專利名稱：胸腺體液因子THF-γ2及其衍生物，其合成方法及其在抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種胸腺體液因子THF-Y 2的衍生物，具體講，涉及該胸腺體液因子THF- Y 2的衍生物的合成、純化方法及其應用。
背景技術：
胸腺是免疫系統(tǒng)中重要的中樞免疫器官，負責T細胞的分化和成熟。其功能的正常與否和直接影響著機體的健康狀態(tài)。人類在胚胎期間，胸腺是第一個出現(xiàn)的淋巴器官。嬰兒初生時期胸腺約重10 15克，是一生中胸腺相對重量最大的時期。隨著年齡的增長，胸腺逐步成熟，至青春期成長為30 40克，此后，胸腺重量隨年齡老化而逐漸減退。到老年時，胸腺僅重15克左右。胸腺的免疫功能在抗感染、抗腫瘤和自身免疫性疾病中起著重要作用。所以，研究胸腺，尤其是它所分泌的胸腺素對了解某些疾病的發(fā)病機理及其治療極為 重要。胸腺(Thymus) —詞來源于古希臘的Herb和Heart。因此,人們將胸腺看作是機體健康的“心臟”。1901年Laquer等報告了一名重癥肌無力患者伴有胸腺腫瘤。1911年Sauerbruch給患有重癥肌無力的病人做了首例胸腺切除術。自1936年開始,Blalock接連做了幾十例胸腺切除術，成功地治愈了大部分患有重癥肌無力的病人。雖然如此，由于那時人們尚不了解胸腺的功能，仍將它看作是一個多余的器官。此后，越來越多的科學家和醫(yī)生投入到胸腺的研究領域中來，但大都集中于研究胸腺形態(tài)學，直到1966年Goldstein等報告了從小牛胸腺中提純出具有生物活性的物質(zhì)，并命名為胸腺素(Thymosin)，引起免疫學家及科學家的極大興趣，對胸腺深入的研究才廣泛開始?，F(xiàn)已認識到胸腺對于淋巴系統(tǒng)的發(fā)育和維持免疫系統(tǒng)的平衡起著重要作用，它在抗腫瘤免疫，移植免疫及抗微生物感染等作用中地位十分重要。最近的研究顯示，胸腺及胸腺因子通過表達高密度的T細胞受體而促進T細胞的增殖。胸腺與中樞神經(jīng)系統(tǒng)也存在相互調(diào)節(jié)作用，其機理是目前研究的熱點之一 O如今我們所熟知的胸腺因子主要有以下幾類胸腺肽、胸腺素、胸腺噴丁、胸腺刺激素和胸腺體液因子等。THF為從胸腺組織中得到的一種粗制品，具有免疫學活性。在T淋巴細胞亞群的分化、成熟，⑶4+/⑶8+正常比率的維持及在加強脾細胞對有絲分裂原PHA、ConA的反應、對切除胸腺的新塵小鼠的移植排斥反應的恢復等方面起重要作用。同時，THF還可促進T淋巴細胞產(chǎn)生IL-2和TNFa。Burstein等從THF中純化得到了活性組分，命名為THF- Y 2，它含有8個氨基酸，其氨基酸序列為 NH2-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu。胸腺體液因子的粗品(THF)是從胸腺組織中提取得到的混合物，先后通過離心、勻漿并在中性PH狀態(tài)下透析等步驟，最終將分子量控制在IOkDa左右。低分子量的透析液被命名為CT0(calf thymus outer fraction)。在體內(nèi)實驗中，切除胸腺的小鼠給予CTO后能夠減輕其消瘦程度，還能夠促使其恢復正常體重。另有實驗證明，CTO還能在一定程度上通過修復脾細胞的免疫能力，使異源性皮膚或腫瘤移植的排斥反應增強，并且在T細胞對綿陽紅細胞的反應中也能起到輔助作用。Burstein等人又對CTO進行了一系列步驟的純化，他們首先使用凝膠層析方法進行分離，材料為SephadexG-IO和G_25,隨后使用DEAE-Sephadex離子交換色譜在pH 8. O條件下進行氯化鈉梯度洗脫，整個過程都通過一系列的活性實驗對收集到的各成分進行活性測定，得到了活性成分命名為THF-1。該活性成分又經(jīng)由一系列反向色譜的分離步驟，得到了七個中間產(chǎn)物，依次命名為THF-2至THF-8。制備獲得的這些中間產(chǎn)物注射到NTx小鼠體內(nèi)能夠恢復其脾細胞IL-2的活性，在體外實驗中發(fā)現(xiàn)它們能夠在ConA刺激下增強健康小鼠脾細胞IL-2的產(chǎn)量。在分離出THF- Y 2的最終階段，一共得到了九個主要組分，分別命名為 THF-α ,THF-β、THF-Y 2、THF-Y 3、THF-Y 4、THF-Y 5、THF-8、THF- ε 和 THF-Φ。然而在接下來的實驗中發(fā)現(xiàn)，只有THF-Y 2在體內(nèi)和體外實驗中均表現(xiàn)出活性。經(jīng)測定，THF- Y 2是一個八肽，分子量為918Da,其氨基酸序列為NH2/Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe_Leu。這一序列和其它發(fā)表的胸腺因子沒有同源性。 一、THF- Y 2具有免疫促進活性。純品THF-Y 2在體外實驗中能夠提高低IL-2產(chǎn)量的小鼠脾細胞株的IL-Y 2產(chǎn)量，在NTx小鼠的體內(nèi)活性實驗中，THF-Y 2能夠恢復小鼠的脾細胞IL-2產(chǎn)量。對老年免疫低下小鼠使用THF- Y 2治療后，小鼠胸腺T細胞對絲裂原的響應增強，脾細胞的輔助細胞活性增加。研究證明，THF-Y2治療的效果要優(yōu)于胸腺素。在集落刺激因子不足的情況下，將THF- Y 2和普通小鼠的骨髓細胞一起培養(yǎng)，THF- Y 2能夠使骨髓細胞數(shù)量增加。一項研究顯示，THF- Y 2與人臍帶血淋巴細胞在體外培養(yǎng)，THF- Y 2能夠增加細胞⑶4和⑶8分子的表達，在PHA不能充分刺激的條件下THF- Y 2還能增加IL-2的表達。在rGM或rEpo分別存在時，THF- Y 2可以促進骨髓，外周髓和紅細胞祖細胞克隆的增加?；加新砸腋蔚幕颊叩牧馨图毎δ軙憩F(xiàn)出異常，THF- Y 2能夠提高這些患者的IL-2和TNF- α的產(chǎn)量，但是IFN-Y 2的產(chǎn)量不受影響。因此，胸腺體液因子THF-Y 2能夠調(diào)節(jié)骨髓中定向干細胞的功能，還能夠重建和活化T細胞的各項功能。二、THF- Y 2的抗腫瘤活性早期的研究結(jié)果顯示，當THF與小鼠脾細胞和Lewis肺癌細胞混合培養(yǎng)時，THF能夠顯著提高T細胞對腫瘤細胞的細胞毒作用。有研究用荷瘤小鼠來評價THF-Y 2的免疫治療作用，分別使用了四種不同的瘤種，兩種為漿細胞瘤(M0PC-15和RPC-5)，另外兩種為鼠源Lewis肺癌和B16黑素瘤。實驗過程中THF-Y 2治療與化療同時進行。Ben-Efraim及其同事發(fā)現(xiàn)，若僅用5-氟尿嘧啶治療M0PC-315腫瘤只能暫時使腫瘤消退，并不能提升抗腫瘤應答。而用THF- Y 2和5-氟尿嘧啶同時使用時則能延長M0PC-315荷瘤小鼠的存活時間，使CD4+數(shù)量恢復到正常水平，可以增強脾細胞體外對SRBC的抗體應答。但是對于M0PC-315腫瘤的荷瘤小鼠單獨使用THF- Y 2治療沒有上述效果。接受美法蘭治療的M0PC-315荷瘤小鼠具備抗腫瘤反應，但是仍然表現(xiàn)為免疫缺陷。用THF- Y 2繼續(xù)治療這些小鼠能夠改善其免疫缺陷的狀態(tài)，提升細胞的和體液的應答。Ophir和其同事發(fā)現(xiàn)，用免疫接種法和THF- Y 2共同治療RPC-5荷瘤小鼠后，小鼠脾細胞對RPC-5腫瘤細胞的細胞毒作用增加，并且可以增強小鼠脾細胞對抗RPC-5腫瘤的能力。從實驗數(shù)據(jù)得出與單獨使用化療相比，在治療中添加THF-Y 2后在阻止腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移方面效果更優(yōu)；使用THF- Y 2對于化療后免疫活性的恢復能起到很好的作用。三、THF- Y 2抗感染活性由于一般的病毒感染都伴隨著免疫系統(tǒng)的損傷，因此也有人做了實驗來探討THF-Y 2是否能在病毒感染的狀態(tài)下提升胸腺的功能，增強機體抵御病毒感染的能力。該項研究的第一個實驗是THF對Sendai病毒感染小鼠的抗病毒效果實驗。鼻腔內(nèi)感染Sendai病毒后,小鼠會出現(xiàn)體重降低，胸腺退化，肺炎，抗體響應低等癥狀。使用THF治療感染小鼠后，小鼠體重增加，小鼠肺炎感染率降低，抗Sendai病毒抗體滴度升高。之后，研究人員又對感染鼠源巨細胞病毒(MCMV)的小鼠進行了類似的實驗。BALB/c小鼠感染了MCMV后會表現(xiàn)出T細胞免疫損傷，使用THF后這一現(xiàn)象得以緩解。但是THF對于感染病毒 后小鼠干擾素合成和NK細胞毒作用無影響?；赥HF得出的結(jié)果，研究人員又進一步對THF- Y 2進行了類似的活性測定。成年BALB/c小鼠注射環(huán)磷酰胺后對MCMV易感，注射環(huán)磷酰胺后使這些小鼠感染MCMV。感染后的小鼠接受同基因型供體小鼠的脾細胞被動免疫治療。供體小鼠均受過病毒感染并且每天注射THF- Y 2治療。受體小鼠接受THF- Y 2免疫治療后的供體小鼠的脾細胞被動轉(zhuǎn)移治療后，近93%都未出現(xiàn)不治之癥，接受THF-Y 2治療的供體小鼠脾細胞治療，未出現(xiàn)不治之癥的比率僅為38%。THF- Y 2能夠使小鼠因MCMV感染而產(chǎn)生的T細胞⑶4+及⑶8+亞群降低得到恢復，還能夠提高IL-2的分泌產(chǎn)量。特異性地去除⑶4+或⑶8+亞群的數(shù)量會削弱THF- Y 2免疫的脾細胞的效能，這就進一步證明了 THF- Y 2的保護作用和其對⑶4’或⑶8+水平的調(diào)節(jié)作用之間的關系。THF- Y 2治療MCMV的實驗結(jié)果表明，THF- Y 2能夠通過提升T細胞功能提升機體的抗病毒反應性。多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。自從1963年Merrifield成功創(chuàng)立了固相多肽合成方法以來,經(jīng)過不斷的改進和完善，固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成無法比擬的優(yōu)點。其基本原理是先將所要合成肽鏈的羥基末端氨基酸的羥基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組分反應，接長肽鏈。本發(fā)明設計并合成了 THF-Y 2的一系列衍生物，通過藥效試驗篩選，篩選出一種藥效學活性極高的衍生物。下面對本發(fā)明的內(nèi)容進行說明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提供胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供這種胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z的制備方法。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供這種胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z的用途。為了完成本發(fā)明的第一發(fā)明目的，采用的技術方案為本發(fā)明提供一種胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z，該胸腺體液因子THF- Y 2的衍生物Z具有如SEQ ID NO 1所不的氣基酸序列。SEQ ID NO : I 所不的氨基酸序列為 Leu-Glu-Asp-Ala-Pro-Lys-Phe-Leu。本發(fā)明提供一種胸腺體液因子THF- Y 2，具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。SEQ ID NO 2 所不的氨基酸序列為 Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu。為了完成本發(fā)明的第二發(fā)明目的，采用的技術方案為本發(fā)的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物是用化學合成方法進行制備，而后進行分離純化后得到。本發(fā)明該技術方案的第一優(yōu)選技術方案為所述的化學合成方法中米用Fmoc-氨基酸-樹脂，氨基酸側(cè)鏈保護基采用叔丁基，反應過程中采用茚三酮監(jiān)測反應進程。
本發(fā)明該技術方案的第二優(yōu)選技術方案為所述的化學合成方法的制備方法包括以下步驟(I) Fmoc-氨基酸-樹脂的洗滌稱量Fmoc-氨基酸-樹脂，用氮氣吹泡混勻，加入二甲基甲酰胺(DMF)，室溫浸泡20 45分鐘后抽濾，同法重復I 2次；(2)Fmoc的脫除將步驟(I)中的樹脂加入含有30%無水哌啶(PIP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，活化反應2 10分鐘，抽濾，同法重復一次；抽干后用DMF洗漆；(3)縮合反應將步驟⑵中抽干的樹脂加入Fmoc-氨基酸-0H、HBTU，以及N，N_二異丙基乙胺(DIPEA)或N-甲基嗎啉(NMM)溶液中的一種，室溫縮合反應30 60分鐘，氮氣吹泡，抽濾，DMF洗滌；(4)Fmoc的脫除經(jīng)檢測為反應為陽性，將步驟(3)中得到的樹脂加入含有質(zhì)量百分比為30%無水哌啶(PIP)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液反應I 5分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理I 2次，抽干后用DMF洗滌；(5)按照氨基酸序列的順序重復步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復步驟⑵；(6)洗滌，干燥；(7)將步驟(6)得到的樹脂加入酸解液中，充氮氣，封口，室溫攪拌30分鐘 I小時；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用TFA洗滌2 3次，抽濾，合并濾液；(8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮氣吹去TFA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，-20 V保存。本發(fā)明該技術方案的第三優(yōu)選技術方案為在步驟(I)中浸泡的時間為20 40分鐘，優(yōu)選30分鐘。本發(fā)明該技術方案的第四優(yōu)選技術方案為在步驟(2)中活化的時間為5 10分鐘，優(yōu)選5分鐘。本發(fā)明該技術方案的第五優(yōu)選技術方案為在步驟(3)中所述Fmoc-氨基酸-OH和HBTU的重量為步驟(2)中抽干后樹脂重量的4 6倍；DIPEA或NMM溶液的重量為氨基酸量的I. 5 2. 5 ;縮合反應的時間為45 60分鐘，優(yōu)選60分鐘；本發(fā)明該技術方案的第六優(yōu)選技術方案為在步驟(7)中的酸解液為體積比的TFA TIS :水=90 95 2. 5 5 2. 5 5，優(yōu)選體積比為95 2. 5 2. 5的混合溶液。本發(fā)明該技術方案的第七優(yōu)選技術方案為所合成的多肽的純化方法為采用中低壓液相色譜，流動相A 0. I % TFA水溶液；B :用A相配成的80% ACN溶液；檢測波長214nm ;流速ZmLmirT1 ;進樣100 μ I ;梯度洗脫15 40% B 5個柱體積。本發(fā)明制備的胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z通過Edman化學降解法，證實其氨基酸序列為Leu-Glu-Asp-Ala-Pro-Lys-Phe-Leu。本發(fā)明制備的胸腺體液因子THF- Y 2通過Edman化學降解法,證實其氨基酸序列為Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu。本發(fā)明還涉及胸腺體液因子THF- Y 2及其 衍生物在制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理治療及化學治療藥物、抗輻射藥物中的應用。下面對本發(fā)明的內(nèi)容做進一步的說明本發(fā)明設計并合成了胸腺體液因子THF-Y 2的一系列衍生物，通過藥效試驗篩選，篩選出一種藥效學活性極高的衍生物Z。該衍生物的制備方法包括如下步驟(I)Fmoc-AA-樹脂的洗漆稱量O. Immol Fmoc-AA-樹脂,用氮氣吹泡混勻，加入ImL DMF，室溫浸泡30分鐘，抽濾，同法重復I次；(2) Fmoc的脫除將步驟(I)中的樹脂加入30 % PIP/DMF溶液lmL，活化反應5分鐘，抽濾，同法重復一次，抽干后用DMF洗滌5次，每次lmin，反應及洗滌過程均伴隨氮氣吹泡攪拌；(3)縮合將上述抽干的樹脂加入4倍于樹脂取代量的Fmoc-AA-OH和HBTU，及I. 5倍于氨基酸量的DIPEA或NMM溶液，室溫縮合反應30 60分鐘，氮氣吹泡，抽濾，ImL DMF洗漆5次，每次Imin ；(4)檢測取少量樹脂進行茚三酮檢測。若樹脂顯藍色，表示縮合反應未進行完全，需延長時間，或者重新加入活化的保護氨基酸進行反應；若樹脂為淺黃色或無色，表示反應完全，可洗滌并進行下一步反應；(5) Fmoc的脫除經(jīng)檢測為反應為陽性，將上述樹脂加入30% PIP/DMF溶液ImL反應5分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理I次，抽干后用DMF洗滌5次，每次2分鐘；反應及洗滌過程均用氮氣攪拌；(6)按照氨基酸序列的順序重復步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復步驟⑵；(6)洗滌，干燥；(7)將步驟(6)得到的樹脂加入體積比為TFA TIS :水=95 2. 5 2. 5的酸解液中，充氮氣，封口，室溫磁力攪拌I小時；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用TFA洗滌2 3次,抽濾,合并濾液；(8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮氣吹去TFA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，-20 V保存。本發(fā)明制備的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z經(jīng)試驗證實，具有很強的生理活性，并且具有較小的副作用。經(jīng)動物實驗驗證，本發(fā)明的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z具有可促進T淋巴細胞增殖活性，并具有顯著的抑瘤作用及抗輻射作用，可用于制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理治療及化學治療藥物、抗輻射藥物。從T淋巴細胞增殖實驗的結(jié)果可以看出，胸腺體液因子THF-Y 2促T淋巴細胞增殖活性很明顯，劑量為5 μ g · ml/1時刺激指數(shù)達到最高值，胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z顯示出明確的促使T淋巴細胞增殖活性。從未添加ConA組的數(shù)據(jù)中可以看出，胸腺體液因子THF- Y 2及衍生物Z在無ConA刺激下對脾淋巴細胞仍有增殖作用，但這一作用在ConA刺激下表現(xiàn)得更強。從結(jié)構(gòu)上分析，胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z與THF- Y 2的不同點則是將THF- Y 2 中的 Gly 換成了 Ala。T淋巴細胞增殖實驗中我們發(fā)現(xiàn)，如果使用健康小鼠的脾臟進行此項實驗，胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物的結(jié)果均無統(tǒng)計學意義，即使調(diào)整劑量，也沒有得到具有顯著性差異的結(jié)果。而使用免疫力低下的小鼠進行實驗，得到的活性結(jié)果則是很明顯的。本實驗推斷，胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物對于健康機體免疫力的提高作用不明顯，而對于先天免疫缺陷或免疫損傷機體的免疫力恢復作用顯著。體內(nèi)實驗結(jié)果反映出胸腺體液因子THF-Y 2及衍生物Z均具有較顯著的抑瘤作用。胸腺體液因子THF- Y 2在對H22肝癌實體瘤抑瘤實驗中，劑量為O. 25mg · Kg—1時顯示出最強的抑瘤作用，抑瘤率達到47. 2 %，在此劑量上下浮動的抑瘤作用都有所下降。陽性對 照組使用環(huán)磷酰胺，該藥物對于該腫瘤的抑制作用非常明顯，抑瘤率高達91. 7%，但是在實驗中發(fā)現(xiàn)，使用環(huán)磷酰胺后小鼠精神狀態(tài)欠佳，其中一些出現(xiàn)厭食、消瘦等跡象，個別甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。在解剖時對小鼠進行稱重，該重量減去瘤重作為小鼠解剖前的凈重，從以上相應的實驗結(jié)果中可以看出，接受胸腺體液因子THF-Y 2治療的各組以及空白對照組的小鼠體重均與陽性對照組有顯著性差異，各給藥組合對照組之間則未見顯著性差異，而在實驗前分組時各組小鼠的體重均無顯著性差異。胸腺體液因子THF-Y2衍生物Z在對S180實體瘤的抑瘤實驗中，劑量為O. 025mg -Kg-1時顯示出最強的抑瘤作用，抑瘤率為38. 2%。陽性對照組依然使用環(huán)磷酰胺，但在這項實驗中，環(huán)磷酰胺對該腫瘤的抑瘤率較對H22腫瘤抑制率低，為38. 2%，而在實驗前分組時各組小鼠的體重均無顯著性差異的前提下，使用衍生物Z治療的各組及空白對照組解剖前凈重也都與環(huán)磷酰胺組有顯著性差異。由此結(jié)果可知，雖然環(huán)磷酰胺對于腫瘤的抑制作用很強，然而其副作用也是不能忽視的。而合成胸腺體液因子THF- Y 2及衍生物Z對于機體的副作用較小，其作為抗瘤作用藥物的潛力不容小覷。實驗結(jié)果表明，化學合成的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z在體外T淋巴細胞增殖實驗中顯示了良好的活性。胸腺體液因子THF-Y2在時活性最佳。H22體內(nèi)抑瘤實驗，胸腺體液因子THF- Y 2的最佳劑量為O. 25mg · Kg—1 ；S180體內(nèi)抑瘤實驗，胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z的最佳劑量為O. 025mg · Kg'并且通過動物實驗證實，胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z對受輻射小鼠在免疫指標上確有保護作用。本發(fā)明的多肽可采用各種制備方法制備，且并不限于本發(fā)明所述的合成方法。本發(fā)明的多肽可采用任何已知的方法，添加任何已知的藥物輔料，制備成多種劑型，其中優(yōu)選凍干粉針。在應用時，本發(fā)明多肽每天的合適劑量范圍為0.001 3mg/Kg體重，優(yōu)選為O. 01 2mg/Kg體重。上述劑量可以一個劑量單位或分成幾個劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。本發(fā)明還可也其他藥物聯(lián)用或者形成藥物組合物，以達到更好的治療效果。當本發(fā)明的多肽與其它治療藥物存在協(xié)同作用時，應根據(jù)實際情況調(diào)整它的劑量。


圖I為胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z制備后經(jīng)純化后的HPLC色譜圖；圖2為胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z的質(zhì)譜圖。圖3為胸腺體液因子THF- Y 2制備后經(jīng)純化后的HPLC色譜圖；圖4為胸腺體液因子THF- Y 2的質(zhì)譜圖。本發(fā)明的具體實施方式
僅限于進一步的解釋和說明本專利，并不對本專利的內(nèi)容構(gòu)成限制。本發(fā)明所用試劑均為市售，所采用的儀器為一般實驗室常備儀器。
具體實施方式
實施例I胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z的化學合成(I)Fmoc-氨基酸-樹脂的洗漆稱量O. Immol Fmoc-氨基酸-樹脂,用氮氣吹泡混勻，加入ImLDMF,室溫浸泡20分鐘后抽濾，同法重復I次；(2) Fmoc的脫除將步驟(I)中的樹脂加入含有30% PIP的DMF溶液lmL，活化反應2分鐘，抽濾，同法重復一次；抽干后用Iml的DMF洗滌5次，每次lmin，反應及洗滌過程均伴隨氮氣吹泡攪拌；(3)縮合反應將步驟⑵中抽干的樹脂加入Fmoc-氨基酸_0H、HBTU、DIPEA，室溫縮合反應30分鐘，氮氣吹泡，抽濾，Iml DMF洗滌5次，每次I分鐘；所述Fmoc-氨基酸-OH和HBTU的重量為抽干后樹脂重量的4倍；DIPEA溶液的重量為氨基酸量的I. 5倍；(4)Fmoc的脫除茚三酮檢測為反應為陽性，洗滌，將步驟(3)中得到的樹脂加入含有質(zhì)量百分比為30% PIP的DMF溶液ImL反應I分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理I 2次，抽干后用DMF洗滌4次，每次2分鐘；反應及洗滌過程均用氮氣攪拌；反應后取少量樹脂進行茚三酮檢驗；(5)按照氨基酸序列的順序重復步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復步驟⑵；(6)加入二氯乙烷1ml，洗滌5次，每次I分鐘，甲醇2ml洗滌5次，每次I分鐘，最后一次保持10分鐘；用錫紙及PARA膜封閉多肽反應管口，真空干燥I小時；(7)將步驟(6)得到的樹脂加入酸解液中，充氮氣，封口，室溫攪拌30分鐘；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用2 3ml TFA洗滌2 3次，抽濾，合并濾液；酸解液為體積比的 TFA TIS 水=90 2. 5 2. 5 ；(8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮氣吹去TFA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，-20 V保存。所合成的多肽的純化方法為采用中低壓液相色譜，流動相A 0. I % TFA水溶液；B :用A相配成的80% ACN溶液；檢測波長214nm ;流速ZmLmirT1 ;進樣100 μ I ;梯度洗脫15 40% B 12個柱體積。圖I為胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z制備后經(jīng)純化后的HPLC色譜圖；圖2為胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z的質(zhì)譜圖；圖3為胸腺體液因子THF- Y 2制備后經(jīng)純化后的HPLC色譜圖4為胸腺體液因子THF- Y 2的質(zhì)譜圖。 實施例2胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z的化學合成(I) Fmoc-氨基酸-樹脂的洗滌稱量Fmoc-氨基酸-樹脂，用氮氣吹泡混勻，加入Iml DMF,室溫浸泡45分鐘后抽濾，同法重復2次；(2) Fmoc的脫除將步驟⑴中的樹脂加入含有30% PIP的DMF溶液1ml，活化反應10分鐘，抽濾，同法重復一次；抽干后用Iml DMF洗滌5次，每次I分鐘；反應及洗滌過程均伴隨氮氣吹泡攪拌；(3)縮合反應將步驟⑵中抽干的樹脂加入Fmoc-氨基酸-0H、HBTU，以及NMM溶液，室溫縮合反應60分鐘，氮氣吹泡，抽濾，Iml DMF洗滌5次，每次I分鐘；所述Fmoc-氨基酸-OH和HBTU的重量為抽干后樹脂重量的6倍；NMM溶液的重量為氨基酸量的2. 5倍；(4)Fmoc的脫除經(jīng)茚三酮檢測為反應為陽性，洗滌，將步驟(3)中得到的樹脂加 入含有質(zhì)量百分比為30% PIP的DMF溶液反應5分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理2次，抽干后用DMF洗滌5次，每次2分鐘；反應及洗滌過程均用氮氣攪拌；反應后取少量樹脂進行茚三酮檢驗；(5)按照氨基酸序列的順序重復步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復步驟⑵；(6)加入二氯乙烷1ml，洗滌5次，每次I分鐘，甲醇2ml洗滌5次，每次I分鐘，最后一次保持10分鐘；用錫紙及PARA膜封閉多肽反應管口，真空干燥I小時；(7)將步驟(6)得到的樹脂加入酸解液中，充氮氣，封口，室溫攪拌30分鐘 I小時；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用2 3ml TFA洗滌2 3次，抽濾，合并濾液；酸解液為體積比的TFA TIS :水=95 2. 5 2. 5的混合溶液。(8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮氣吹去TFA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，-20 V保存。所合成的多肽的純化方法為采用中低壓液相色譜，流動相A 0. I % TFA水溶液；B :用A相配成的80% ACN溶液；檢測波長214nm ;流速ZmLmirT1 ;進樣100 μ I ;梯度洗脫15 40% B 5個柱體積。所制備得到的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z經(jīng)高效液相色譜、質(zhì)譜分析，所得的圖譜與圖I 4相似。實施例3胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z的化學合成(I)Fmoc-氨基酸-樹脂的洗滌稱量Fmoc-氨基酸-樹脂，用氮氣吹泡混勻，加入二甲基甲酰胺(DMF)，室溫浸泡30分鐘后抽濾，同法重復I次；(2) Fmoc的脫除將步驟(I)中的樹脂加入含有30% PIP的DMF溶液，活化反應5分鐘，抽濾，同法重復一次；抽干后用DMF洗滌5次，每次I分鐘；反應及洗滌過程均伴隨氮氣吹泡攪拌；(3)縮合反應將步驟(2)中抽干的樹脂加入Fmoc-氨基酸_0H、HBTU、DIPEA溶液中，室溫縮合反應60分鐘，氮氣吹泡，抽濾，Iml DMF洗滌5次，每次I分鐘；所述Fmoc-氨基酸-OH和HBTU的重量為抽干后樹脂重量的5倍；DIPEA溶液的重量為氨基酸量的I. 5倍；(4)Fmoc的脫除經(jīng)茚三酮檢測為反應為陽性，將步驟(3)中得到的樹脂加入含有質(zhì)量百分比為30% PIP的DMF溶液反應5分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理I 2次，抽干后用DMF洗滌5次，每次2分鐘；反應及洗滌過程均用氮氣攪拌；反應后取少量樹脂進行茚
二酮檢驗；(5)按照氨基酸序列的順序重復步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復步驟⑵；(6)加入二氯乙烷1ml，洗滌5次，每次一分鐘，甲醇2ml洗滌5次，每次I分鐘，最后一次保持10分鐘；用錫紙及PARA膜封閉多肽反應管口，真空干燥I小時；(7)將步驟(6)得到的樹脂加入酸解液中，充氮氣，封口，室溫攪拌I小時；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用2 3ml的TFA洗滌2次，抽濾，合并濾液；酸解液為體積比的TFA TIS 水=95 2.5 2. 5 的混合溶液。(8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮氣吹去TFA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀 的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，-20 V保存。所合成的多肽的純化方法為采用中低壓液相色譜，流動相A 0. 1% TFA水溶液；B :用A相配成的80% ACN溶液；檢測波長214nm ;流速2mL · mirT1 ;進樣100 μ I ;梯度洗脫15 40% B 5個柱體積。所制備得到的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z經(jīng)高效液相色譜、質(zhì)譜分析，所得的圖譜與圖I 4相似。實施例4胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z的化學合成(I)Fmoc-氨基酸-樹脂的洗滌稱量Fmoc-氨基酸-樹脂，用氮氣吹泡混勻，加入二甲基甲酰胺(DMF)，室溫浸泡40分鐘后抽濾，同法重復2次；(2) Fmoc的脫除將步驟(I)中的樹脂加入含有30% PIP的DMF溶液，活化反應8分鐘，抽濾，同法重復一次；抽干后用DMF洗滌；反應及洗滌過程均伴隨氮氣吹泡攪拌；(3)縮合反應將步驟⑵中抽干的樹脂加入Fmoc-氨基酸-0H、HBTU，以及DIPEA溶液，室溫縮合反應45分鐘，氮氣吹泡，抽濾，Iml DMF洗滌5次，每次2分鐘；所述Fmoc-氨基酸-OH和HBTU的重量為抽干后樹脂重量的4. 5倍；DIPEA溶液的重量為氨基酸量的I. 5倍;(4)Fmoc的脫除經(jīng)茚三酮檢測為反應為陽性，洗滌，將步驟(3)中得到的樹脂加入含有質(zhì)量百分比為30% PIP的DMF溶液反應5分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理2次，抽干后用DMF洗滌；反應及洗滌過程均用氮氣攪拌；(5)按照氨基酸序列的順序重復步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復步驟⑵；(6)加入二氯乙烷1ml，洗滌5次，每次I分鐘，甲醇2ml洗滌5次，每次I分鐘，最后一次保持10分鐘；用錫紙及PARA膜封閉多肽反應管口，真空干燥I小時；(7)將步驟(6)得到的樹脂加入酸解液中，充氮氣，封口，室溫攪拌30分鐘 I小時；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用2 3ml TFA洗滌3次，抽濾，合并濾液；酸解液為體積比的TFA TIS :水=90 5 2. 5的混合溶液。(8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮氣吹去TFA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，-20 V保存。所合成的多肽的純化方法為采用中低壓液相色譜，流動相A 0. 1% TFA水溶液；B :用A相配成的80% ACN溶液；檢測波長214nm ;流速2mL · mirT1 ;進樣100 μ I ;梯度洗脫15 40% B 5個柱體積。所制備得到的胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物Z經(jīng)高效液相色譜、質(zhì)譜分析，所得的圖譜與圖I 4相似。實驗例I一、實驗材料I. I樣品來源及前處理取實施例3制備的胸腺體液因子THF-Y 2和衍生物Z凍干品各取適量，分別用Hanks液配制并稀釋成適當濃度,分裝備用。I. 2材料與儀器
實驗動物昆明小鼠，體重20 22g ；中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供。瘤細胞中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供。主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)液北京天象鑫隆技術有限公司生產(chǎn)環(huán)磷酰胺山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)批號14023686Hanks液現(xiàn)用現(xiàn)配、I. 8% NaCl溶液、純水等主要儀器CO2 培養(yǎng)箱FormaScientific333 型酶標儀METERTECHΣ 960 型，臺灣 METERTECH 公司其它96孔細胞培養(yǎng)板(圓底)等。二、實驗方法2. I動物模型的建立取接種于小鼠腹腔第7天的S180肉瘤和H22肝癌腫瘤配成瘤胞懸液分別接種于同種試驗組鼠前肢腋窩皮下，每鼠接種IO6個瘤細胞mL-1的細胞懸液O. 2mL。2. 2T淋巴細胞增殖實驗(MTT)法取接種S180肉瘤瘤細胞一周，接種成功的昆明鼠I.小鼠眼球摘除放血；2.取脾臟，在Hanks液中洗滌兩次，取出剪碎，加入適量Hanks液；3.過濾，收集濾液，分裝于小試管中；4.離心，lOOOrpm，IOmin ;5.棄上清，加入少量Hanks液，將細胞懸起后加入3mL純水，混勻，靜置一分鐘左右加入3mLl. 8% NaCl溶液，混勻，再次離心；6.棄去上清，觀察紅細胞破碎狀況，如需要，重復第5步；7.加入1640培養(yǎng)液，將細胞懸起，細胞計數(shù)；8.將細胞稀釋，用排槍向96孔細胞板內(nèi)加入100 μ L細胞，每孔IO5個；9.加入IOOmL樣品，混勻，空白孔加入Hanks液，每種濃度設6個平行孔，其中3孔含 ConAlO μ g · mL S 每孑L 50 μ L ；10.放入37 V CO2孵箱中孵育72h，終止孵育前4h，每孔加入5mg · mL—1 MTT20 μ L；
11.細胞培養(yǎng)結(jié)束后加二甲基亞砜200yL，待紫色結(jié)晶全部溶解后用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm處測OD值。2. 3體內(nèi)實驗第O天接種動物，第I天檢查培養(yǎng)情況，如無污染，則將動物稱重并隨機均勻分組進行實驗。劑量設置根據(jù)量效曲線設高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性對照組、對照組。THF-Y 2 高、中、低劑量組分別為 O. 25mg .kg'O· 125mg · kg'O. 0625mg · kg4，衍生物 Z 高、中、低劑量組分別為O. 025mg · kg'O. 0125mg · kg'O. 00625mg · kg-1,陽性對照環(huán)磷酰胺給藥劑量20mg · kg_S空白對照組給予生理鹽水，給藥體積均為O. lmL/10g。
皮下注射給藥，陽性對照組環(huán)磷酰胺一次性給藥；其他組每天給藥一次，連續(xù)14天。第十四天稱體重，解剖并稱量瘤重。三、檢測指標及計算方法T淋巴細胞增殖實驗結(jié)果，依下式判定受試藥物對淋巴細胞的增殖效果，以刺激指數(shù)SI (stimulationindex)表示增殖強度SI =試驗孔OD值/對照孔OD值(I)體內(nèi)抑瘤實驗結(jié)果，抑瘤率計算公式為抑瘤率=[(空白對照組瘤重-給藥組瘤重)/空白對照組瘤重]X 100% (2)抑瘤率需大于30%評定為抗腫瘤作用明確。實驗結(jié)果用MicrosoftExcel軟件處理,計算給藥后抑瘤率及x 土 s,以t檢驗考察組間的顯著性差異。四、實驗結(jié)果4. IT淋巴細胞增殖實驗(MTT)法每個濃度下，加ConA與不加ConA組分別平行三孔，測量其OD值后取其平均值。結(jié)果表明，THF- Y 2及其衍生物Z具有使T淋巴細胞增殖的活性。添加ConA后，從OD值結(jié)果可以看出，除8. OOX 10_3 μ g · ι Γ1外，THF- Y 2各劑量組與空白組相比均有顯著性差異；未添加ConA的情況下，除8. 00 X 1(Γ3與4. 00 X 1(Γ2 μ g πιΓ1濃度組外，各劑量組與空白組相比均有顯著性差異，THF-Υ 2劑量在左右時表現(xiàn)出的活性最佳(見表I)。衍生物Z各組OD值與相應空白對照組相比均有顯著性差異(見表2)。按公式(I)計算出各化和物的刺激指數(shù)(SI)，結(jié)果如下(見表3、4)。表ITHF- Y 2對T細胞增殖實驗的影響(x 土 s)齊Li量(pg.mL·1) Non-ConA stimulated(n=3)ConA stimulated(n=3)
8.00X10'3 0.089±0.0140.089±0.014
4.00xl0-2 0.111±0.0080.169±0.011***
2.00xl0_1 0.157±0.020**0.463±0.030***
1.000.267±0.020***1.243±0.052***
5.000.735±0.022***1.766±0.098***
25.000.386±0.033***1.298±0.101*** 125 0.373±0.071**1.056±0.019*** 625 0.233±0.044**0.789±0.016*** 空白 0.091±0.0100.118±0.005與空白對照組比較** P < 0. 01 ；*** P < 0.001.表2 :衍生物Z對T細胞增殖實驗的影響(X 土 s)
齊Li量(pg.mL·1) Non-ConA stimulated(n=3)ConA stimulated(n=3)
3.2χ10'2 0.342±0.016***0.263±0.024**
Ι. χΙΟ'1 0.704±0.061***0.821±0.011***
0.8 0.712±0.012***0.851±0.034***
4.000.981±0.030***1.118±0.017***
20 1.347±0.031***1.405±0.008***
100 1.479±0.071***1.558±0.042***
500 1.685±0.056***1.664±0.017***
空白 0.167±0.0260.173±0.024與空白對照組比較** Ρ < O. 01 ；*** Ρ < O.001.表3 :衍生物Z對T淋巴細胞的刺激指數(shù)
劑量(pg.mL—1)SI (Z)
0.0321.520.164.75
0.84.92
4.006.46
208.12
1009.01
5009.62表4 THF- Y 2對T細胞刺激指數(shù)(SI)
劑量(pg.mL·1)SI
8.OOxlO-30.813
4.00χ10_21.43
2.00χ10_13.92
1.0010.5
5.0015.0
25.0011.0 125 8.95 625 6.694. 2體內(nèi)實驗在體內(nèi)實驗中，THF-Y 2和衍生物Z顯示出很好的抗瘤作用。THF-Y 2在對H22實體瘤抑瘤實驗中，各組瘤重與空白對照組相比均有顯著性差異，劑量為O. 25mg -Kg-1時活性最高，解剖時給藥組及空白對照組小鼠除去腫瘤后的凈重與陽性對照組相比均有顯著性差異。從計算所得的抑瘤率數(shù)值來看，高劑量組抑瘤效果最佳，抑瘤率為47. 2% (結(jié)果見表5)。表5 THF- Y 2對H22實體瘤的抑瘤作用(η = 10)
組別給藥前體重(g) 瘤重(g)給藥后體重(體重-瘤重)(g) 抑瘤率％
高劑量組 20.82±0.531.120±0.347*** 31.90±3.25**47.2
中劑量組 20.61±0.611.296±0.161**31.27±3.25*38.9
低劑量組 20.88±0.591.478±0.342*31.28±3.2330.3
陽性對照組 20.75±0.600.176±0.086*** 27.82±2.5691.7
空白對照組 20.83±0.722.122±0.84431.54±3.71**—瘤重于空白對照組比較給藥后(體重-瘤重)與陽性對照組比較％P <0.05;** P < O. 01 ；*** P < O. 001.在衍生物Z在S180實體瘤抑瘤實驗中，高、中劑量組瘤重與空白對照組相比有顯著性差異，劑量為O. 025mg · Kg—1時活性最高，解剖時給藥組和空白對照組小鼠除去腫瘤后的凈重與陽性對照組相比均有顯著性差異。從計算所得的抑瘤率數(shù)值來看，高劑量組抑瘤效果最佳，抑瘤率為38. 2% (結(jié)果見表6)。表6 :衍生物Z對S180實體瘤的抑瘤作用(η = 10)
組別給藥前體重(g) 瘤重(g)給藥后體重(體重-瘤重)(g) 抑瘤率％
高劑量組20.04±0.64 1.592±0.267** 30.41±2.09**38.2
中劑量組20.08±0.88 1.647±0.341*30.19±1.51*36.1
低劑量組19.90±0.60 1.955±0.36230.19±2.62*24.2 陽性對照組 20.75±0.60 1.593±0.0.059** 26.61±2.4838.2
空白對照組 20.22±0.69 2.578±0.72230.55±3.23*—瘤重與空白對照組比較；給藥后(體重-瘤重)與陽性對照組比較％P <0.05;** P < O. 01 ；*** P < O. 001.五、討論實驗結(jié)果表明，化學合成的THF- Y 2及其衍生物Z在體外T淋巴細胞增殖實驗中顯示了良好的活性。THF- Y 2在5 μ g · mL—1時活性最佳。H22體內(nèi)抑瘤實驗，THF- Y 2的最佳劑量為O. 25mg · Kg-1 ；S180體內(nèi)抑瘤實驗，衍生物Z的最佳劑量為O. 025mg · Kg-1。實驗例2THF- Y 2及其衍生物Z的抗輻射作用所用材料和儀器龍膽紫(北京惠澤奧公司)，印度墨水(北京篤信精細制劑廠)，環(huán)磷酰胺(山西泰盛制藥有限公司)，實驗例3制備的胸腺體液因子THF- Y 2衍生物Z，鈷源(軍科院北京放射醫(yī)學研究所)，顯微鏡(CH20BMF 200, Olympus)，分光光度計(UV-2550，SHIMADZU)。所用的方法I、白細胞計數(shù)白細胞稀釋液取冰醋酸I. 5mL和1%龍膽紫lmL，混勻，加蒸餾水至lOOmL。(I)在小試管中加O. 38mL白細胞稀釋液；(2)從鼠尾取血，用吸管準確吸血20 μ L，擦凈吸管外沾附的血液。(3)迅速將血輕輕放入上述小試管中，并用上清液洗吸管2 3次，搖勻。(4)將白細胞混懸液滴入計數(shù)池內(nèi)，靜置2 3分鐘，待白細胞下沉后計數(shù)。(5)在低倍鏡下，白細胞呈圓形，漿透亮，核呈紫黑色，稍有折光，借此特點可與雜質(zhì)相區(qū)別。計數(shù)池四角的4個大方格中所有的白細胞數(shù)，將總數(shù)乘以50，即得每Imm3血中白細胞數(shù)。計算原理每個大方格面積為1mm3，計數(shù)池深度為O. 1mm，血稀釋20倍,故每Imm3血中白細胞數(shù)為4個大方格的白細胞數(shù)X10X20 + 4。2、碳粒廓清法操作步驟體重18 22g小白鼠，雌雄各半，隨機分為實驗組與對照組，分別給與藥物和溶劑。實驗時每鼠尾靜脈注射印度墨汁O. 05mL/10g體重，于I U1)和5 (t2)分鐘后，分別從眼眶靜脈取血20 μ L，加到2ml、0. 1% Na2CO3溶液中搖勻，用分光光度計在680nm比色，測光密度。3、結(jié)果昆明鼠17± lg，10只/組，雌雄各半。650拉德Co60照射，照射率236. I倫/分，照射時間為2分鐘39. 4秒。陰性對照組每天皮下注射O. ImL生理鹽水，給藥組I每天皮下注射不同劑量的THF- Y 2衍生物Z (實施例I制備)0. 5 μ g/只、5 μ g/只、50 μ g/只；給藥組2每天皮下注射不同劑量的THF- Y 2 (實施例I制備):0. 5μ g/只、5 μ g/只、50 μ g/只。陽性對照物為尼爾雌醇，一次性灌胃取尼爾雌醇2片(2mg)，碾碎，加4mL水，力口O. 5%羧甲基纖維素鈉(CMC)，攪勻，灌胃O. ImL/只，即O. 05mg/只。
一周后檢測血液白細胞總數(shù)，碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)，胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。用T檢驗比較給藥組與陰性對照組的差異顯著性。結(jié)果如表7所示表7 =THF- Y 2衍生物Z抗輻射作用的指標檢測
組別體重增加白細胞個數(shù)廓清指數(shù)K 吞噬指數(shù)α胸腺指數(shù)脾指數(shù)
(g)(個/mm3)(mg/10g)(mg/10g)
未輻射 5.76*5948**0.0415.5632.56**82.21**
陰性對照 3.579360.0417.6520.6618.67
陽性對照 3.342578**0.0336.1228.54*8.76**
0.5μ§4.081467**0.0537.76*25.25*13.85*
5μδ4.751821**0.063**8.25**26.85**11.58**
50μδ2.46*1818**0.063*8.32*26.34**10.65** Ρ < O. 05 ；** Ρ < O. 01.表8 THF- Y 2抗輻射作用的指標檢測
組別體重增加白細胞個數(shù)廓清指數(shù)K 吞噬指數(shù)α胸腺指數(shù)脾指數(shù)
(g)(個/mm3)(mg/10g)(mg/10g)
未輻射5.35*5658**0.0435.4532.89**83.23**
陰性對照3.869570.0437.5620.6818.67
陽性對照3.432534**0.0306.2528.67*8.23**
0.5pg4.121489**0.0537.65*25.34*13.75*
5pg4.641865**0.061**8.21**25.95**12.32**
50μδ2.51*1834**0.061*8.23*26.76**10.56** Ρ < O. 05 ；** Ρ < O. 01.表7、表8的結(jié)果表明，給藥組與陽性對照組相比，白細胞總數(shù)明顯增大，具有統(tǒng)計意義，給藥組的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)也明顯提高，其中5μ g組和50 μ g組具有顯著性。給藥組的胸腺指數(shù)也有所提高，其中50 μ g組具有顯著性。THF- Y 2及其衍生物Z對受輻射小鼠在免疫指標上確有保護作用。實驗例3對受輻射小鼠存活率的影響昆明鼠20± lg，20只/組，雌雄各半。分別用600拉德和700拉德Co60照射，照射率246. 72倫/分。陰性對照每天皮下注射O. ImL生理鹽水，給藥組每天皮下注射不同劑量的THF- Y 2衍生物Z :0. 5 μ g/只，5 μ g/只，50 μ g/只，200 μ g/只。兩周后停藥，繼續(xù)觀察，到30天為止。陽性對照組為尼爾雌醇，一次性灌胃，取尼爾雌醇2片(2mg)，碾碎，加4mL水，力口0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)，攪勻，灌胃O. ImL/只，即O. 05mg/只。結(jié)果表明，Co60照射后，皮下注射THF-Y 2衍生物Z明顯降低了小鼠的死亡率。無論是在較低輻射劑量600拉德，還是較高輻射劑量700拉德，THF- Y 2衍生物Z都對小鼠有保護作用。 表9 =THF- Y 2對受輻射小鼠在6. OGy照射下的影響
組別存活率％存活天數(shù)％
陰性對照3021.6
陽性對照5524.6
0、g5026.7
5 pg6027.8
5(^g6526.4
20(^g 5523.8表10 THF- Y 2對受輻射小鼠在7. OGy照射下的影響
組別存活率存活天數(shù)
陰性對照1014.7
陽性對照3022.6
0.5pg3020.4
5pg5025.7
5(^g5023.8
20(^g2521.4表11 :THF_ y 2衍生物Z對受輻射小鼠在6. OGy照射下的影響組別存活率％存活天數(shù)％
陰性對照3021.6
陽性對照5524.6
0.5μg5026.3
5pg6028.2
50μg6525.5
200μg6023.4表12 =THF- Y 2衍生物Z對受輻射小鼠在7. OGy照射下的影響
組別存活率存活天數(shù)
陰性對照1014.7
陽性對照3022.6
0、g3022.1
5pg5024.5
5(^g5525.3
20(^g2523.5從上表可以看到，本發(fā)明的THF- Y 2及其衍生物Z對于輻射照射的小鼠具有明顯的保護作用。
權(quán)利要求
1.一種胸腺體液因子THF- Y 2及其衍生物，其特征在于，胸腺體液因子THF- Y 2的衍生物Z具有如SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，胸腺體液因子THF-Y 2具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求I所述的胸腺體液因子THF-Y 2及其衍生物Z的制備方法，其特征在于，采用化學合成方法進行制備然后進行分離純化后得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的化學合成方法中采用Fmoc-氨基酸-樹脂，氨基酸側(cè)鏈保護基采用叔丁基，反應過程中采用茚三酮監(jiān)測反應進程。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的化學合成方法的制備方法包括以下步驟 (1)Fmoc-氨基酸-樹脂的洗滌稱量Fmoc-氨基酸-樹脂，用氮氣吹泡混勻，加入DMF室溫浸泡20 45分鐘后抽濾，同法重復I 2次； (2)Fmoc的脫除將步驟(I)中的樹脂加入含有30% PIP的DMF溶液，活化反應2 10分鐘，抽濾，同法重復一次；抽干后用DMF洗滌； (3)縮合反應將步驟(2)中抽干的樹脂加入Fmoc-氨基酸-OH、HBTU,以及DIPEA或NMM溶液中的一種，室溫縮合反應30 60分鐘，氮氣吹泡，抽濾，DMF洗滌； (4)Fmoc的脫除經(jīng)檢測為反應為陽性，將步驟(3)中得到的樹脂加入含有質(zhì)量百分比為30% PIP的DMF溶液反應I 5分鐘，抽濾，再以同樣的方法處理I 2次，抽干后用DMF洗漆; (5)按照氨基酸序列的順序重復步驟(2) (4)，直至氨基酸合成完畢，最后一步重復步驟⑵； (6)洗漆，干燥； (7)將步驟(6)得到的樹脂加入酸解液中，充氮氣，封口，室溫攪拌30分鐘 I小時；將樹脂酸解液抽濾，收集濾液，用TFA洗滌2 3次，抽濾，合并濾液； (8)將濾液轉(zhuǎn)移至另一容器，氮氣吹去TFA，逐滴加入冷乙醚沉淀多肽，收集沉淀的多肽，放入砂板布氏漏斗，用乙醚或者離心法洗滌，吹干，_20°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，在步驟(I)中浸泡的時間為20 40分鐘，優(yōu)選30分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中活化的時間為5 10分鐘，優(yōu)選5分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，在步驟(3)中所述Fmoc-氨基酸-OH和HBTU的重量為步驟(2)中抽干后樹脂重量的4 6倍；DIPEA或NMM溶液的重量為氨基酸量的I. 5 2. 5 ;縮合反應的時間為45 60分鐘，優(yōu)選60分鐘；
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，在步驟(7)中的酸解液為體積比為TFA TIS :水=90 95 2. 5 5 2. 5 5，優(yōu)選體積比為95 2. 5 2. 5的混合溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所合成的多肽的純化方法為采用中低壓液相色譜，流動相A 0. 1% TFA水溶液；B :用A相配成的80% ACN溶液；檢測波長214nm ;流速2mL · mirT1 ;進樣:100 μ I ;梯度15 40% B 5個柱體積。
10.權(quán)利要求I所述的胸腺體液因子THF-Y 2及其衍生物Z在制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理 治療及化學治療藥物、抗輻射藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胸腺體液因子THF-γ2及其衍生物Z，胸腺體液因子THF-γ2衍生物Z具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明中的胸腺體液因子THF-γ2及其衍生物Z采用化學合成方法進行制備，而后進行分離純化后得到。本發(fā)明還涉及其化學合成方法及分離方法。經(jīng)動物實驗驗證，本發(fā)明的胸腺體液因子THF-γ2衍生物Z具有可促進T淋巴細胞增殖活性，并具有顯著的抑瘤作用及抗輻射作用，本發(fā)明還涉及了該衍生物在制備抗腫瘤藥物、腫瘤物理治療及化學治療藥物、抗輻射藥物中的應用。
文檔編號C07K1/06GK102875645SQ20111019542
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者徐康森, 王悅, 樂嘉靜, 李湛軍 申請人:中國生化制藥工業(yè)協(xié)會