的Fe區(qū)(即，恒定區(qū))的受體(FcR)在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著重要作用。FcR存在于宿主免疫系統(tǒng)的輔助細(xì)胞上以有效地除去被抗體結(jié)合的外源抗原。FcR也在平衡免疫系統(tǒng)的輔助細(xì)胞的激活和抑制應(yīng)答中起著重要作用。FcR參與巨噬細(xì)胞的吞噬作用、肥大細(xì)胞的脫粒、抗體-抗原復(fù)合物的攝取和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)以及其它免疫系統(tǒng)過程。在小鼠和人中，不同的FcR在不同輔助細(xì)胞的表面上差異性表達(dá)，所述輔助細(xì)胞各自對于存在于表達(dá)的抗體庫中的免疫球蛋白同種型是特異性的。例如，免疫球蛋白G(IgG)抗體通過IgG受體(Fe Y R)介導(dǎo)效應(yīng)子功能。FcyR已被分成3類高親和力激活性Fe Y RI (CD64)、低親和力抑制性FcyRII (CD32)和低親和力激活性FcyRIII (CD16)。雖然每一類都存在于小鼠和人中，但它們所存在于的免疫細(xì)胞的同種型和亞組的數(shù)目不同。例如，F(xiàn)e Y RIIA和Fe Y RIIIB在人的輔助細(xì)胞上表達(dá)但據(jù)報道不存在于小鼠中。此外，不同IgG同種型(例如，IgGl)對每一種Fe Y R的親和力在人和小鼠中不同。通過Fe Y R的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活或抑制和與抗體對Fe Y R的結(jié)合相關(guān)的效應(yīng)子功能據(jù)認(rèn)為由Fe Y R的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的特定序列基序或共受體(co-receptor)的亞基的特定序列基序介導(dǎo)。激活受體最常見地與包含免疫受體基于酪氨酸活化基序(ITAM)的常見Y鏈(FcRy鏈)相關(guān)。ITAM包含約9-12個氨基酸的特定序列，該序列包括響應(yīng)于抗體對FcR的結(jié)合而被磷酸化的酪氨酸殘基。磷酸化導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。已報道了缺失編碼FcR Y鏈的基因的小鼠(FcRy鏈KO)(例如，參見Takai等人(1994)FcR Y chainDepletion Results in Pleiotrophic Effector Cell Defects, Cell 76:519-529;vanVugt 等人(1996)FcR y-chain Is Essential for Both Surface Expression andFunction of Human Fe γ RI (CD64) In Vivo, Blood 87 (9) : 3593-3599 ;和 Park 等人(1998)Resistance of Fe Receptor-deficient Mice to Fatal Glomerulonephritis, J. Clin.Invest. 102(6) :1229-1238) 0 FcRy鏈據(jù)報道為大多數(shù)FcR的正確表面表達(dá)和功能(例如，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、吞噬作用等)所必需的；根據(jù)一些報道FcRy鏈KO小鼠缺失FcyRI。然而，其它報道顯示FcR Y鏈KO小鼠確實在某些輔助細(xì)胞的表面上表達(dá)Fe Y RI，并且表達(dá)的Fe Y RI據(jù)報道顯示具有功能，功能在于其在表達(dá)的FcR Y鏈不存在的情況下在小鼠中結(jié)合 IgG (Barnes 等人(2002) Fe Y RI-Deficient Mice Show Multiple Alterations toInflammatory and Immune Responses, Immunity 16:379-389)。相反地，F(xiàn)e y RIIB是在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的抑制性受體。與ITAM—樣，ITIM是包含可磷酸化的酪氨酸殘基的序列基序。然 而，在ITM的磷酸化后的下游事件導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能的抑制而非激活。Fe Y RIIB缺陷型小鼠據(jù)報道展示與野生型小鼠相比較增強(qiáng)的抗體應(yīng)答(Takai等人(1996) Augmented humoraland anaphylactic responses in FcgRII-deficient mice, Nature379:346-349),此為支持Fe y RIIB作為B細(xì)胞抗體應(yīng)答的下游調(diào)節(jié)劑的觀察。在人中，F(xiàn)cyRIIA,FcyRIIB, FcyRIIC, Fe Y RIIIA 和 Fe Y RIIIB 被認(rèn)為是經(jīng)典低親和力Fe YR基因并且一起位于相同染色體上(Su等人(2002)Genomic organizationof classical human low-affinity Fe y receptor genes, Genes and Immunity 3 (Supple
I): S51-S56)。這些基因展示出幾個與獨特表型例如受體的配體結(jié)合和功能的改變相關(guān)的多態(tài)性。一些多態(tài)性與自身免疫疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)和多發(fā)性硬化(MS)相關(guān)。針對不同的人FcyRQiFcyR)的轉(zhuǎn)基因小鼠已被開發(fā)并且用作疾病模型、產(chǎn)生高親和力抗體、測試治療性抗體引發(fā)特異性細(xì)胞應(yīng)答的能力、篩選緩解異常免疫應(yīng)答的化合物(例如，參見Heijnen等人(1996)A Human FcgRI/CD64Transgenic Model for InVivo Analysis of(Bispecific)Antibody Therapeutics, J.Hematother. 4:351-356;Heijnen 和 van de Winkel(1996)Antigen Targeting toMyeloid-specific Human FcgRI/CD64 Triggers Enhanced antibody Responses inTransgenic, J. Clin. Invest. 97(2) :331-338;美國專利 No. 6，111，166、6，676，927、7，351，875,7, 402，728 和 7，416，726)。盡管FcR在提供免疫系統(tǒng)的抗體與輔助細(xì)胞之間的橋梁中起著重要作用，但目前仍然不存在其中所有低親和力hFc Y R都表達(dá)的模型系統(tǒng)。其中所有低親和力hFc Y R共表達(dá)的小鼠(包括缺失內(nèi)源小鼠Fe YR的小鼠)在不同的實施方案中可用于精確地反映人抗體治療劑的效應(yīng)，包括ADCC介導(dǎo)的效應(yīng)。這樣的小鼠可在用于治療人疾病例如RA、I型糖尿病、SLE和自身免疫性的治療性抗體的工程改造、分析和評估中用作至關(guān)重的工具提供能夠?qū)崿F(xiàn)人的免疫過程的更精確評估(特別地在測試人抗體治療劑的情景中)的動物模型。小鼠還可以是具有低親和力受體的細(xì)胞的有價值的來源，所述細(xì)胞可在體外測定中用于評估結(jié)合低親和力受體的治療劑的治療劑依賴性細(xì)胞殺傷，并因此而被用于鑒定有用的人治療劑。內(nèi)源低親和力Fe Y R基因缺陷型小鼠提供了不表達(dá)內(nèi)源低親和力小鼠Fe Y R基因但表達(dá)內(nèi)源小鼠FcRy鏈的遺傳修飾的非人動物。在不同的實施方案中，F(xiàn)cRy鏈以與野生型小鼠中相同或大體上相同的分布(即，在細(xì)胞類型中)和水平在小鼠中表達(dá)。內(nèi)源低親和力Fe YR基因可在免疫細(xì)胞的表面上表達(dá)或在動物的周圍組織中以可溶性方式表達(dá)。用于產(chǎn)生不表達(dá)內(nèi)源低親和力小鼠Fe Y R基因的非人動物的遺傳修飾通過使用小鼠為例子來方便地說明?？梢砸远喾N方式，特別是實施方案已在本文中進(jìn)行了描述的方式產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的小鼠。 圖I中(頂部)提供了顯示FcyR基因在內(nèi)源基因座中的排列的低親和力小鼠Fe Y R基因基因座的示意圖(未按比例的)。如圖所示，低親和力小鼠Fe Y R基因Fe Y RIIB、Fe Y RIV和Fe Y RIII —起緊密地存在于一條染色體上。這些基因中的每一個基因包含負(fù)責(zé)結(jié)合抗體分子的Fe部分的α鏈或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。缺失編碼內(nèi)源低親和力Fe YR基因的α鏈的核苷酸序列的遺傳修飾的小鼠可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來產(chǎn)生。例如，可制備缺失低親和力小鼠Fe YRa鏈基因的具有選擇標(biāo)記基因的靶向載體。圖I舉例說明了被靶向構(gòu)建體靶向的小鼠基因組(底部)，所述構(gòu)建體具有包含內(nèi)源低親和力Fe Y Ra鏈基因座的上游序列的5’同源臂，后接藥物選擇盒(例如，側(cè)翼連接有IoxP序列的新霉素抗性基因)和包含內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因座的下游序列的3’同源臂。于基因座上同源重組后，內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因座被藥物選擇盒替代(圖I的底部)。內(nèi)源低親和力FcYRa鏈基因基因座因此被缺失，從而產(chǎn)生不表達(dá)內(nèi)源低親和力小鼠FcYRa鏈基因的細(xì)胞或非人動物。可作選地通過隨后添加重組酶(例如，通過Cre處理)除去藥物選擇盒。在不同實施方案中，遺傳修飾小鼠以使內(nèi)源低親和力小鼠Fe YRa鏈基因失去功能，產(chǎn)生展示免疫應(yīng)答的缺陷的小鼠，從而使得小鼠對于評估內(nèi)源低親和力小鼠Fe Y R基因在正常和紊亂的免疫功能、IgG-介導(dǎo)的過程以及自身免疫疾病中的協(xié)同以及單獨的作用是有用的。在不同的實施方案中，修飾內(nèi)源低親和力小鼠Fe YR基因的α鏈但非FcRy鏈，避免了需要FcRy鏈以進(jìn)行表面表達(dá)和功能的其它內(nèi)源FcR基因(例如，高親和力Fe Y RI)的潛在減少，從而維持通過Y鏈依賴性過程介導(dǎo)的各種其它免疫功能和過程。根據(jù)一些方面，F(xiàn)cR Y鏈缺陷型小鼠缺失Fe Y RIII和Fe Y RI的表面表達(dá)。然而，已報道在FcR Y鏈缺陷型小鼠的細(xì)胞表面上檢測到Fe Y RI，所述Fe y RI據(jù)報道具有至少部分功能。相反地，根據(jù)本發(fā)明的小鼠包含未修飾的內(nèi)源FcRy鏈，其保持天然細(xì)胞表面表達(dá)模式和需要FcR Y鏈的其它FcR基因的細(xì)胞功能。在不同的實施方案，本發(fā)明的小鼠顯示了優(yōu)于其它Fe Y R基因-缺陷小鼠的有利方面，所述有利方面在于它們所具有的遺傳修飾導(dǎo)致不完全貢獻(xiàn)于低親和力Fe Y R基因的其它免疫功能所必需的其它基因的維持。例如，通過功能性FcR Y鏈，其它Y鏈依賴性蛋白(例如，F(xiàn)e Y RI)將能夠與FcR Y鏈結(jié)合并且在免疫應(yīng)答中參與效應(yīng)細(xì)胞功能。在根據(jù)本發(fā)明的各種遺傳修飾的小鼠中，據(jù)認(rèn)為維持此類功能(歸因于功能性FcRy鏈的存在)同時缺失內(nèi)源低親和力Fe Y R基因(一個或多個a -亞基)使得能夠更精確地闡明FcR在自身免疫中的作用。低產(chǎn)和力Fe Y R人源化小鼠
提供了表達(dá)低親和力人Fe Y R基因的遺傳修飾的非人動物。低親和力人Fe Y R基因可在動物免疫系統(tǒng)的輔助細(xì)胞的表面上表達(dá)或在動物的周圍組織中以可溶性方式表達(dá)。在不同的實施方案中，遺傳修飾包含一個或多個低親和力小鼠Fe Y R基因的功能性α鏈的缺失，并且在一些實施方案中包含含有以兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個低親和力人Fe Y R α亞基基因的替代的其它修飾，其中非人動物表達(dá)功能性小鼠FcRy鏈基因。還提供了遺傳修飾的非人胚胎、細(xì)胞和用于產(chǎn)生非人動物、非人胚胎和細(xì)胞的靶向構(gòu)建體。提供了用于制備表達(dá)人Fe Y R基因(包括特定多態(tài)性形式或等位基因變體(例如，單個氨基酸的差異))的小鼠的組合物和方法，包括用于制備從人啟動子和人調(diào)控序列表達(dá)此類基因的的小鼠的組合物和方法。所述方法包括選擇性地使內(nèi)源低親和力小鼠FcyR基因失去功能(例如，通過其α鏈的缺失)以及在內(nèi)源低親和力小鼠Fe Y R基因的基因座上利用低親和力人Fe Y R基因的α鏈在小鼠中表達(dá)低親和力人Fe Y Ra-亞基基因。通過缺失一個或多個α鏈基因但非FcR Y鏈基因來產(chǎn)生低親和力小鼠Fe Y R基因的 缺失。所述方法選擇性地使一個或多個內(nèi)源低親和力Fe YRa鏈基因失去功能而同時保留功能性內(nèi)源FcR Y鏈。在不同的實施方案中，內(nèi)源Fe YRa鏈替代方法對動物中的天然Fe Y R介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的破壞相對最小，因為Fe YRa鏈的基因組序列在單個片段中被替代，從而通過包含必需調(diào)控序列保留正常功能性。因此在這樣的實施方案中，F(xiàn)cYRa鏈修飾不影響其它依賴于功能性FcR Y鏈分子的內(nèi)源FcR。此外，在不同實施方案中，修飾不影響包括FcyRa鏈和內(nèi)源FcR Y鏈的功能性受體復(fù)合物的裝配，所述復(fù)合物據(jù)認(rèn)為是一些Fe Y R a鏈在細(xì)胞表面上的正確表達(dá)以及由激活的受體產(chǎn)生的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需要的。因為FcRy鏈未缺失，在不同實施方案中，包含人Fe Y Ra鏈基因?qū)?nèi)源Fe YRa鏈基因的替代的動物應(yīng)當(dāng)能夠通過IgG免疫球蛋白的Fe部分對存在于輔助細(xì)胞表面上的人Fe YRa鏈的結(jié)合來處理來自抗體的正常效應(yīng)子功能。在圖4中(上部)提供了缺失的內(nèi)源低親和力小鼠FcyR基因的示意圖(未按比例的)。如圖所示，通過用包含人低親和力人Fe Y RIIA和Fe Y RIIIA基因的基因組片段以靶向構(gòu)建體(人Fe Y RIIIA-IIA靶向載體)將人低親和力人Fe Y R基因Fe Y RIIA和Fe Y RIIIA插入缺失的內(nèi)源低親和力小鼠Fe Y R基因的基因座。這些基因的每一個基因包含負(fù)責(zé)結(jié)合抗體分子的Fe部分的人Fe Y R基因的α鏈或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在內(nèi)源低親和力小鼠Fe Y R基因座上表達(dá)低親和力人Fe Y R基因的遺傳修飾的小鼠可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法來制圖。例如，可制備引入低親和力人FcyR基因(例如，和選擇標(biāo)記基因的靶向載體。圖4(頂部)舉例說明了包含內(nèi)源低親和力Fe YR基因座的缺失的小鼠基因組。如圖所示，靶向構(gòu)建體包含含有內(nèi)源低親和力小鼠FcyR基因座的上游序列的5’同源臂、后接藥物選擇盒(例如，兩側(cè)連接有IoxP序列的潮霉素抗性基因)、包含人Fe Y RIIA基因、人HSP76基因和人Fe Y RIIIA基因的基因組片段以及包含內(nèi)源低親和力小鼠Fe YR基因座的下游序列的3’同源臂。于缺失的基因座上同源重組后，藥物選擇盒被包含在靶向載體中的序列替代(圖4的底部)。內(nèi)源低親和力Fe Y R基因基因座因此被低親和力人Fe Y R基因替代，產(chǎn)生表達(dá)低親和力人Fe Y R基因的細(xì)胞或動物。可任選地通過隨后添加重組酶(例如，通過Cre處理)除去藥物選擇盒。
為了在血小板上表達(dá)hFc y RIIA,靶向構(gòu)建體人hFc y RIIA-IIA靶向載體包含延長的序列，該序列包括例如與人基因組中的hFc Y RIIA基因可操作地連接的全部或大體上全部人啟動子區(qū)域。為了阻止hFc Y RIIA在血小板上表達(dá)，靶向構(gòu)建體缺失可操作地連接于人的hFc Y RIIA基因的全部或大體上全部啟動子區(qū)域。可使用對于利用兩個人Fe Y R基因的替代所描述的相似技術(shù)實現(xiàn)對嵌合基因座的其它修飾(圖4的底部)。用兩個人Fe Y R基因替代內(nèi)源低親和力Fe Y R基因基因座的修飾還可提供用于整合其它低親和力人Fe YR基因的起始點。例如，圖6(頂部)中提供了用兩個人低親和力Fe Y R基因替代的內(nèi)源低親和力Fe Y R基因座的示意圖(未按比例的)。如圖所示，通過另一個具有包含低親和力人Fe Y RIIB、Fe Y RIIC和Fe y RIIIB基因的基因組片段的靶向構(gòu)建體(人FcyRIIB-IIIB-IIC靶向載體)將低親和力人Fe Y R基因Fe Y RIIB、Fc Y RIIC和Fe y RIIIB插入修飾的內(nèi)源低親和力小鼠Fe Y R基因的基因座。這些基因的每一個基因包含負(fù)責(zé)結(jié)合抗體分子的Fe部分的人FcyR基因的α鏈或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
在內(nèi)源低親和力小鼠Fe Y R基因座上表達(dá)5個低親和力人Fe Y R基因的遺傳修飾的小鼠可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來產(chǎn)生。例如,可制備引入低親和力人Fe Y R基因(例如，F(xiàn)e yRIIB、Fe yRIIC^PFcyRIIIB)的具有選擇標(biāo)記基因的靶向載體。圖6(頂部)舉例說明了包含以2個低親和力人Fe Y R基因?qū)?nèi)源低親和力Fe Y R基因座的替代的小鼠基因組。如圖所示，靶向構(gòu)建體包含含有內(nèi)源低親和力小鼠Fe Y R基因座的上游序列的5’同源臂、后接藥物選擇盒(例如，兩側(cè)連接有IoxP序列的新霉素抗性基因)、包含人Fe Y RIIB基因、人Fe Y RIIIB、人HSP77基因、人Fe Y RIIC基因的基因組片段，后跟含有存在于內(nèi)源基因座上的低親和力人Fe Y RIIIA基因的下游序列的3’同源臂。于修飾的基因座上同源重組后，人Fe Y RIIB、Fe YRIIIB和Fe y RIIC基因通過靶向載體中包含的序列被插入先前存在于內(nèi)源低親和力Fe Y R基因基因座上的人Fe Y RIIIA和Fe Y RIIA基因的5’(圖6的底部)。因此對修飾的內(nèi)源低親和力Fe Y R基因基因座進(jìn)一步修飾以整合3個額外的低親和力人Fe Y R基因，從而產(chǎn)生表達(dá)5個低親和力人Fe Y R基因的細(xì)胞或動物。藥物選擇盒可任選通過隨后添加重組酶(例如，通過Cre處理)來除去。圖6(底部分)顯示所得的基因座的結(jié)構(gòu)，其將表達(dá)可在動物的免疫系統(tǒng)的輔助細(xì)胞的表面上檢測到的并且適當(dāng)時與內(nèi)源FcRy鏈獨立結(jié)合的5個低親和力人Fe Y R基因。FcyR缺陷型小鼠和Fe Y R人源化小鼠的實驗?zāi)Ｐ筒槐磉_(dá)內(nèi)源低親和力小鼠Fe Y R基因的遺傳修飾的非人動物是有用的，其用于例如闡明單個低親和力Fe Y R基因在免疫應(yīng)答中的各種功能、通過細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(例如，ADCC)測量人治療性抗體的功效、測定Fe Y R在免疫疾病或障礙中的作用、用作免疫疾病或障礙的模型、產(chǎn)生抗一種或多種Fe Y R蛋白的抗體、以及用作產(chǎn)生其它目標(biāo)遺傳修飾的小鼠的交配配偶。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的小鼠可用于通過給不表達(dá)低親和力Fe Y R基因的小鼠施用試劑來測定這樣的小鼠的細(xì)胞毒性效應(yīng)的喪失(與野生型小鼠相比較)，其中已知所述試劑在野生型小鼠中觸發(fā)Fe YR-依賴性細(xì)胞毒性效應(yīng)。在一個實施方案中，將腫瘤細(xì)胞植入本發(fā)明的小鼠，在隨后的一段時間后，用特異于在腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原的抗體注射小鼠?？贵w的同種型在注射前是已知的并且通過與在野生型動物中觀察到的ADCC相比較來分析動物的Fe Y R-依賴性ADCC的減弱。在另一個方面，可將內(nèi)源低親和力受體缺陷型小鼠與其它免疫缺陷型小鼠組合(例如，通過交配)以產(chǎn)生自身免疫疾病的體內(nèi)模型。例如，重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠在本領(lǐng)域常規(guī)地用作用于研究免疫系統(tǒng)的模型生物。SCID小鼠具有受損的產(chǎn)生T或B淋巴細(xì)胞或激活補(bǔ)體系統(tǒng)的一些組分的能力，并且不能高效地抵抗感染、排斥腫瘤和排斥移植物?？蓪⒈景l(fā)明的低親和力Fe Y Ra -亞基基因缺陷型小鼠培育成SCID小鼠以確定宿主動物響應(yīng)于抗體治療劑(例如，抗腫瘤抗體)的施用的細(xì)胞耗盡，這可測定ADCC和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)在體內(nèi)腫瘤細(xì)胞耗盡中的作用。在另一個方面，提供了包含低親和力人Fe Y R基因?qū)?nèi)源低親和力Fe Y R基因的替代的遺傳修飾的非人動物。此類動物對于研究完全人抗體和hFc Y R介導(dǎo)的ADCC的藥代動力學(xué)是有用的。此外，已顯示人Fe Y R基因展示與疾病(例如，SLE, RA, WegenerJ s肉芽腫病、Guillain-Barr6綜合征和多發(fā)性硬化)相關(guān)的多態(tài)性或等位基因變體。因此，包含人Fe Y R基因的特定等位基因或多態(tài)性形式對內(nèi)源低親和力Fe Y R基因的替代的遺傳修飾的非人動物可用于在動物中研究人自身免疫疾病和與多態(tài)性相關(guān)的性狀。在具體的實施方案中，人Fe Y R基因的等位基因形式與對于人IgG的增強(qiáng)的功效相關(guān)?！ぴ诹硪粋€具體的實施方案中，測定人低親和力Fe Y R多態(tài)性對人抗體治療劑的功效的影響。在具體的實施方案中，給包含人Fe YR的第一多態(tài)性的第一人源化小鼠施用抗腫瘤抗體，也給包含人Fe YR的第二多態(tài)性的第二人源化小鼠施用抗腫瘤抗體，其中第一和第二小鼠各自包含人腫瘤細(xì)胞；并且在第一小鼠和第二小鼠中評估抗腫瘤抗體的抗腫瘤活性。在具體的實施方案中，由醫(yī)生基于抗腫瘤抗體在第一小鼠和第二小鼠中的功效的評估選擇關(guān)于治療具有第一或第二多態(tài)性和具有相應(yīng)于人腫瘤細(xì)胞的腫瘤的人的治療選擇。人Fe Y R基因的適當(dāng)多態(tài)性包括本領(lǐng)域已知的全部多態(tài)性。對于人Fe Y RIIA基因，多態(tài)性包括例如通過T細(xì)胞響應(yīng)于IgG增殖的能力報道的高應(yīng)答者表型和低應(yīng)答者表型。高應(yīng)答者多態(tài)性的特征在于位點131上的精氨酸殘基(131Arg)，而低應(yīng)答者的特征在于位點131上的組氨酸殘基(131His)。在具體的實施方案中，人Fe y RIIA序列包含131His多態(tài)性。人FcYRIIAa鏈的代表性蛋白質(zhì)序列示于SEQ ID N0:32中。人FcyRIIB基因的單核苷酸置換在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(α鏈)中導(dǎo)致錯義置換并且推定其影響IgG的Fe部分結(jié)合細(xì)胞表面上的Fe Y RIIB的α鏈的結(jié)合能力。例如，已顯示小鼠的Fe YRIIB基因的跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)的位點232上的蘇氨酸對異亮氨酸的置換(Ile232Thr)削弱了受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。在具體的實施方案中，人Fe Y RIIB基因包含異亮氨酸變體(232Ile)。人FcyRIIBa鏈的代表性蛋白質(zhì)序列示于SEQ ID N0:33中。有人提出人Fe Y RIIIA基因的等位基因變體牽涉SLE和RA的易感性。該等位基因變體包括位點158上苯丙氨酸對纈氨酸的置換(Vall58Phe)。纈氨酸等位基因變體(158Val)經(jīng)表征具有比苯丙氨酸等位基因變體(158Phe)更高的對IgGl和IgG3的親和力。已有人提出158Phe等位基因變體導(dǎo)致減少的免疫復(fù)合物的清除。在具體的實施方案中，人Fe Y RIIIA基因包含158Val等位基因變體。人Fe Y RIIIAa鏈的代表性蛋白質(zhì)序列示于SEQ ID NO:35 中。人Fe Y RIIIB基因的等位基因變體包括嗜中性粒細(xì)胞抗原I(NAl)和嗜中性粒細(xì)胞抗原2(NA2)等位基因。已有人提出這些等位基因變體牽涉輸血反應(yīng)、同種免疫嗜中性白血球減少癥(alloimmune neutropaenia)、SLE和Wegener’s肉芽腫病。NA2等位基因變體的特征在于減小的介導(dǎo)吞噬作用的能力。在具體的實施方案中，人Fe Y RIIIB基因包含NA2等位基因變體。人Fe YRIIIB α鏈的代表性蛋白質(zhì)序列示于SEQ ID Ν0:36中。在一個方面，遺傳修飾的非人動物對于最優(yōu)化通過治療性抗體的Fe部分觸發(fā)的Fe Y R介導(dǎo)的功能是有用的?？衫帽绢I(lǐng)域已知的任何方法修飾抗體的Fe區(qū)域。例如，可修飾Fe部分(例如，CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)中的氨基酸殘基以選擇性增強(qiáng)對人Fe Y RIIIA的結(jié)合親和力。因此，所得的抗體應(yīng)當(dāng)具有增強(qiáng)的Fe Y RIIIA依賴性ADCC。在具體的實施方案中，將表達(dá)本發(fā)明的人Fe Y RIIIA的動物用于評估修飾的人抗體的增強(qiáng)的ADCC能力(通過給動物施用修飾的人抗體，檢測(例如，體外)抗體對表達(dá)Fe YRIIIA的細(xì)胞的結(jié)合和將觀察到的ADCC活性與從野生型動物的測定觀察到的ADCC活性相比較)。
實施例實施例I:低親和力Fe Y R基因缺失型小鼠的產(chǎn)生構(gòu)建用于引入內(nèi)源低親和力小鼠Fe YR基因座的缺失的靶向構(gòu)建體(下文中描述的)(圖I)。使用VELOC1GENE 技術(shù)(參見，例如，美國專利No. 6，586，251和Valenzuela 等人(2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupledwith high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6) :652-659)制備革巴向構(gòu)建體以修飾細(xì)菌人工染色體(BAC) RP23-395f6 (Invitrogen)。修飾RP23_395f6 BAC DNA以缺失內(nèi)源低親和力Fe Y RIIB、Fc Y RIV和Fe Y RIII基因(包括每一個Fe Y R的α鏈)。簡而言之，分別利用引物mFcR5-up-l(5’-ACCAGGATATGACCTGTAGA G;SEQ ID NO:I)和 mFcR3_up-la(GTCCATGGGTAAGTAGAAAC A;SEQ ID NO:2)以及mFcR5-DN(ATGCGAGCTCATGCATCTATG TCGGGTGCGG AGAAAGAGGT AATGCATTCTTGCCCAATACTTAC; SEQ ID NO:3)和 mFcR3_DN(ACTCATGGAGCCTCAACAGG A; SEQ ID NO:4)產(chǎn)生上游和下游同源臂。這些同源臂被用于產(chǎn)生缺失內(nèi)源低親和力Fe Y RIIB、Fc Y RIV和Fe Y RIII基因的α鏈的盒。靶向構(gòu)建體包括Iox化的新霉素抗性基因，其包含相對于內(nèi)源基因座的5’和3’區(qū)域同源的序列的同源臂。內(nèi)源Fe YRIIB基因的上游和內(nèi)源Fe YRIII基因的下游的基因和/或序列(參見圖I)不被該靶向構(gòu)建體修飾。使用在缺失區(qū)域外部和在靶向構(gòu)建體內(nèi)部的引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來確認(rèn)靶向缺失。使用針對 mFcR-up-detect(ATCCTGAGTA TACTATGACA AGA; SEQ ID NO: 5)和 PGK-up-detect (ACTAGTGAGA CGTGCTACTT C;SEQ ID NO:6)的引物通過 PCR 來確認(rèn)缺失的基因座的上游區(qū)域；使用引物 pA-DN-detect(CTCCCACTCA TGATCTATAG A; SEQ ID NO:7)和 mFcR-DN-detect (TGGAGCCTCA ACAGGACTCC A; SEQ ID NO:8)來確認(rèn)缺失的基因座的下游區(qū)域。橫跨上游缺失點的核苷酸序列包括下列序列，所述序列表示與存在于缺失點上的盒序列連續(xù)連接的FcyRIIB基因的下游內(nèi)源小鼠序列(包括在下面的括號內(nèi))(GTCCATGGGTAAGTAGAAACA)TTCGCTACC TTAGGACCGT TA(SEQ ID NO:9)。橫跨下游缺失點的核苷酸序列包括下列序列，其表示與Fe YRIII基因上游的內(nèi)源小鼠序列(包括在下面的括號內(nèi))連續(xù)的盒序列CGGGTGCGGA GAAAGAGGTA AT(GCATTCTT GCCCAATACTTA) (SEQ IDNO:10)。
通過將靶向BAC DNA(上文中描述的)電穿孔入小鼠ES細(xì)胞來產(chǎn)生Fe Y RIIB、Fe Y RIII和Fe Y RIV缺陷小鼠。通過Taqman 篩選和核型分析確認(rèn)陽性ES細(xì)胞克隆。隨后將陽性ES細(xì)胞克隆用于植入雌性小鼠以產(chǎn)生一窩低親和力Fe Y R基因缺陷幼鼠。實施例2:低親和力Fe Y R基因缺陷型小鼠的表征從Fe Y R缺陷型小鼠和野生型小鼠收獲脾，在無菌一次性袋中用IOmL的膠原酶-D灌注。隨后將每一只包含單個脾的袋子置于Stomacher (Seward)中，在培養(yǎng)基環(huán)境中勻漿30分鐘。將勻漿的脾轉(zhuǎn)移至IOcm培養(yǎng)皿，在37° C溫育25分鐘。使用1:50稀釋度的O. 5MEDTA，利用移液器分離細(xì)胞，隨后在37° C再溫育另外5分鐘。隨后通過離心(IOOOrpm進(jìn)行10分鐘)沉淀細(xì)胞,將紅細(xì)胞在4mL ACK緩沖液(Invitrogen)中裂解3分鐘。用RPMI-1640 (Sigma)稀釋脾細(xì)胞，再次離心。將沉淀的細(xì)胞重懸浮于IOmL RPMI-1640中，利用O. 2 μ m細(xì)胞濾過器進(jìn)行過渡。 流式細(xì)胞術(shù)。利用下列綴合有熒光團(tuán)的細(xì)胞表面標(biāo)記物抗_CD19(B細(xì)胞)、抗-CD3 (T細(xì)胞)、抗-NKp46 (NK細(xì)胞)和抗-F4/80 (巨噬細(xì)胞)在BD LSR II系統(tǒng)(BDBioscience)上通過FACS鑒定淋巴細(xì)胞群體。針對特定細(xì)胞譜系門控淋巴細(xì)胞，利用大鼠抗-小鼠 Fe Y RIII/II 抗體(克隆 2. 4G2, BD Biosciences)分析內(nèi)源Fe Y RIII 和 Fe Y RIIB的表達(dá)?？寺?. 4G2識別鼠Fe Y RIII和Fe Y RII的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域上的共同多態(tài)性表位。結(jié)果顯示在mFc Y R KO小鼠的B-細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上不存在可檢測的鼠低親和力FcyRIII 或 Fe Y RII (圖 2)。ADCC測定。從Fe Y R基因缺陷型小鼠和野生型小鼠分離脾細(xì)胞，在細(xì)胞殺傷測定中分析它們進(jìn)行ADCC的能力。使用MACS 技術(shù)(Miltenyi Biotec)分離和分開細(xì)胞群體。簡而言之，使用磁性標(biāo)記的抗-小鼠CD3珠粒從脾細(xì)胞耗盡T細(xì)胞。隨后使用磁性標(biāo)記的抗-小鼠CD49B珠粒就NK細(xì)胞富集T細(xì)胞耗盡的脾細(xì)胞。單獨地，用不同濃度(范圍從O. I 至 10 μ g/mL)的小鼠抗 _ 人 CD20 抗體(克隆 BI; BeckmanCoulter)在 4。C 包被 Raji細(xì)胞(表達(dá)人⑶20) 30分鐘。以100:1和50:1的比率(NK = Raji)將抗體包被的Raji細(xì)胞與富集的NK細(xì)胞在37° C溫育4小時。使用CytoTox-Glo 細(xì)胞毒性測定法(Promega)測量細(xì)胞死亡。發(fā)光信號來源于裂解的細(xì)胞并且與死亡細(xì)胞的數(shù)目成正比。就每一個比率的本底死亡細(xì)胞計數(shù)測定來自對照(無抗-CD20抗體)的發(fā)光，從野生型和KO小鼠的測量扣除該發(fā)光。計算平均細(xì)胞死亡，通過與野生型相比較測定細(xì)胞殺傷的百分比減少(%ADCC)。結(jié)果不于表I中。表I
[012權(quán)利要求
1.包含遺傳修飾的小鼠，其中所述遺傳修飾包括以置于內(nèi)源小鼠低親和力FeY R基因基因座上的至少兩個低親和力人Fe Y R基因替代內(nèi)源低親和力Fe Y R基因，并且其中所述小鼠包含功能性FcR Y鏈。
2.權(quán)利要求I所述的小鼠，其中至少兩個低親和力人FeYR基因選自FcyRIIA、Fe Y RIIB、Fe Y RIIC、Fe y RIIIA 和 Fe y RIIIBo
3.權(quán)利要求I所述的小鼠，其中至少兩個低親和力人FeY R基因為Fe Y RIIA和Fe Y RIIIAo
4.權(quán)利要求3所述的小鼠，其中人FeY RIIIA在小鼠的NK細(xì)胞上表達(dá)。
5.權(quán)利要求I所述的小鼠，其中所述至少兩個低親和力人FeY R基因為FcyRIIB、Fe Y RIIC 和 Fe Y RIIIBo
6.權(quán)利要求3所述的小鼠，其中所述FeY RIIA和Fe Y RIIIA基因包含等位基因變體或多態(tài)性。
7.權(quán)利要求5所述的小鼠，其中所述小鼠包含人低親和力FeY R等位基因變體，并且所述等位基因變體選自(a)Fe Y RIIA等位基因變體131H，(b)Fe Y RIIIA等位基因變體158V，(c)Fc Y RIIB等位基因變體2321，(d)特征在于嗜中性粒細(xì)胞抗原2 (NA2)等位基因的Fe Y RIIIB等位基因變體，及(e)它們的組合。
8.遺傳修飾的小鼠，其中所述遺傳修飾包括以編碼人FeY RIIIA α -亞基的基因替代編碼FcyRIIB、FcyRIII和Fe Y RIV α -亞基的內(nèi)源小鼠基因，其中所述小鼠表達(dá)與內(nèi)源小鼠FcR Y -亞基結(jié)合的人Fe Y RIIIA蛋白，其中人Fe Y RIIIA蛋白在小鼠NK細(xì)胞的表面上表達(dá)。
9.權(quán)利要求8的遺傳修飾的小鼠，其中小鼠NK細(xì)胞是小鼠血液中的循環(huán)NK細(xì)胞，并且在小鼠NK細(xì)胞表面上表達(dá)的Fe Y RIIIA蛋白結(jié)合包含人Fe或修飾的人Fe的免疫粘附素或抗體，其中免疫粘附素或抗體特異性結(jié)合小鼠中的靶細(xì)胞，并且免疫粘附素或抗體對NK細(xì)胞的Fe YRIIIA的結(jié)合介導(dǎo)靶細(xì)胞的NK細(xì)胞殺傷。
10.權(quán)利要求9的遺傳修飾的小鼠，其中用人病原體感染靶細(xì)胞，并且免疫粘附素或抗體特異性結(jié)合人病原體的表位。
11.權(quán)利要求9的遺傳修飾的小鼠，其中所述靶細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，并且免疫粘附素或抗體特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞的表位。
12.用于測量治療依賴性細(xì)胞殺傷的方法，包括 (a)給遺傳修飾的小鼠施用特異性結(jié)合小鼠中的不是NK細(xì)胞的靶細(xì)胞的治療劑，其中所述治療劑包含人Fe ； (b)測量小鼠或小鼠的組織樣品中的NK介導(dǎo)的靶細(xì)胞殺傷的水平；和 (c)測定由所述治療劑介導(dǎo)的靶細(xì)胞殺傷的量，從而測量治療依賴性細(xì)胞殺傷； 其中所述遺傳修飾包括編碼小鼠Fe Y RIIB的α -亞基的基因的缺失、編碼小鼠Fe Y RIII的α -亞基的基因的缺失和編碼小鼠Fe Y RIV的α -亞基的基因的缺失，并且其中所述小鼠在內(nèi)源小鼠α-亞基基因座上包含編碼人Fe Y RIIIA的α-亞基的基因，并且其中所述小鼠表達(dá)功能性FcRy鏈亞基。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述小鼠還在內(nèi)源小鼠α-亞基基因座上包含編碼選自Fe Y RIIA α -亞基、Fe Y RIIB α -亞基、Fe Y RIIC α -亞基、Fe Y RIIIB α -亞基及其組合的人Fe YRa-亞基的基因。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述靶細(xì)胞為人病原體，并且所述治療劑特異性結(jié)合人病原體的表位。
15.權(quán)利要求12的方法，其中靶細(xì)胞為被人病原體感染的小鼠細(xì)胞，并且所述治療劑特異性結(jié)合所述人病原體的表位。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述靶細(xì)胞為被人病原體感染的人細(xì)胞，并且所述治療劑特異性結(jié)合所述人病原體的表位。
17.權(quán)利要求12的方法，其中靶細(xì)胞為人腫瘤細(xì)胞，并且所述治療劑特異性結(jié)合所述人腫瘤細(xì)胞的表位。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述組織樣品為血液樣品。
19.權(quán)利要求12的方法，其中所述治療劑為抗體。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗體為人抗體。
全文摘要
提供了遺傳修飾的非人動物和用于產(chǎn)生和使用它們的方法和組合物，其中所述遺傳修飾包括內(nèi)源低親和力FcγR基因座的缺失，并且其中小鼠能夠表達(dá)功能性FcRγ鏈。描述了遺傳修飾的小鼠，包括從內(nèi)源FcγR基因座表達(dá)低親和力人FcγR基因的小鼠，并且其中所述小鼠包含功能性FcRγ鏈。提供了在宿主免疫系統(tǒng)的輔助細(xì)胞上表達(dá)至多5個低親和力人FcγR基因的遺傳修飾的小鼠。
文檔編號C07K14/705GK102762590SQ201080064262
公開日2012年10月31日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者A·J·墨菲, C·古爾, L·麥克唐納, S·史蒂文斯, 涂納新 申請人:瑞澤恩制藥公司