專利名稱：：膽固醇修飾的抗hiv多肽藥物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種高效抑制人免疫缺陷病毒(HIV)的多肽類藥物及其設(shè)計(jì)方法和治療艾滋病的用途。
背景技術(shù)：
：目前全球HIV感染人數(shù)超過(guò)6000萬(wàn)，其中約2000萬(wàn)已經(jīng)死亡。新的感染人數(shù)和死亡人數(shù)逐年增加。據(jù)WHO估計(jì)，現(xiàn)在每天就有1.6萬(wàn)新發(fā)感染；推測(cè)十年后大約有1億人感染，這無(wú)疑將是人類社會(huì)的一大災(zāi)難。疫苗是預(yù)防艾滋病的最好的手段，但二十多年來(lái)，還沒(méi)有一個(gè)HIV疫苗的臨床方案被證明有效。在今后相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)期內(nèi)，有效的HIV疫苗恐難有重大突破。因此，大力研究HIV-I感染機(jī)制并據(jù)此設(shè)計(jì)阻斷病毒不同復(fù)制階段的藥物是目前防控艾滋病的重點(diǎn)策略之一。迄今為止，臨床上治療HIV感染的藥物可以分為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，蛋白酶抑制劑、整合酶抑制劑和HIV進(jìn)入抑制劑，它們分別針對(duì)病毒復(fù)制的不同環(huán)節(jié)。大多數(shù)藥物屬于逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，這兩類藥物在臨床上容易誘導(dǎo)HIV耐藥性突變，而且對(duì)人體有較大的毒副作用，導(dǎo)致很多患者無(wú)法繼續(xù)接受治療，極大地限制了艾滋病病人的臨床治療。因此，研究開(kāi)發(fā)新的艾滋病藥物，尤其是針對(duì)病毒侵入途徑的抑制劑是當(dāng)前的重點(diǎn)內(nèi)容。HIV-Igp41結(jié)構(gòu)與功能研究HIV-I進(jìn)入靶細(xì)胞的過(guò)程主要由包被糖蛋白gpl60介導(dǎo)。該蛋白由表面亞基gpl20和跨膜亞基gp41通過(guò)非共價(jià)鍵連接。在天然狀態(tài)下，gpl60為三聚體，其中三分子的gpl20形成一個(gè)球狀復(fù)合物，而三分子gp41則象三個(gè)腳，插入病毒包膜內(nèi)[1]。在HIV感染靶細(xì)胞過(guò)程中，gpl20主要功能是與受體⑶4分子和輔助受體(趨化因子受體CCR5或CXCR4等)結(jié)合，而gp41分子主要介導(dǎo)病毒和細(xì)胞的膜融合。如同其他的I型跨膜蛋白一樣，HIV-Igp41分子由膜外區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。研究發(fā)現(xiàn)，gp41膜外區(qū)包含幾個(gè)重要的功能區(qū)(1)富含甘氨酸的疏水性融合肽(fusionpeptide)；(2)N-末端重復(fù)序列(NHR或HRl)；(3)C-末端重復(fù)序列(CHR或HR2)；(4)色氨酸富含區(qū)(TR)。從結(jié)構(gòu)上分析，NHR和CHR含有的疏水氨基酸4-3重復(fù)序列[(abCdefg)n]可能形成卷曲螺旋(coiedcoil)結(jié)構(gòu)，但確切的邊界點(diǎn)難以預(yù)測(cè)。直到1995年，Lu等[2]采用有限蛋白酶水解方法鑒定出由NHR多肽N51(aa540-590)和CHR多肽C43(aa624_666)組成的蛋白酶抗性gp41結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)合成的N51和C43多肽可以結(jié)合在一起形成穩(wěn)定的六聚體螺旋束結(jié)構(gòu)，提示它們分別包含NHR和CHR疏水性4-3重復(fù)序列。后來(lái)，進(jìn)一步采用有限蛋白酶水解方法消化重組N51(L6)C43重組蛋白鑒定出更短的NHR序列(N36,aa546-581)和CHR序列(C34，aa628_661)。N36禾口C34分別位于N51和C43的中間位置，也可以形成穩(wěn)定的六聚體螺旋束結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是HIV-Igp41的功能性核心結(jié)構(gòu)。1997年，麻省理工大學(xué)KimP研究小組用N36和C34多肽在體外反應(yīng)形成復(fù)合物來(lái)模擬HIVgp41，率先解出了gp41的核心結(jié)構(gòu)[3]。另外兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室也隨后報(bào)道了基于gp41合成多肽的六聚體螺旋束的晶體結(jié)構(gòu)[4_5]，證實(shí)了以上的發(fā)現(xiàn)。晶體結(jié)構(gòu)顯示，HIVgp41核心結(jié)構(gòu)為六股α-螺旋束，其中三個(gè)NHR組成的N-螺旋通過(guò)在a和d位置的氨基酸相互作用形成位于中心的螺旋三聚體，其e和g位置的氨基酸殘基則暴露于中心螺旋體的外圍，并與三個(gè)CHR組成的C-螺旋的a和d位置相互作用。C-螺旋以反向平行的方式分別結(jié)合在三個(gè)N-螺旋形成的溝槽中。基于gp41三維結(jié)構(gòu)信息，科學(xué)家提出了HIV-I膜融合機(jī)制當(dāng)HIV包膜蛋白gpl20與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合后發(fā)生顯著的構(gòu)象變化，gp41的融合多肽(FP)被暴露出來(lái)并插入靶細(xì)胞膜，三分子gp41上的NHR與CHR分別發(fā)生反向結(jié)合，形成穩(wěn)定的六螺旋束核心結(jié)構(gòu)，將病毒包膜與靶細(xì)胞膜的距離拉近而發(fā)生融合，從而介導(dǎo)HIV進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)[3_5]。令人興奮的是，晶體結(jié)構(gòu)還揭示NHR含有明顯的疏水袋狀結(jié)構(gòu)(hydrophobicpocket)，被認(rèn)為有可能是抗HIV藥物的新靶點(diǎn)[6_7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，HIV-lgp41CHR可以分為三個(gè)功能區(qū)(1)位于CHRN末端的NHR疏水袋結(jié)合區(qū)(PBD:pocket-bindingdomain,aa628_635)；(2)NHR結(jié)合區(qū)(NBDaa628-666)和(3)脂膜結(jié)合區(qū)(LBD:lipid_bindingdomain,aa666_673)[8]。包括定點(diǎn)突變分析在內(nèi)的大量研究表明NHR和CHR螺旋間的相互作用對(duì)gp41核心結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及病毒的感染活性起著決定性的作用[9_1(1]。在gp41六螺旋束即核心結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中，CHR上PBD的三個(gè)氨基酸以高親和力插入NHR疏水袋，對(duì)穩(wěn)定六螺旋束結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。以前的研究推測(cè)，CHR疏水袋結(jié)合區(qū)上游序列623QIWNNMT627也可能呈現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)；同時(shí)，NHR下游序列581AVERYLKDQ59°也有α-螺旋趨勢(shì)[3_5]。推測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)之間的相互作用有可能影響NHR和CHR形成穩(wěn)定的功能性核心結(jié)構(gòu)，從而影響病毒感染的膜融合過(guò)程。最近的研究發(fā)現(xiàn)，含有621QIWNNMT627的多肽(CP621-652)可以和NHR相應(yīng)多肽(Τ21)形成極其穩(wěn)定的六螺旋束結(jié)構(gòu)(Tm=820C)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前被認(rèn)為gp41核心結(jié)構(gòu)的N36和C34復(fù)合體的穩(wěn)定性(Tm=64°C)。這個(gè)結(jié)果提示，在HIV-I感染過(guò)程中，CHR上游的621QIWNNMT627位點(diǎn)和NHR下游的581AVERYLKDQ59°間可能相互作用并對(duì)gp41介導(dǎo)的膜融合過(guò)程有重要影響，從而決定病毒的感染活性。靶向gP41的HIV融合抑制劑研究理論上，抑制融合過(guò)程中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)，就能抑制HIV進(jìn)入靶細(xì)胞，從而達(dá)到抑制HIV感染和治療艾滋病的目的。從病毒融合機(jī)制的角度，HIV進(jìn)入抑制劑可分為三大類，一是干擾gpl20與CD4受體結(jié)合，稱為粘附抑制劑；二是拮抗輔助受體，阻止其與gpl20-⑶4復(fù)合物結(jié)合，稱為輔助受體拮抗劑；第三類是阻止gp41核心結(jié)構(gòu)的形成，稱為HIV融合抑制劑[11]。于2003年獲得美國(guó)FDA“快通道”批準(zhǔn)的抗HIV多肽類藥物T-20(Enfuvirtide)即是針對(duì)gp41核心結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程而發(fā)揮作用。T-20對(duì)耐受前兩類藥物的病毒依然有效，可用于組成更多的“雞尾酒”方案，用于艾滋病的治療。HIV進(jìn)入抑制劑的藥物作用靶點(diǎn)，既可以是病毒包膜蛋白，如gpl20和gp41，也可以是靶細(xì)胞上與HIV進(jìn)入有關(guān)的蛋白，如⑶4或CCR5、CXCR4等受體分子。以CCR5或CXCR4為藥物靶點(diǎn)的輔助受體拮抗劑，只能對(duì)相應(yīng)的R5或X4病毒有作用，不能抑制能使用兩種輔助受體的R5X4病毒，也無(wú)法完全抑制HIV感染者攜帶的各種準(zhǔn)株，可能導(dǎo)致治療和預(yù)防的失敗。同時(shí)，作用于人體蛋白也可能產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。因此，以HIV包膜蛋白本身作為藥物靶點(diǎn)，在藥物的安全性方面具有顯著的優(yōu)越性。由于gp41的序列比gpl20更為保守，且是病毒特有的蛋白，因而作為藥物靶點(diǎn)研究HIV進(jìn)入抑制劑更具優(yōu)勢(shì)。在過(guò)去的十余年中，靶向gp41的抗病毒多肽是HIV藥物研究的亮點(diǎn)之一，科學(xué)家采用不同的策略設(shè)計(jì)了許多基于多肽或重組蛋白的高效抗HIV融合抑制劑[11’13]。早在1992年，wild等從NHR區(qū)鑒定了第一個(gè)抗HIV多肽T21(DP-107)。隨后，更有效的HIV融合抑制多肽從CHR區(qū)被鑒定，如SJ-2176和T-20?？偟膩?lái)說(shuō)，衍生于gp41CHR的原型多肽比衍生于NHR的原型多肽具有更高的抗HIV活性，其中最著名的就是T-20和C34，它們可以有效地抑制HIV-I介導(dǎo)的細(xì)胞融合和感染?；贖IV的融合模型，CHR多肽抑制HIV進(jìn)入靶細(xì)胞的作用機(jī)理被認(rèn)為是與gp41NHR結(jié)合，從而阻止gp41本身的CHR與NHR結(jié)合形成功能性六螺旋束結(jié)構(gòu)(dominantnegativefashion)。然而，一些學(xué)者對(duì)T-20的作用機(jī)制有不同的看法[14]，它也有可能同時(shí)作用于細(xì)胞膜甚或gpl20。結(jié)構(gòu)上T-20和C34都包含NHR結(jié)合區(qū)，可以和NHR序列相互作用。雖然這兩個(gè)多肽大部分序列重疊，但C34包含疏水袋結(jié)合區(qū)(PBD)而T-20缺乏這個(gè)位點(diǎn)；然而T-20包含C34所沒(méi)有的脂膜結(jié)合區(qū)(LBD)，該位點(diǎn)對(duì)T-20的抗病毒活性也很重要。研究表明，NHR上547GIV549位點(diǎn)(GIVmotif)與HIV-I對(duì)T-20和C34的耐藥密切相關(guān)[15]。為克服T-20的耐藥問(wèn)題并提高藥物活性，設(shè)計(jì)了第二代融合抑制劑T-1249。該肽序列包含了HIV-I，HIV-2和SIV的CHR序列，具有較高的抗HIV能力，對(duì)T-20耐藥株也非常有效。但是，T-1249由于在劑型上存在問(wèn)題而停止了臨床試驗(yàn)。T-20是第一個(gè)也是目前唯一一個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床治療的HIV-I膜融合抑制劑，但由于容易引起耐藥，限制了它在臨床上的應(yīng)用。C34雖然活性更好，但由于其水溶性問(wèn)題也很難發(fā)展成為藥物?；贖IV-Igp41核心構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)和C34的序列，設(shè)計(jì)新型的抗病毒多肽是目前的研究熱點(diǎn)之一。另外，基于HIV-Igp41核心結(jié)構(gòu)理論研發(fā)融合抑制劑的研究進(jìn)展也極大地推動(dòng)了尋找具有類似融合機(jī)理的包膜病毒(如SARS冠狀病毒，呼吸道合胞病毒及H5W禽流感病毒等)抗病毒藥物。參考文獻(xiàn)1.ZhuP,LiuJ,BessJJr,ChertovaE,LifsonJD,GriseH,OfekGA,TaylorΚΑ,RouxKH.2006.Distributionandthree-dimensionalstructureofAIDSvirusenvelopespikes.Nature441(7095):847-52.2.Lu,Μ.,S.C.Blacklow,andP.S.Kim.1995.AtrimericstructuraldomainoftheHIV-Itransmembraneglycoprotein.Nat.Struct.Biol.2:1075-1082.3.Chan,D.C.,D.Fass,J.M.Berger,andP.S.Kim.1997.Corestructureofgp41fromtheHIVenvelopeglycoprotein.Cell89:263_273.4.ffeissenhorn,ff.,A.Dessen,S.C.Harrison,J.J.Skehel,andD.C.Wiley.1997.AtomicstructureoftheectodomainfromHIV-Igp41.Nature387:426_430.5.TanK,LiuJ,WangJ,ShenS,LuM.1997.AtomicstructureofathermostablesubdomainofHIV-Igp41.ProcNatlAcadSciUSA.94(23):12303—8.6.Chan,D.C.,C.T.Chutkowski,andP.S.Kim.1998.EvidencethataprominentcavityinthecoiledcoilofHIVtype1gp41isanattractivedrugtarget.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A9515613-15617.7.Chan,D.C.andP.S.Kim.1998.HIVentryanditsinhibition.Cell93681-684.8.Liu,S.,W.Jing,B.Cheung,H.Lu,J.Sun,X.Yan,J.Niu,J.Farmar,S.Wu,andS.Jiang.2007.HIVgp41C—terminalheptadrepeatcontainsmultifunctionaldomains.Relationtomechanismsofactionofanti—HIVpeptides.J.Biol.Chem.2829612-9620.9.Liu,J.,S.Wang,J.A.Hoxie,C.C.LaBranche,andM.Lu.2002.Mutationsthatdestabilizethegp41corearedeterminantsforstabilizingthesimianimmunodeficiencyvirus-CPmacenvelopeglycoproteincomplex.J.Biol.Chem.27712891-12900.10.Follis,K.Ε.,S.J.Larson,M.Lu,andJ.H.Nunberg.2002.Geneticevidencethatinterhelicalpackinginteractionsinthegp41corearecriticalfortransitionofthehumanimmunodeficiencyvirustype1envelopeglycoproteintothefusion-activestate.J.Virol.76:7356_7362.11.Este,J.A.andA.Telenti.2007.HIVentryinhibitors.Lancet370:81_88.12.BrassAL,DykxhoornDM,BenitaY,YanN,EngelmanA,XavierRJ,LiebermanJ,ElledgeSJ.2008.IdentificationofhostproteinsrequiredforHIVinfectionthroughafunctionalgenomicscreen.Science319(5865):921_6.13.Liu,S.，S.Wu,andS.Jiang.2007.HIVentryinhibitorstargetinggp41frompolypeptidestosmall-moleculecompounds.Curr.Pharm.Des13:143—162.14.Liu,S.，H.Lu,J.Niu,Y.Xu,S.Wu,andS.Jiang.2005.DifferentfromtheHIVfusioninhibitorC34,theanti-HIVdrugFuzeon(T-20)inhibitsHIV-Ientrybytargetingmultiplesitesingp41andgpl20.J.Biol.Chem.280:11259-11273.15.Chinnadurai,R.，D.Rajan,J.Munch,andF.Kirchhoff.2007.Humanimmunodeficiencyvirustype1variantsresistanttofirst—aridsecond-versionfusioninhibitorsandcytopathicinexvivohumanlymphoidtissue.J.Virol.816563-6572.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可以高效抑制HIV感染的多肽及其衍生物，該多肽是針對(duì)HIV侵入靶細(xì)胞的機(jī)制而設(shè)計(jì)，不但具有高活性，而且具有靶向性，可以極大地提高藥物的抗病毒效果，降低給藥劑量，從而達(dá)到提高療效、降低毒副作用的目的。本發(fā)明所提供的一個(gè)多肽，名稱為P32，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。為了提高其穩(wěn)定性，所述序列1的第1位氨基酸殘基連接有氨基端保護(hù)基，所述序列1的第32位氨基酸殘基連接有羧基端保護(hù)基。本發(fā)明所提供的另一個(gè)多肽是P32的衍生多肽，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示。為了提高其穩(wěn)定性，所述序列2的第1位氨基酸殘基連接有氨基端保護(hù)基，所述序列2的第33位的半胱氨酸殘基連接有羧基端保護(hù)基。序列表中的序列1由32個(gè)氨基酸殘基組成，序列2由33個(gè)氨基酸殘基組成。序列2與序列1相比，只在序列1的羧基端添加一個(gè)半胱氨酸殘基，以便于連接膽固醇分子。本發(fā)明所提供的多肽衍生物，是序列2所示衍生多肽的膽固醇修飾物，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示，其中，所述膽固醇修飾物是所述序列2的第33位的半胱氨酸殘基與膽固醇通過(guò)硫醚鍵連接得到的化合物。為了提高其穩(wěn)定性，所述序列2的第1位氨基酸殘基連接有氨基端保護(hù)基，膽固醇連接有羧基端保護(hù)基。該膽固醇修飾物的名稱為CHFI(Cholesterol-conjugatedHIVfusioninhibitor)。其序列和結(jié)構(gòu)為Ac_WNEMI￥EETOKKIEEYTKKIEEILKKSEEQQKC+Cholesterol-NH2，在合成多肽的C末端化學(xué)偶聯(lián)膽固醇分子。其中，各個(gè)字母符號(hào)所代表的氨基酸殘基的定義如下W為色氨酸、N為天冬酰胺、E為谷氨酸、M為蛋氨酸、T為蘇氨酸、K為賴氨酸、I為異亮氨酸、Y為酪氨酸、L為亮氨酸、S為絲氨酸、Q為谷氨酰胺、C為半胱氨酸；Cholesterol代表膽固醇、Ac代表乙?；?、NH2代表氨基。上述氨基端保護(hù)基可為乙?；被?、馬來(lái)?；㈢牾；?、叔丁氧羰基或芐氧或其他疏水基團(tuán)或大分子載體基團(tuán)中的任一基團(tuán)；所述羧基端保護(hù)基可為NH2、羧基、酰胺基或叔丁氧羰基或其他疏水基團(tuán)或大分子載體基團(tuán)中的任一基團(tuán)。含有上述多肽的編碼基因，或含有所述編碼基因的重組載體、重組細(xì)胞、重組菌或重組病毒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列2所示衍生多肽的膽固醇修飾物的制備方法，包括以下步驟1)制備氨基酸序列是序列表中序列2的多肽，將序列2的第33位的半胱氨酸殘基與膽固醇通過(guò)硫醚鍵連接得到該膽固醇修飾物。上述多肽、上述衍生多肽、或上述膽固醇修飾物可用于制備如下產(chǎn)品a)抗HIV的產(chǎn)品，如抗下述至少一種毒株的產(chǎn)品HIVgp41自然突變株，包括L33S、L33M、L33V、S35F、Q39R、L54M、Q56K、Q56R、L54M/Q56K、L54M/Q56R和L34M/L54M/Q56R；HIVgp41誘導(dǎo)突變株包括I37Q/V38M、I37Q/V38Q、I37S/V38N和I37V/V38T；HIVgp41野生株；HIV毒株NL4-3；b)治療和/或預(yù)防艾滋病的產(chǎn)品，如藥物或疫苗。CHFI多肽的設(shè)計(jì)原理是基于HIV膜融合的原理，首先設(shè)計(jì)合成可以結(jié)合病毒gp41分子NHR從而反式阻斷CHR與NHR之間相互作用的多肽序列Ac_WNEMI￥EETOKKIEEYTKKIEEILKKSEEQQKC-NH2,然后通過(guò)化學(xué)選擇性極高的成硫醚反應(yīng)對(duì)多肽的C末端進(jìn)行膽固醇分子修飾，目的是使多肽藥物可以與細(xì)胞脂膜上的脂筏(Lipidraft)相互作用，從而提高多肽的靶向性和生物利用度。CHFI由于末端的膽固醇修飾，使其具有細(xì)胞膜靶向性，并可以同時(shí)延長(zhǎng)多肽的半衰期，以提高多肽藥物的抗病毒活性。CHFI多肽序列根據(jù)HIV亞型B標(biāo)準(zhǔn)病毒株NL4-3對(duì)應(yīng)的32個(gè)氨基酸序列而設(shè)計(jì)，對(duì)其中18個(gè)氨基酸(56.25%)進(jìn)行了替代，通過(guò)“鹽橋”作用以增加多肽自身的螺旋穩(wěn)定性和多肽與NHR結(jié)合的能力。同時(shí)，在多肽的C末端引入半胱氨酸(C)，以連接膽固醇分子。本發(fā)明的多肽及其衍生物具有抗病毒活性強(qiáng)、具有靶向性、半衰期長(zhǎng)、水溶性好、易于合成等重要優(yōu)點(diǎn)。圖1為分析型高效液相色譜圖。圖2為CHFI的質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。以下的優(yōu)先實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1.多肽的合成及修飾1.1材料所需化學(xué)試劑均來(lái)自主要的化學(xué)試劑供應(yīng)商，使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化。Rink樹(shù)脂(取代常數(shù)為0.44mmol/g)購(gòu)自天津和成公司。1.2多肽合成所有多肽的合成均采用固相多肽合成法(Fmoc/tBu策略)，由羧基端向氨基端方向手動(dòng)合成。采用N-芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)的氨基酸、采用Rink樹(shù)脂(取代常數(shù)為0.44mmol/g)作為固相載體，用25%(體積百分含量)哌啶的DMF溶液脫除氨基保護(hù)基Fmoc，每次脫除步驟需進(jìn)行兩次，時(shí)長(zhǎng)分別為Smin和lOmin。接肽反應(yīng)選用的縮合方法為DIPC/HOBt法和PyBOP法，氨基酸和活化試劑均采用3倍當(dāng)量，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為1小時(shí)，采用茚三酮定性顯色(Kaiser法)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。若某個(gè)氨基酸縮合反應(yīng)不完全，適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或重復(fù)縮合一次，直至得到所需的目標(biāo)肽段Ac-ffNEMTWEEWEKKIEEYTKKIEEILKKSEEQQKC-NH2o1.3切割及去側(cè)鏈保護(hù)使用切割試劑(三氟乙酸1，2_乙二硫醇苯甲硫醚苯酚H2O三異丙基硅烷=68.5101053.51，ν/ν)將目標(biāo)多肽從樹(shù)脂上裂解下來(lái)并除去側(cè)鏈保護(hù)基(30°C下切割4小時(shí))。濾液加入到大量冷的無(wú)水乙醚中使多肽沉淀析出，離心。用乙醚洗滌數(shù)次后干燥，即得到多肽粗品。1.4膽固醇修飾多肽的合成溴乙酸膽固醇酯的合成參照PaoloIngallinella等人公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行(PaoloIngallinellaetal.ProcNatlAcadSciUSΑ.2009106(14):5801_6)。溴乙酸膽固醇酯通過(guò)化學(xué)選擇性極高的成硫醚反應(yīng)接枝到多肽鏈上，從而得到目標(biāo)分子——膽固醇修飾多肽。具體方法為205毫克按照步驟1.3中方法得到的粗肽(序列為Ac-WNEMTWEEffEKKIEEYTKKIEEILKKSEEQQKC-NH2)溶解于7.5毫升DMS0，向其中加入溶于1毫升THF(三氟乙酸)中的68毫克溴乙酸膽固醇酯，隨后500微升DIEA(二異丙基乙胺)加入到混合溶液中。反應(yīng)1小時(shí)后反應(yīng)完成，得到膽固醇化多肽(Ac-WNEMTffEEffEKKIEEYTKKIEEILKKSEEQQKC+Cholesterol-NH2)。1.5多肽純化及表征采用HPllOO型(美國(guó)安捷倫公司)反相高效液相色譜儀對(duì)步驟1.4制備得到的膽固醇化多肽進(jìn)行成功純化。色譜柱型號(hào)Cosmosil5C4-AR(10X250mm)。色譜操作條件線性梯度洗脫，洗脫液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成。流動(dòng)相A為三氟乙酸和乙腈的水溶液，三氟乙酸的體積百分濃度為0.05%，乙腈的體積百分濃度為2%。流動(dòng)相B為90%(體積百分濃度)乙腈水溶液。線性梯度洗脫由20%B到40%B，時(shí)間20分鐘，洗脫流速為每分鐘25毫升，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220納米。凍干溶劑后得到蓬松狀態(tài)的膽固醇化多肽純品，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由MALDI-T0F質(zhì)譜進(jìn)行表征，而其純度則由分析型高效液相色譜儀(流速每分鐘1毫升)給出。其中，分析型高效液相色譜儀的型號(hào)島津CBM-10AVPPULS，所采用的色譜柱的型號(hào)Agela4.6*250mmClS0色譜操作條件線性梯度洗脫，洗脫液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成。流動(dòng)相A為三氟乙酸和乙腈的水溶液，三氟乙酸的體積百分濃度為0.05%，乙腈的體積百分濃度為2%。流動(dòng)相B為三氟乙酸和乙腈的水溶液，三氟乙酸的體積百分濃度為0.05%，乙腈的體積百分濃度為90%。線性梯度洗脫由25%B到45%B,時(shí)間20分鐘。表1.分析型高效液相色譜的結(jié)果權(quán)利要求1.多肽，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于所述序列1的第1位氨基酸殘基連接有氨基端保護(hù)基，所述序列1的第32位氨基酸殘基連接有羧基端保護(hù)基。3.權(quán)利要求1所述多肽的衍生多肽，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的衍生多肽，其特征在于所述序列2的第1位氨基酸殘基連接有氨基端保護(hù)基，所述序列2的第33位的半胱氨酸殘基連接有羧基端保護(hù)基。5.權(quán)利要求3所述衍生多肽的膽固醇修飾物，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示，其特征在于所述膽固醇修飾物是所述序列2的第33位的半胱氨酸殘基與膽固醇通過(guò)硫醚鍵連接得到的化合物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的膽固醇修飾物，其特征在于所述序列2的第1位氨基酸殘基連接有氨基端保護(hù)基，膽固醇連接有羧基端端保護(hù)基。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽、權(quán)利要求4所述的衍生多肽或權(quán)利要求6所述的膽固醇修飾物，其特征在于所述氨基端保護(hù)基為乙酰基、氨基、馬來(lái)?；㈢牾；⑹宥⊙豸驶蚱S氧；所述羧基端保護(hù)基為NH2、羧基、酰胺基或叔丁氧羰基。8.權(quán)利要求1或3所述多肽的編碼基因，或含有所述編碼基因的重組載體、重組細(xì)胞、重組菌或重組病毒。9.權(quán)利要求5所述的膽固醇修飾物的制備方法，包括以下步驟1)制備氨基酸序列是序列表中序列2的多肽，將序列2的第33位的半胱氨酸殘基與膽固醇通過(guò)硫醚鍵連接得到權(quán)利要求5所述的膽固醇修飾物。10.權(quán)利要求1或2或7所述的多肽、權(quán)利要求3或4或7所述的衍生多肽、或權(quán)利要求5或6或7所述的膽固醇修飾物在制備如下產(chǎn)品中的應(yīng)用a)抗HIV的產(chǎn)品，b)治療和/或預(yù)防艾滋病的產(chǎn)品，如藥物或疫苗。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了膽固醇修飾的抗HIV多肽藥物及其用途。該膽固醇修飾的抗HIV多肽，名稱為CHFI，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示，其中，序列2的第33位的半胱氨酸殘基與膽固醇通過(guò)硫醚鍵連接。本發(fā)明通過(guò)化學(xué)選擇性極高的成硫醚反應(yīng)將溴乙酸膽固醇酯接枝到多肽鏈半胱氨酸的側(cè)鏈上，得到CHFI。CHFI具有抗病毒活性強(qiáng)、具有靶向性、半衰期長(zhǎng)、水溶性好、易于合成等重要優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C07K14/00GK102180951SQ201110112709公開(kāi)日2011年9月14日申請(qǐng)日期2011年5月3日優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日發(fā)明者何玉先,張超,種輝輝申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所