專利名稱：一種提高寡核苷酸鏈Tm值的核苷酸單體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種核苷酸單體，尤其涉及一種帶有MGB的核苷酸單體，將這種帶有 MGB的核苷酸單體(DQ)應用于寡核苷酸的合成，可以提高寡核苷酸鏈Tm值；此外，本發(fā)明還涉及該核苷酸單體的制造方法及其在分子生物學等領域的應用。
背景技術：
實時熒光定量PCR技術通過檢測PCR產(chǎn)物中熒光訊號強度來達到定量的目的，該技術不僅實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已在動植物基因工程，微生物和醫(yī)學領域中得到廣泛應用。目前有下面幾種常用的熒光定量方法=TaqMan探針、Beacon探針、FRET技術等。 MGB探針是在TaqMan探針基礎上研發(fā)的一種探針修飾方法，該探針是指帶有一個小溝結合物基團的DNA探針，它可與單鏈的靶DNA形成極為穩(wěn)定的異源雙鏈，同時這種探針相對于通常的探針序列更短一些。MGB探針是在原有設計的寡核苷酸探針的基礎上在其5'或3'連接上一個化學基團一二氫環(huán)化吲哚卟啉_三肽(DPI3)，DPI3可折疊進入由探針末端5 6bp核苷酸形成的小溝內(nèi)。DPI3呈新月型，與B型DNA螺旋的淺深小溝一樣螺旋，通過范德華力穩(wěn)定其結構。無論是3' -MGB寡核苷酸探針還是5' -MGB寡核苷酸探針，都比沒有MGB的寡核苷酸探針顯示了更強的空間穩(wěn)定性。同時5' -MGB寡核苷酸探針能夠阻止引物的延伸，因此可以作為熒光定量PCR體系中的探針使用。研究表明，一般情況下，同MGB-寡核苷酸形成的錯配異源雙鏈其熔點溫度比沒有 MGB的寡核苷酸形成的雙鏈熔點溫度高，而且由于ΔΤπι(完全匹配的Tm值與錯配的Tm值之差)由錯配的位置和類型決定，在小溝結合區(qū)內(nèi)形成的錯配特別不穩(wěn)定。比起通常的寡核苷酸探針，MGB寡核苷酸探針更容易辨認在MGB結合區(qū)形成的錯配。同時分子分析表明， 與寡核苷酸探針3'連接的MGB可向探針的5'-末端滑行l(wèi)_2bp，以便有更好的小溝結合位。MGB結構連接到12-18mer的寡核苷酸時，能顯著增加異源雙鏈的穩(wěn)定性。據(jù)報道，Tm 值在66-70°C之間，而沒有MGB的相同序列Tm值在44 56°C。探針越短，整體異源雙鏈的穩(wěn)定性越大。有研究表明，一個沒有MGB的27mer寡核苷酸探針形成的異源雙鏈的穩(wěn)定性 (Tm = 650C )與有MGB的12mer寡核苷酸探針(Tm = 66°C )相同，從這12mer的寡核苷酸探針的序列中可以看出，富含A/T的3 ‘-末端附近的MGB配體對穩(wěn)定性的作用等于在序列的5'-末端另加15個mer。目前的MGB探針是MGB結構連接在3’端的淬滅基團上，而且結構單一的使用了 DPI3，因次，目前的MGB探針不適合做多重熒光定量檢測，另外針對不同基因設計的靈活性不夠高，造成很多地方應用的局限性。DQ探針很好的解決了目前MGB的不足，我們可以使用不同的淬滅基團來淬滅不同波長的熒光報告基團，又可以在不同的位置同時修飾多個堿基分子，靈活的根據(jù)需要選擇設計探針。另外DQ探針也可以用在PCR擴增、FISH雜交、芯片等，大大提高了 DQ探針的應用領域。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題之一在于利用化學修飾技術，提供一種能提高寡核苷酸鏈Tm值的新型核苷酸單體，以下簡稱DQ，將小溝結合物MGB通過共價連接到單個核苷酸的堿基上，從而提高被修飾的寡核苷酸鏈的Tm值。本發(fā)明要解決的技術問題之二在于提供所述的DQ的制備方法。本發(fā)明要解決的技術問題之三在于提供一種經(jīng)小溝結合物MGB修飾的核酸片段。本發(fā)明要解決的技術問題之四在于提供所述的經(jīng)過小溝結合物MGB修飾的核酸片段作為引物或TaqMan探針在熒光定量PCR檢測中的應用。本發(fā)明的技術問題是通過如下的技術方案實現(xiàn)的。在本發(fā)明的一方面，提供一種提高寡核苷酸鏈Tm值的核苷酸單體，其結構如通式 (I)所示
權利要求
1.一種提高寡核苷酸鏈Tm值的核苷酸單體，其結構如通式(I)所示
2.如權利要求1所述的核苷酸單體，其特征在于，所述堿基Base為腺嘌呤或胸腺嘧啶。
3.如權利要求1所述的核苷酸單體，其特征在于，所述MGB為DPI2或DPI3。
4.如權利要求1所述的核苷酸單體，其特征在于，所述橋接部分bridge末端的活性基團與MGB共價連接，從而得到含有MGB的核苷酸單體。
5.如權利要求1所述的核苷酸單體，其特征在于，所述橋接部分bridge的末端活性基團是指丙烯酰胺，羧酸的活化酯，羥基，醛基，烷基鹵化物，磺酸基，氨基，酸酐，苯胺，芳基鹵化物，疊氮基，氮丙碇，硼酸鹽，羧酸，碳二亞胺，重氮烷，環(huán)氧化合物，二醇，胼基，羥胺，亞胺碳酸酯，異氰酸酯，異硫氰酸酯，酮，馬來酰亞胺，亞磷酰胺，氯磺酸，或者巰基。
6.一種如權利要求1-5任一項所述的核苷酸單體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將MGB 溶解于有機物中，加入 amino-dT-C6、amino-dA_C6、amino-dG_C6、 amino-dC-C6或amino-dU_C6進行反應，經(jīng)脫鹽，酸化，經(jīng)HPLC純化得到化合物A ；(2)將化合物A用雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦，四氮唑和DIPEA在干燥二氯甲烷中進行亞磷酰胺化反應，經(jīng)過HPLC提純制得核苷酸單體。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述有機物包括DMF和NaHC03， 所述加入amino-dT-C6或amin0-dA-C6進行反應，反應溫度為25V，反應時間為2小時；所述脫鹽，酸化采用60% CF3C00H-H20在25°C反應30min。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述亞磷酰胺化的反應時間為 2h，反應溫度為25°C。
9.一種經(jīng)過小溝結合物MGB修飾的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段為標記有小溝結合物MGB的寡核苷酸鏈，其中經(jīng)過小溝結合物MGB修飾的核苷酸單體的結構如權利要求1-5任一項所示。
10.如權利要求9所述的經(jīng)過小溝結合物MGB修飾的核酸片段，其特征在于，所述小溝結合物MGB通過化學修飾共價連接在所述寡核苷酸的1個或幾個堿基上。
11.如權利要求9或10所述的經(jīng)過小溝結合物MGB修飾的核酸片段，其特征在于，所述寡核苷酸鏈的長度為10-18個堿基。
12.如權利要求9所述的經(jīng)過小溝結合物MGB修飾的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段為TaqMan探針，所述寡核苷酸鏈的5'還標記有報告熒光基團，3'標記有不發(fā)光的淬滅基團。
13.如權利要求9-12任一項所述的經(jīng)過小溝結合物MGB修飾的核酸片段作為引物或 TaqMan探針在熒光定量PCR檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高寡核苷酸鏈Tm值的核苷酸單體，其結構如通式(I)所示，其中，R1，R2為氫原子或羥基或通過氧原子相連形成鎖核酸；堿基Base為嘌呤衍生物或嘧啶衍生物，該堿基為鳥嘌呤，腺嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶；堿基上帶有橋接部分bridge，該橋接部分的末端帶有活性基團與MGB相連，該橋接部分為中性脂肪鏈；MGB為小溝結合物。此外，本發(fā)明還公開了該核苷酸單體的制備方法和應用。將MGB通過化學修飾連接在單個核苷酸上，將經(jīng)過修飾的單個核苷酸用于寡核苷酸的合成。本發(fā)明的核苷酸單體能夠提高寡核苷酸鏈Tm值夠高靈敏度，將該核苷酸單體連接到寡核苷酸的堿基上，可提高熒光定量PCR探針的特異性，可有效地對基因多態(tài)性位點進行準確甄別。
文檔編號C07H21/04GK102219819SQ201110097470
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權日2011年4月19日
發(fā)明者方維佳, 李輝, 金大智 申請人:李輝, 浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院, 浙江省疾病預防控制中心