人源化ctla-4抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抑制CTLA4結(jié)合人B7的CTLA4抗體，具體地，其抑制CTLA4結(jié)合人B7.1和/或人B7.2。提供了具有特異性可變區(qū)序列的特異性抗體以及含這種抗體的組合物用于治療疾病。
【專利說明】人源化CTLA-4抗體
[0001]本發(fā)明涉及使用抗人CTLA4的新人源化抗體治療和預防人類疾病，以及使用這些抗體治療或預防人類疾病的方法。
【背景技術】
[0002]脊椎動物免疫系統(tǒng)需要多層次的分子和細胞相互作用以實現(xiàn)最佳的免疫應答。具體地，T淋巴細胞(T細胞)的激活是許多這種應答的重要組成部分?？乖蔬f細胞(APC)可以通過將抗原經(jīng)由主要組織相容性復合物(MHC)分子攜帶的肽呈遞至TCR (T細胞受體)來激活T細胞。這種激活還需要APC的共刺激。將非特異性的共刺激信號遞送至T細胞需要至少兩個在APC上發(fā)現(xiàn)的同源B7家族成員B7-1 (也稱為Β7、Β7.I或⑶80)和Β7-2 (也稱為Β7.2或⑶86)，兩者都可在與T細胞上⑶28抗原結(jié)合時遞送共刺激信號，導致T細胞激活。CD28是免疫球蛋白(Ig)超家族的同源二聚體糖蛋白成員，其具有單個細胞外可變區(qū)，并且其存在于大多數(shù)成熟的人T細胞上。
[0003]被稱為CTLA4 (細胞毒性淋巴細胞相關抗原，也稱為⑶152)的⑶28同系物，發(fā)現(xiàn)于1987年(Brunet et al., (1987)Nature328:267-270)，其與細胞毒性T細胞尤其相關。與⑶28 —樣，CTLA4是Ig超家 族的成員并且包含單個細胞外Ig結(jié)構域。然而，CTLA4的作用主要是抑制T細胞激活，這顯示在患有大規(guī)模淋巴組織增生的CTLA4缺陷小鼠中(Chamberset al.，(1997) Immunity.7:8855-8959)。此外，表明了阻斷 CTLA4 可在體外(Walunas etal., (1994)) Immunity.1:405-413)和體內(nèi)(Kearney (1995) J.1mmunol.155:1032-1036)增強T細胞應答，還可增加抗腫瘤免疫力(Leach (1996) Science.271:1734-1736)。因此，阻斷CTLA4可提供其中免疫刺激可能有益的疾病尤其是人類疾病的新療法，例如治療癌癥和傳染性疾病的新療法。
[0004]CTLA4功能的阻斷劑的開發(fā)專注于使用單克隆抗體，尤其是來源于移入編碼人免疫球蛋白的基因(并且宿主小鼠免疫球蛋白基因缺陷)的轉(zhuǎn)基因小鼠的抗體。正在講行臨床試驗的這些抗體包括IgGl同種型的易普利姆瑪(Ipilimumab) (Keler etal., J Tmmunol171:6251-6259 (2003))和 IgG2 同種型的 Tremelimumab (Ribas etal., Oncologists:873-883 (2005) )0雖然通常報道免疫原性是低的(誘導針對注入的人單克隆抗體的抗體)，但是值得注意的是這種人抗體由于體細胞突變和可變區(qū)序列中的重排(可能產(chǎn)生T細胞表位)而可在某些患者中誘導免疫原性，導致副作用和療效缺乏。因此，需要改進的具有可能更低免疫原性的CTLA4單克隆抗體，以更有效地治療人類疾病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明涉及特異性結(jié)合人CTLA4的新人源化抗體。本發(fā)明還提供了其中結(jié)合人CTLA4可抑制人CTLA4結(jié)合人B7的人源化抗體。本發(fā)明還提供了以至少10_8M的平衡解離常數(shù)(Kd)結(jié)合人CTLA4的人源化抗體。本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人CTLA4的人源化抗體，其可阻斷人 CTLA4 結(jié)合人 B7 至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99% 或 100%。本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人CTLA4的人源化抗體，所述人源化抗體具有同種型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的抗體重鏈或具有突變的IgG恒定區(qū)，例如用以抑制結(jié)合Fe受體或用以抑制與補體的結(jié)合。本發(fā)明還提供了其中抗體輕鏈是K輕鏈的人源化抗體。所述人源化抗體可由人IgG重鏈和人K輕鏈核酸編碼，所述IgG重鏈和人K輕鏈核酸編碼其可變區(qū)中如SEQ ID NO: 31-SEQ ID NO: 50列出的蛋白質(zhì)序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述人源化抗體包含來自SEQ ID NO:45和SEQ ID N0:49的可變區(qū)(另外也稱為“VH5:VK4”)。
[0006]本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人CTLA4的人源化抗體，其中已經(jīng)對所述抗體可變區(qū)進行了選擇或修飾以排除一個或多個人CD4+T細胞表位。本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人CTLA4的人抗體，其中主要通過融合來自現(xiàn)有的人抗體可變區(qū)序列的序列片段形成所述抗體可變區(qū)。
[0007]本發(fā)明還提供了本發(fā)明的人源化抗體，其包含重鏈⑶R1XDR2和⑶R3氨基酸序列(分別為“DYNMD”(SEQ ID N0.9)、“NINPNSESTSYNQKFKG”(SEQ ID N0.10^P“DGNRYDAWFAY”(SEQ ID N0.11))以及輕鏈 CDRl、CDR2 和 CDR3 氨基酸序列(分別為 “SASSSVTYMH” (SEQ IDN0.12)、“STSILAS” (SEQ ID N0.13)和“QQRTSYPLT” (SEQ ID N0.14))。
[0008]本發(fā)明還提供了本發(fā)明的人源化抗體，其包含重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3氨基酸序列(分別為“SYWIN” (SEQ ID N0.15)、“RIAPGSGTTYYNEVFKG” (SEQ ID N0.16)和“GDYGSY”(SEQ ID N0.17))以及輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 氨基酸序列(分別為“SASSSISYMH” (SEQ IDN0.18)、“DTSKLAS” (SEQ ID N0.19)和“HQRTSYPLT” (SEQ ID N0.20))。
[0009]本發(fā)明的人源化抗體可以由上述⑶R序列SEQ ID N0.9至SEQ ID N0.20和這些⑶R序列的小變體(minor variants)組成,其中改變一個或多個氨基酸不會明顯地改變與人CTLA4的結(jié)合。人源化抗體可通過將所述CDR序列與來自人可變區(qū)框架的序列連接在一起來產(chǎn)生，其中這種框架序列來源于單個或多個其他的人抗體可變區(qū)框架序列。通常，這種人可變區(qū)框架序列會包括造成所述人源化抗體與CTLA4的最佳結(jié)合或改善結(jié)合的一個或多個突變。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述人源化抗體中的這種人可變區(qū)框架序列全部來源于其他的人抗體可變區(qū)中的序列，如EP1844074 (Antitope Ltd)的方法所述。這些序列包含來自其他人抗體可變區(qū)的序列的連接在一起的片段，以及人恒定區(qū)。具體地，這種人源化抗體還含有來源于來自其他人抗體可變區(qū)的CDR序列、框架序列或部分框架/CDR序列的CDR序列以及人恒定區(qū)，從而產(chǎn)生其中可變區(qū)序列全部來源于其他人抗體可變區(qū)并且含有人恒定區(qū)的人源化抗體，從而產(chǎn)生“全人”抗體。
[0010]本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人CTLA4的人源化抗體，其中所述人源化抗體由哺乳動物細胞系，尤其是CHO或NSO細胞產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人CTLA4的人源化抗體，其為Fab片段或單鏈Fv (scFv)。本發(fā)明還提供了多特異性抗體(將兩種或多種不同的抗體分子連接在一起以給出兩種或多種不同的特異性)，對于抗體3B10，其包括至少一種來自序列SEQ ID N0:31至35 (用于重鏈)和SEQ ID N0:36至40 (用于輕鏈)的人源化抗體；或者對于抗體8H5，其包括至少一種來自序列SEQ ID NO:41至45(用于重鏈)和SEQ IDNO:46至50 (用于輕鏈)的人源化抗體，所述人源化抗體均特異性結(jié)合人CTLA4。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了多特異性抗體，其具有由SEQ ID NO:45 (用于重鏈)和SEQID NO:49 (用于輕鏈)組成的可變區(qū)?？蓪ㄔ诿糠N多特異性抗體內(nèi)的不同抗體彼此共價或非共價連接。
[0011]本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含特異性結(jié)合人CTLA4的人源化抗體和可藥用載體。所述藥物組合物還可包含可有效誘導針對靶抗原的免疫應答的試劑，或者一種或多種化學治療劑。
[0012]本發(fā)明提供了一種用于誘導、加強(augmenting)或延長患者中針對抗原的免疫應答的方法，其包括向所述患者給予有效劑量的特異性結(jié)合人CTLA4的人源化抗體，其中所述抗體阻斷人CTLA4結(jié)合人B7。所述抗原可包括腫瘤抗原、病原體相關抗原、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病相關抗原、血液系統(tǒng)疾病(包括高血壓和動脈粥樣硬化)相關抗原、炎性疾病(包括類風濕關節(jié)炎和自身免疫性疾病)相關抗原或變態(tài)反應相關抗原。腫瘤抗原可以是腫瘤的細胞表面上的一個或多個抗原、與所述腫瘤相互作用的一個或多個分子、來源于腫瘤抗原的肽的一個或多個MHC復合物，或與腫瘤不直接相關但針對其的免疫應答對所述腫瘤有副作用的抗原，例如腫瘤血管系統(tǒng)相關抗原。病原體可以是病毒、細菌、真菌或寄生物。CNS抗原包括與阿爾茨海默病中的斑塊沉積相關的β淀粉狀蛋白。血液系統(tǒng)抗原包括整聯(lián)蛋白和粘附素，以及與動脈粥樣硬化中的斑塊沉積相關的抗原。炎性疾病抗原包括細胞因子和細胞因子受體。變態(tài)反應抗原包括與食物、植物、化學和環(huán)境變應原相關的抗原。本發(fā)明的方法還可包括向所述患者給予所述抗原或其片段或類似物，其中所述抗原與所述人源化抗體結(jié)合可誘導、加強或延長免疫應答。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種抑制患者中的免疫應答的方法，其包括向所述患者給予有效劑量的包含至少兩個彼此相連接的抗人CTLA4的人源化抗體的多價制劑，導致例如調(diào)節(jié)性T細胞的誘導或CTLA4的下調(diào)。本發(fā)明還提供了一種抑制患者中的免疫應答的方法，其包括向所述患者給予有效劑量的多克隆制劑，所述多克隆制劑包含至少兩個抗人CTLA4的人源化抗體。
[0014]本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人CTLA4的人源化單克隆抗體以及含有這類抗體的一個或結(jié)合物的組合物。本發(fā)明的一些人源化抗體特征在于以高親和力結(jié)合人CTLA4，和/或在于阻斷人CTLA4與其配體人Β7-1和Β7-2分子的相互作用。因此，本發(fā)明的這種人源化抗體可在體內(nèi)和體外用作診斷或治療試劑。
[0015]本發(fā)明的人源化抗體可包括多種抗體同種型或其混合物，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD、IgE或這些IgG的突變形式例如可減弱或消除與Fe受體的結(jié)合的突變。通常，它們包括IgG4 (例如IgG4k)和IgGl (例如IgGlk)。所述人源化抗體可以是全長(例如IgG4或IgGl抗體)或者可以僅僅包括抗原結(jié)合部分(例如，F(xiàn)ab、F (ab，) 2、Fv 或 scFv 片段)。
[0016]本發(fā)明的一些人源化CTLA4抗體可以通過一個或多個以下特性來表征:a)對人CTLA4的特異性(特異性結(jié)合人CTLA4);b)對人CTLA4的結(jié)合親和力具有至少10-8Μ的平衡解離常數(shù)(Kd)。
[0017]在另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的人源化抗體或抗原結(jié)合部分的核酸分子。因此，本發(fā)明還涵蓋了包括本發(fā)明的抗體編碼核酸的重組表達載體和用這種載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞，以及通過培養(yǎng)這些宿主細胞制備本發(fā)明的抗體的方法。
[0018]可將本發(fā)明的人CTLA4的人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分(例如Fab)衍生化或連接至另一功能性分子，例如另個一肽或蛋白質(zhì)(例如Fab’片段)。例如，可將本發(fā)明的人源化抗體的抗體或抗原結(jié)合部分功能化地連接(例如，通過化學偶聯(lián)、基因融合、非共價連接或以其他方式)至一個或多個其他分子實體。例如，可將所述人源化CTLA4抗體或其抗原結(jié)合片段綴合至治療部分，例如細胞毒類藥、有酶活性毒素(enzymatically activetoxin)或其片段、放射性同位素、治療性核酸或小分子抗癌藥。還可將本發(fā)明的抗體綴合至細胞毒性藥物，例如用細胞毒性試劑(例如1311)進行放射性標記，或者可以將其偶聯(lián)至核糖體失活蛋白例如假單胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE38片段、植物或細菌毒素例如蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白的α鏈、皂草素、美洲商陸抗病毒蛋白、白喉毒素、或假單胞菌外毒素A(Kreitman and Pastan(1998)Adv.Drug Delivery Rev.31:53.)。
[0019]在另一方面，本發(fā)明提供了組合物例如藥物組合物和診斷組合物，其包含可藥用載體和特異性結(jié)合人CTLA4的至少一種本發(fā)明的人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。一些組合物還可包含本發(fā)明的人源化抗體或抗原結(jié)合部分的結(jié)合物。這類組合物還可包含與作為單獨分子的一種或多種其他生物活性分子的結(jié)合物，例如至少一種本發(fā)明的人源化單克隆抗體與另一生物活性分子的結(jié)合物，或者可在同一分子內(nèi)結(jié)合與一個或多個其他生物活性分子的多個結(jié)合物，例如作為雙特異性或多特異性分子，為兩個或多個本發(fā)明的人源化抗體的結(jié)合物或為與一個或多個其他生物活性分子的結(jié)合物。
[0020]對于體內(nèi)方法，可向人受試者給予所述抗體或其抗原結(jié)合部分(或本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子)，所述人受試者患有T細胞相關的疾病或患有可通過誘導、加強、延長或抑制免疫應答而改善或預防的疾病。
[0021]還可與其他已知療法(例如抗癌療法)結(jié)合給予本發(fā)明的人源化單克隆抗體組合物。因此，本發(fā)明提供了一種用于治療受試者中的癌癥的方法，其包括向所述受試者給予治療有效量的人源化抗體的藥物組合物以及藥物載體。這種方法中的一些包括與疫苗結(jié)合。這種疫苗中的一些包括腫瘤細胞疫苗、GM-CSF-修飾的腫瘤細胞疫苗、核酸(例如DNA)疫苗和腫瘤相關抗原或負載抗原的樹突細胞疫苗。
[0022]可將抗人CTLA4的人源化抗體用于需要刺激免疫應答或抑制免疫應答的治療方法中。刺激使用可阻斷人CTLA4結(jié)合人B7的抗體來實現(xiàn)，可通過刺激、加強和延長免疫應答治療的疾病包括前列腺、腎、結(jié)腸、肺或乳腺的癌癥；病原體感染；CNS相關疾病，例如包括阿爾茲海默病的淀粉樣蛋白形成疾?。缓陀醒装Y或變應性成分(component)的疾病。免疫抑制還可使用抗人CTLA4的人源化抗體,例如通過誘導調(diào)節(jié)性T細胞(Coquerelle etal.，Gut2009; 58:1363-1373)來實現(xiàn)?？芍委煹募膊“ㄒ浦参锟顾拗鞑　⑺拗骺挂浦参锊?、變態(tài)反應、自身免疫性疾病和其他炎性疾病。
[0023]在另一方面，本發(fā)明提供了一種使用本發(fā)明的抗體在體外或體內(nèi)檢測樣品中人CTLA4抗原的存在的方法，例如用于診斷人CTLA4相關疾病。在一些方法中，這通過使要測試的樣品和對照樣品一起，與本發(fā)明的人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分(或雙特異性或多特異性分子)在允許形成所述抗體和人CTLA4的復合物的條件下接觸來實現(xiàn)。然后，檢測測試樣品中的復合物形成(例如通過ELISA)，所述測試樣品和對照樣品之間復合物形成的任何統(tǒng)計學顯著的增加都指示了所述測試樣品中人CTLA4抗原的存在。 [0024]本領域的技術人員會理解，除了本文描述的那些之外，本發(fā)明的人源化抗體會具有另外的用途或組合物，在其中所述人源化抗體結(jié)合人CTLA4抗原的所有情況中，這種用途和組合物被認為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本領域的技術人員會理解，可對本發(fā)明的人源化抗體的可變區(qū)序列(SEQ ID N0:31至SEQ ID NO:50)或本發(fā)明的人源化抗體的⑶R (SEQID N0:9至SEQ ID NO:20)作出改變，所述改變不會顯著改變本發(fā)明人源化抗體的特性，因此應認為這種變體在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。此外，在所述人源化抗體的可變區(qū)或CDR序列內(nèi)的這種改變應被認為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要這種變體的可變區(qū)序列與本發(fā)明的人源化序列具有顯著同源性。例如，可確定變體核酸在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要其包括含有SEQ IDN0:21至SEQ ID NO:30的序列或含有通過其在嚴格條件下與本發(fā)明核酸雜交的能力確定的與SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:30基本相同的序列。在一個實施方案中，可通過核酸序列在嚴格條件下與本發(fā)明范圍內(nèi)核酸雜交(例如SEQ ID NO:21至SEQ ID N0:30)的能力確定其在本發(fā)明的范圍內(nèi)(例如與SEQ ID NO:21至SEQ ID N0:30基本相同)。術語“雜交”是指當特定核苷酸序列存在于復雜混合物(例如總細胞或文庫DNA或RNA)中時，分子與該序列在嚴格雜交條件下的結(jié)合、形成雙鏈體(duplex)或雜交，其中至少以約10倍背景檢測到所述特定核苷酸序列。嚴格雜交條件被選擇為例如比具體序列在確定離子強度PH下的熱角軍鏈點(thermal melting point, Tm)低 5-1CTC。
實施例
[0025]以下實施 例不應被認為對本發(fā)明的范圍進行限制。與下文的實施例有關的圖和表如下:
[0026]圖1-鼠抗體結(jié)合CTLA4-Fc。
[0027]圖2-對于結(jié)合CTLA4-FC，鼠抗體相對抗生物素化的B7.1的競爭ELISA。
[0028]圖3-對于結(jié)合CTLA4-FC，鼠抗體相對抗生物素化的B7.2的競爭ELISA。
[0029]圖4-嵌合 3B10 和 8H5 人 IgGl 抗體結(jié)合 CTLA4_Fc。
[0030]圖5-對于結(jié)合CTLA4-Fc，嵌合3B10和8H5人IgGl抗體相對抗生物素化的B7.1的競爭ELISA。
[0031]圖6-對于結(jié)合CTLA4-Fc，嵌合3B10和8H5人IgGl抗體相對抗生物素化的B7.2的競爭ELISA。
[0032]圖7-在針對嵌合3B10和8H5人IgGl抗體的應答中人PBMC的T細胞增殖。
[0033]圖8-pANT抗體表達載體圖。
[0034]圖9-3B10 可變區(qū)(VH 和 VK) DNA 序列。
[0035]圖10-8H5VH 和 VK DNA 序列。
[0036]圖11-3B10VH和VK氨基酸序列。
[0037]圖12-8H5VH和VK氨基酸序列。
[0038]圖13-人源化3B10VH氨基酸序列。
[0039]圖14-人源化3B10VK氨基酸序列。
[0040]圖15-人源化8H5VH氨基酸序列。
[0041 ]圖16-人源化8H5VK氨基酸序列。
[0042]圖17-對于結(jié)合CTLA4-FC，人源化8H5抗體相對抗生物素化的嵌合8H5人IgGl(=“h8H5 親本 IgGlO 的競爭 ELISA。
[0043]圖18-在具有供體對的人混合淋巴細胞反應中由首要(lead)人源化VH5/VK4CTLA4 和 MDX0101 引起的 IFNx 分泌。
[0044]圖19-在從第2天開始每周給予抗體劑量的人CTLA4敲入小鼠中MC38腫瘤的生長。[0045]表1-用于擴增鼠cDNA可變區(qū)的引物序列。
[0046]表2-用于擴增用于克隆至pANT17和pANT13中的鼠可變區(qū)的引物序列。
[0047]除非另有說明，根據(jù)制造商的說明書使用實施例中提到的可商購試劑。在實施例和整個說明書中通過ECACC登錄號識別的細胞的來源是英國索爾茲伯里的歐洲細胞培養(yǎng)物收集中心(European Collection of Cell Cultures, ECACC)。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員之一所通常理解的含義相同。下文描述了示例性的方法和材料，然而與本文描述的那些類似或等價的方法和材料也可用于實施或測試本發(fā)明。所述材料、方法和實施例僅是示例性的，并且在范圍上不意欲是限制性的 。
[0048]實施例1-產(chǎn)生小鼠單克隆抗體
[0049]包含融合至人IgGl恒定區(qū)的人CTLA4的細胞外結(jié)構域的重組CTLA4-融合蛋白購自R&D Systems (Oxford, UK)。細胞外CTLA4片段如下制備:用凝血因子Xa(Qiagen, Crawley, UK)對CTLA4_Fc融合蛋白進行蛋白水解切割,然后依次用凝血因子Xa去除樹脂(Qiagen)除去所述蛋白酶，用蛋白A-瓊脂糖除去所切割的Fe片段，以僅留下CTLA4細胞外結(jié)構域。
[0050]用含20 μ g CTLA4-Fc融合蛋白的200 μ I弗氏完全佐劑(Sigma-Aldrich, Dorset, UK)的1:1乳液皮下免疫雌性Balb/c小鼠。隨后,大約每三周腹腔內(nèi)注射含20 μ g CTLA4-Fc的弗氏完全佐劑(Sigma-Aldrich)的1:1乳液最多達3次而對免疫的小鼠進行加強。骨髓瘤融合前3天，顯示出最高抗體滴度的兩只小鼠接受了全抗原或CTLA4細胞外結(jié)構域的脾內(nèi)加強免疫。
[0051]提取脾臟并進行均質(zhì)化以產(chǎn)生單細胞懸液。使用聚乙二醇(PEG)將IXlO8個脾細胞與5X IO7個NSO小鼠骨髓瘤細胞(比例為2:1)進行融合。將融合的細胞重懸于200ml含雜交瘤細胞選擇劑偶氮絲氨酸和次黃嘌呤的DMEM/20%FCS/5%BM Condimed Hl(Roche, Burgess Hill1UK)——“HAZA培養(yǎng)基”中，并用移液管以200 μ I的體積移至10X96孔板中。將板在37°C下在5%C02中孵育，每隔一日用新鮮的含2.5%BM Condimed Hl的HAZA培養(yǎng)基替換每個培養(yǎng)孔的一半體積(100 μ I)。12天的孵育之后，將每個培養(yǎng)孔的100 μ I消耗后的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至96孔儲藏板中，并使用下文所述的CTLA4-融合蛋白ELISA來測試所分泌的CTLA4-融合蛋白抗體的存在情況。通過轉(zhuǎn)移至24孔板中的Iml “H-培養(yǎng)基”(DMEM/20%FCS/次黃嘌呤)并允許繼續(xù)生長5_7天來擴大免疫陽性培養(yǎng)物。然后，將陽性培養(yǎng)物通過有限稀釋進行亞克隆、擴大并通過CTLA4-融合蛋白ELISA進行測試。另外，通過下文所述的FACS測試陽性培養(yǎng)物。
[0052]對于有限稀釋，使用血球細胞計數(shù)器并在含2.5%BM Condimed Hl的培養(yǎng)基中對細胞進行系列稀釋來確定細胞數(shù)量，直至細胞密度達到5-15個細胞/ml。對于每個雜交瘤，將200 μ I的細胞溶液用移液管移至48孔中，密度為1-3個細胞/孔。將培養(yǎng)物在37°C下在5%C02中培養(yǎng)2周，在培養(yǎng)I周后加入一半體積的另外的培養(yǎng)基。通過ELISA測試培養(yǎng)基中對CTLA4-融合蛋白特異的抗體的存在情況。選出ELISA陽性克隆，并將其在DMEM/20%FCS/2.5%BM Condimed Hl中擴大到IOml培養(yǎng)物。然后,將克隆冷凍在含10%DMS0的培養(yǎng)基中并保存在液氮中，并且還將其進一步擴大用于抗體純化。將命名為3B10和8H5的兩種雜交瘤細胞進行亞克隆，然后將亞克隆冷凍并用于進一步研究中的單克隆抗體產(chǎn)生。
[0053]為了鑒定分泌抗人CTLA4特異性小鼠抗體的雜交瘤細胞，將ELISA板(VWR, Lutterworth, UK)用 100 μ I/ 孔的 PBS 中 0.5 μ g/ml 的重組 CTLA4 融合蛋白或人 IgGl(Sigma-Aldrich, Poole, UK)在4°C下包被過夜。洗滌板，并將其用150 μ I/孔的含2%BSA的PBS封閉。將細胞培養(yǎng)上清液或純化的抗體在PBS/2%BSA中稀釋，向每個板加入100 μ 1，然后在室溫下孵育I小時。將板用PBS-吐溫(0.05%)洗滌三次，并用100 μ I/孔的綴合辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠Ig(Fab-特異性)(Sigma-Aldrich)孵育I小時。將板用PBS-吐溫洗滌三次，然后加入SigmaFast OPD底物(Sigma-Aldrich)并在室溫下在黑暗中孵育4分鐘。通過加入50 μ I的3MHC1終止反應。使用Dynex酶標儀(Dynex, Worthing, UK)在490nm下讀板。
[0054]使用快速ELISA小鼠抗體同種型鑒定試劑盒(Rapid ELISA Mouse AntibodyIsotyping Kit,Perbio, Cramlington, UK)對單克隆抗體進行同種型鑒定。在Iml蛋白A-瓊脂糖柱(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)上純化抗體。純化之前，將管道和蛋白A柱用0.4M NaOH去熱原。將柱用20CV的IXPBS (pH7.4)重新平衡。收獲雜交瘤細胞培養(yǎng)物上清液，使用10XPBS將其調(diào)至lXPBS(pH7.4)并過濾除菌。將過濾的上清液以0.5ml/分鐘泵送通過柱。用IXPBS (pH7.4)洗滌柱，使用無菌0.1M檸檬酸鈉(pH3)洗脫IgG，收集了 0.9ml級分并用0.1ml的無菌IMTris-HCl (pH9)中和。在無菌條件下，將所述產(chǎn)品緩沖液交換為PBS (pH7.4)以除去任何的洗脫緩沖液并濃縮所述樣品。濃縮之后，使用1.4的消光系數(shù)Ec (0.1%)通過0D280nm對抗體進行定量。純化的抗體通過Novex NuPAGE電泳系統(tǒng)用4_12%NuPage凝膠(Invitrogen, Paisley, UK)和MES電泳緩沖液通過SDS-PAGE來分析。與4XNUPAGE樣品緩沖液和β -巰基乙醇一起準備I μ g抗體并加熱。將所述凝膠用InstantBlue 染色液(Expedeon, Cambridge, UK)染色并通過比較染色帶與 PageRuler?PlusPrestained Protein Ladder (Fermentas, York, UK)來估計分子大小。對每個抗體確定兩條帶，不存在可檢測到的污染物。
[0055]為了評估抗體與CTLA4的結(jié)合以及對CTLA4與CTLA4配體B7.1和B7.2之間相互作用的阻斷，通過ELISA進行了競爭測定。使用Biotin Tag?微型生物素化試劑盒(Biotin Tag? Micro Biotinylation kit, Sigma - Aldrich)將配體 Β7.1-1g 和Β7.2~Ig (R&D Systems)生物素化。將 96 孔 MaxiSorp 板(Nunc)用 Dulbecco’s PBS (PAALaboratories, Yeovil, UK)中 0.5 μ g/ml 的重組人 CTLA4_Ig (IgGl) (R&D Systems)(終體積80 μ I)在4°C下包被過夜。丟棄CTLA4-1g并將板用Dulbecco’ s PBS_2%BSA在室溫下封閉I小時。將板用洗滌緩沖液(Dulbecco’ s-PBS中0.05%吐溫20)洗滌3次。將不同濃度的測試抗體與生物素化的-B7.1-1g (終濃度0.36 μ g/ml)或生物素化的-B7.2_Ig (終濃度0.65 μ g/ml)預混合，然后加至所述CTLA4-1g板(終體積80 μ I)。所有樣品以兩個重復進行測試。將板在室溫下孵育I小時，并用洗滌緩沖液洗滌3次。加入80 μ I抗生物素蛋白鏈菌素HRP (Sigma-Aldrich)的1:500 (lin500)稀釋物，并在室溫下孵育I小時。將板用洗滌緩沖液洗滌三次，加入80 μ I SigmaFast OPD底物(Sigma-Aldrich，Cat#P9187)并在室溫下在黑暗中孵育4分鐘。通過加入50 μ I的3Μ HCl終止反應。使用Dynex酶標儀在490nm下讀板?；谂cCTLA4的結(jié)合(圖1)，選擇亞克隆8H5-1B1、3B10-4F7、7B9_1A3和2C7-1G10作為首要單克隆抗體的生產(chǎn)者。在這些首要者中，除了 7B9-1A3以外都顯示出與生物素化的B7.1 (圖2)和生物素化的B7.2 (圖3)競爭結(jié)合人CTLA4。
[0056]為了確定所述首要單克隆抗體是否結(jié)合在T細胞表面上表達的CTLA4，進行了流式細胞分析。從人PBMC(外周血單核細胞)分離人外周T細胞，并對其進行刺激以增強CTLA4的表達。使用OM+T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Bisley, UK)從PBMC純化0)4+細胞，鋪板在24孔板(IXlO6個細胞/孔)中的AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen, Paisley, UK)中，在37°C下過夜孵育。用伊屋諾霉素(I μ g/ml)和PMA( (12-)十四酸佛波酯(_13_)乙酸鹽)(50ng/ml)刺激細胞，并在37°C下孵育4小時。將細胞在AIM-V培養(yǎng)基中洗滌一次，在含2%甲醛的PBS中固定15分鐘，以2X IO6個細胞/ml重懸于FACS緩沖液(含1%BSA、0.05%疊氮化鈉和0.1%皂苷的D-PBS)，在4°C下孵育30分鐘。
[0057]將2X IO5 個細胞用 CTLA4-PE 綴合抗體(BNI3) (Abeam, Cambridge, UK)的 1:10 稀釋物(作為陽性對照)染色，或者用5 μ g/ml的各個CTLA4單克隆抗體和小鼠IgG-PE綴合抗體(Sigma)的1:50稀釋液一起染色。還包括小鼠IgG (Sigma)作為首要單克隆抗體內(nèi)存在的不同鼠同種型的單獨對照。將細胞在4°C下染色I小時。還包括僅小鼠IgG-PE綴合抗體的對照。將細胞用FACS緩沖液洗滌兩次，任選在4°C下在黑暗中用小鼠抗人CD4-FITC綴合抗體(Caltag, Buckingham, UK)的1:40稀釋物或小鼠IgG2a_FITC綴合抗體(Caltag)染色I小時。用FACS緩沖液洗滌兩次之后，將細胞重懸于FACS緩沖液并使用Beckton DickinsonFACSCalibur (Becton Dickinson, Oxford, UK)進行流式細胞術。通過分析相關同種型對照抗體來確定儀器設置?；谒^察到的與CTLA4的結(jié)合，單克隆抗體8H5和3B10被分別指定作為第一和第二首要單克隆抗體。
[0058]實施例2-可變區(qū)基因測序
[0059]對產(chǎn)生首要單克隆抗體8H5和3B10的亞克隆3B10-4F7、3B10_6E3、8H5-1A1和8H5-1B1進行可變區(qū)(V-區(qū)域)序列分析。使用RNAqueous_4PCR試劑盒(Ambion, Warrington, UK)從3 X IO6-1O X IO6個雜交瘤細胞提取總RNA，并將其用于合成cDNA。使用如表1所示的簡并小鼠前導序列引物(Sigma)和獨特恒定域引物(Sigma)通過PCR擴增鼠免疫球蛋白重鏈和K輕鏈V-區(qū)域片段。將所得的PCR片段亞克隆至pGEM-TEasy I載體系統(tǒng)(Promega, Southampton, UK)中，并使用載體特異性引物M13Forward(Sigma)對插入片段進行測序。所有DNA測序由Geneservice Ltd, Cambridge, UK進行。獲得了 3B10 (SEQ ID No I和2)和8H5 (SEQ ID No5和6)的獨特V-區(qū)域核苷酸序列。
[0060]確定了如下的3B10和8H5高變區(qū)(⑶R)序列；
[0061]SEQ ID N0.93B10CDRH1DYNMD
[0062]SEQ ID N0.103B10CDRH2NINPNSESTSYNQKFKG
[0063]SEQ ID N0.113B10CDRH3DGNRYDAWFAY
[0064]SEQ ID N0.123B10CDRL1SASSSVTYMH
[0065]SEQ ID N0.133B10CDRL2STSILAS
[0066]SEQ ID N0.143B10CDRL3QQRTSYPLT
[0067]SEQ ID N0.158H5CDRH1SYWIN
[0068]SEQ ID N0.168H5CDRH2RIAPGSGTTYYNEVFKG
[0069]SEQ ID N0.178H5CDRH3⑶YGSY
[0070]SEQ ID N0.188H5CDRL1SASSSISYMH[0071]SEQ ID N0.198H5CDRL2DTSKLAS
[0072]SEQ ID N0.208H5CDRL3HQRTSYPLT
[0073]實施例3 -產(chǎn)生嵌合抗體
[0074]將首要3B10和8H5單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變域序列進行PCR擴增并亞克隆至PANT抗體表達載體中(圖8)，重鏈和輕鏈V區(qū)域分別克隆至pANT17和pANT13中。將重鏈V-區(qū)域基因與人^1重鏈基因(611113 (Glm (f))同種異型)或人Y 4重鏈基因在閱讀框內(nèi)經(jīng)MluI和HindIII位點克隆至pANT17中，將輕鏈V-區(qū)域基因與人κ輕鏈恒定區(qū)基因(Km3同種異型)在閱讀框內(nèi)經(jīng)BssHII和BamHI位點克隆至pANT13中。重鏈和輕鏈基因的轉(zhuǎn)錄都在CMV I/E啟動子的控制下(US5168062和US5385839，愛荷華大學)，pANT17質(zhì)粒含有在 SV40 啟動子控制下的突變型 dhfr 小基因(Simonsen&Levinsonl983, PNAS80:2495-2499)和用于在真核細胞中進行選擇的polyA序列。pANT17和pANT13都含有用于原核選擇的β -內(nèi)酰胺酶(Α ρκ)基因和用于在原核細胞中增殖的pMBl復制起始點。所有質(zhì)粒在大腸桿菌(E.coli )XLl_blue中增殖(Stratagene Cat.N0.200130)。用于擴增所述V-區(qū)域基因以克隆至pANT表達載體的引物示于表2。
[0075]然后，將所述重鏈和輕鏈表達構建體通過基于磷酸鈣的轉(zhuǎn)染瞬時地共轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中，或者通過電穿孔穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染至NSO細胞中。分泌的抗體通過蛋白A色譜法從細胞培養(yǎng)物上清液純化。通過對CTLA4結(jié)合ELISA(圖4)、相對于B7.1和B7.2的CTLA4競爭ELISA (圖5和6)進行分析，以及通過如實施例1中的流式細胞術分析的與T細胞上表達的CTLA4的結(jié)合，3B10和8H5嵌合抗體都顯示保留了初始單克隆抗體的CTLA4結(jié)合。
[0076]實施例4-T-細胞增殖測定
[0077]使用包被人⑶2抗體、人⑶3抗體和人⑶28抗體的珠子(MiltenyiBiotec, Bisley, Surrey)激活PBMC(外周血單核細胞)。將5 X IO5個細胞鋪板在96-孔板每個孔中的AM-V培養(yǎng)基中，并且以I珠子/細胞的比例向細胞加入珠子。將測試抗體或同種型對照抗體在AIM-V培養(yǎng)基中酌情稀釋，并以50μ I/孔加入到所述細胞中，得到200μ I的終體積。還包括僅培養(yǎng)基(無抗體)的對照。將板在37°C下孵育4天，然后將細胞用AIM-V?;培養(yǎng)基中的 0.75 μ Ci [3Η]-胸苷(Perkin Elmer, Beaconsf ield, UK)進行脈沖(pulse),并再孵育18小時，然后使用TomTec Mach IIKHamden CT，USA)細胞收集器在過濾墊(PerkinElmer)上收集細胞。每個孔的每分鐘計數(shù)(cpm)通過Meltilex?(Perkin Elmer)閃爍計數(shù)法在 1450Microbeta Wallac Trilux Liquid Scintillation Counter (Perkin Elmer)上在paralux低本底計數(shù)中確定。將每種抗體樣品的每分鐘計數(shù)相對于僅培養(yǎng)基對照進行歸一化。在兩個獨立研究中，顯示嵌合抗體可逆轉(zhuǎn)CTLA4誘導的對T細胞增殖的抑制，與用初始單克隆抗體可觀察到的一樣(圖7)。
[0078]實施例5-產(chǎn)生人源化抗體
[0079]使用EP1844074 (Antitope Ltd)中描述的方法產(chǎn)生人源化抗體。使用瑞士 I3DB產(chǎn)生小鼠V區(qū)域的結(jié)構模型并對其進行分析，以鑒定來自3B10和8H5V-區(qū)域的可能對所述抗體的CTLA4結(jié)合特性重要的重要氨基酸(“限制殘基(constraining residues)”)。使用人V-區(qū)域序列的數(shù)據(jù)庫以鑒定含有要用于設計所述人源化抗體的各個限制殘基的人V-區(qū)域序列片段。通常，使用兩個或多個可選擇的V-區(qū)域序列片段以提供各個限制殘基，獲得8H5和3B10的人源化抗CTLA4V-區(qū)域序列的大量可能序列。然后，通過如Fothergillet al.(W09859244, Eclagen Ltd)中所述的計算機分析來分析這些序列以預測非生殖細胞系 MHC II 類妝結(jié)合，還使用包括“The Immune Epitope Database and AnalysisResource” , http://www.1mmuneepitope.0rg/ 的數(shù)據(jù)庫來分析已知 Q)4+T_ 細胞表位。去掉含有預測的非生殖細胞系MHC II類結(jié)合肽或含有與T細胞表位數(shù)據(jù)庫明顯匹配的序列的V-區(qū)域序列。這導致V-區(qū)域序列集變小。然后，將選擇的V-區(qū)域序列片段組合結(jié)合以產(chǎn)生人源化重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。分別為8H5(分別為SEQ ID No41_45和46-50)和3B10 (分別為SEQ ID No31_35和36-40)選擇五條重鏈和五條輕鏈序列(分別命名為VH1-VH5, VK1-VK5)。
[0080]合成編碼人源化變體V-區(qū)域的DNA并將其亞克隆至如實施例3所述的表達載體PANT17和pANT13中。將人源化VH和VK鏈的所有組合(B卩，對于8H5和3B10各自總計有25種配對)瞬時轉(zhuǎn)染至HEK293中，還轉(zhuǎn)染至NSO細胞中，并如實施例3所述通過蛋白A色譜法從培養(yǎng)物上清液純化抗體。
[0081 ] 實施例6-分析人源化抗體
[0082]在針對合適的親本嵌合抗體的競爭ELISA中評估了來源于HEK和來源于NSO的8H5和3B10人源化變體與重組CTLA4的結(jié)合。使用Biotin Tag?微型生物素化試劑盒(Sigma - Aldrich)將親本8H5和3B10嵌合抗體生物素化。將96孔MaxiSorp板(Nunc)用Dulbecco’s PBS中0.5 μ g/ml的重組人CTLA4_Ig (終體積100 μ I)在4°C下包被過夜。棄去CTLA4-1g并將板用Dulbecco’s PBS_2%BSA在室溫下封閉I小時。將板用洗滌緩沖液(Dulbecco’ s-PBS中0.05%吐溫20)洗滌3次。將不同濃度的測試人源化抗體與生物素化的親本嵌合抗體(終濃度0.02 μ g/ml)預混合，然后加入到所述CTLA4-1g板中(終體積100 μ I)。所有樣品進行兩次重復測試。將板在室溫下孵育I小時，并用洗滌緩沖液洗滌3次。加入100 μ I抗生物素蛋白鏈菌素HRP(Sigma-Aldrich)的1:500稀釋液，并在室溫下孵育I小時。將板用洗滌緩沖液洗滌三次，加入100 μ I SigmaFast (PD底物(Sigma-Aldrich，Cat#P9187)并在室溫下在黑暗中孵育4分鐘。通過加入50 μ I的3Μ HCl終止反應。使用Dynex酶標儀在490nm下讀板。
[0083]所有首要8H5人源化變體都顯示出與8H5嵌合抗體類似的競爭結(jié)合譜，但含κ鏈VK5的變體表現(xiàn)出與其他變體相比略減少的結(jié)合(圖17)。類似地，所有的首要人源化3Β10變體顯示出與3Β10嵌合抗體類似的競爭結(jié)合譜。此外，所有首要人源化8Η5和3Β10變體，當在相對于Β7.1和Β7.2的CTLA4競爭ELISA中測試時(實施例3)，給出了圖5和6所示的與所述嵌合抗體非常類似的競爭結(jié)合譜，其中在所述首要人源化變體的最大濃度下>90%的Β7.1或Β7.2結(jié)合被抑制。選擇首要人源化變體VH5/VK4 (分別為SEQ ID Νο45和39)作為用于進一步研究的首要抗體。
[0084]實施例7 _ 產(chǎn)生 scFv’ s 和 Fab，s
[0085]將來自實施例6的人源化8H5和3B10變體轉(zhuǎn)變?yōu)閟cFv’ s并使用pCANTAB5E載體 RPAS 表達模塊(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)克隆至如Benhar 1.and Reiter Y., Current Protocols in Immunology, Unitl0.19B, Wiley OnlineLibrary, May2002 (http: //www.currentprotocols.com/protocol/iml019b)所述的 M13 嗤菌體展示載體中。使用引物擴增人源化VH和VK基因，所述引物提供末端SfiI和NotI限制位點、內(nèi)部Gly4Ser接頭和C末端his6標簽。將所述scFv構建體作為Sfi1-NotI片段插入至pCANTAB5E載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌HB2151中，產(chǎn)生輸出至周質(zhì)并部分輸出至生長培養(yǎng)基的 scFv。通過鎳螯合物親和色譜法使用 HIS-Select HF Cartridges (Sigma-Aldrich)U生長培養(yǎng)基純化scFv’s。在如實施例1所述的B7.1-1g和B7.2_Ig競爭測定中測試了純化的scFv’s，所有的人源化scFvs都顯示出與CTLA4的競爭結(jié)合。還使用用于scFv’s的方法將實施例6的人源化8H5和3B10變體轉(zhuǎn)變?yōu)镕ab’S，另外將擴增的人源化VH和VK基因用CHl和Ck恒定區(qū)基因進一步擴增以形成VH-CHl和VK-C κ片段，并將其用引物進一步擴增以將這些片段與22個氨基酸的pelB前導序列(Lei S.P., Lin H.C., Wang S.S., CallawayJ., and Wilcox G., J Bacteriol.169 (1987) p4379 - 4383)在上游 VH-CH1 和下游 VK-C κ 基因片段之間連接起來，產(chǎn)生雙順反子Fab基因。產(chǎn)生了來自人源化抗體變體的Fab’s，并按上文關于scFv’s的描述進行純化，并在如實施例1所述的B7.1-1g和B7.2_Ig競爭測定中進行測試。所有的人源化Fab’ s顯示出與CTLA4的競爭結(jié)合 。
[0086]實施例8 -分析⑶4+T細胞應答
[0087]根據(jù)Addenbrooke，s Hospital Local Research Ethics Committee 的批準，從獲自 UK National Blood Transfusion Service (AddenbrookejS Hospital, Cambridge, UK)的健康社會供體血沉棕黃層(來自24小時內(nèi)抽取的血液)分離PBMC。通過Lymphoprep(Axis-shield, Dundee, UK)密度離心從血沉掠黃層分離PBMC,并使用CD8+RosetteSep?(StemCell Technologies Inc, London, UK)耗盡 CD8+T 細胞。供體通過使用基于 HLASSP-PCR的組織分型試劑盒(Biotest，Solihull, UK)鑒定HLA-DR單元型來表征。還確定了針對對照抗原(包括回憶抗原破傷風毒素)的T細胞應答(KLH Pierce, Cramlingtom, UK和來源于A型流感病毒和愛潑斯坦巴爾病毒(Epstein Barr virus)的肽)。然后,將PBMC冷凍并保存在液氣中待用。
[0088]為了制備單核細胞衍生的樹突細胞(DC)，選擇了 50份不同的供體PBMC以提供與全世界人群頻率類似的HLA-DR和HLA-DQ同種異型的頻率分布。將PBMC在AIM-V?;培養(yǎng)基中復蘇，使用 Miltenyi CD14 微珠(Microbead)和 LS 柱(Miltenyi Biotech, Oxford, UK)分離CD14+細胞。將單核細胞重懸于補充有1000U/ml IL-4和1000U/ml GM-CSF的AIM-V?中(“DC培養(yǎng)基”)至4X 106-6X IO6個PBMC/ml，然后分配到24孔板中(終培養(yǎng)
體積2ml)。在第2天,通過更換一半體積的DC培養(yǎng)基來給細胞補料。到第3天時,單核細胞已經(jīng)分化為半成熟DC，將所述半成熟DC與40 μ g/ml的測試人源化抗體或嵌合抗體、100 μ g/ml KLH或僅培養(yǎng)基預孵育。將半成熟DC與抗原孵育24小時，之后將所述細胞洗漆兩次除去過量的測試抗體并重懸于補充有50ng/ml TNF- a (Peprotech, London, UK)的DC培養(yǎng)基。在第7天，通過更換一半體積的DC培養(yǎng)基(補充有50ng/ml TNFa )來為DC細胞補料，然后在第8天收集成熟DC。對收集的成熟DC進行計數(shù)并使用臺盼藍染色排除來評估生存力。然后，將所述DC進行Y-照射(4000拉德)并以2X105個細胞/ml重懸于AM-V培養(yǎng)基，然后用于ELISpot和增殖測定。另外，在第8天，還制備了新鮮的⑶4+T細胞。為了純化CD4+T細胞，將PBMC在AIM-V?:培養(yǎng)基中復蘇，使用Miltenyi CD4微珠和LS柱(Miltenyi Biotech, Oxford, UK)分離CD4+細胞并將其以2X IO6個細胞/ml重懸于AIM-V?:培養(yǎng)基中。
[0089]在第8天，建立了 T細胞增殖測定，其中在96孔U型底板中，將I X IO5個自體⑶4+T細胞加入到IX ?ο4個負載有人源化抗體或嵌合抗體的DC(比例為ιο:ι)φ，ΜΛΑΙΜ-ν?:培養(yǎng)基至終體積為200 μ I/孔。在第14天，將測定板每孔用25 μ I AMV中的IuCi [3Η](Perkin Elmer, Beaconsfield, UK)進行脈沖 6 小時，然后使用 TomTec Mach III (HamdenCT，USA)細胞收集器在過濾墊(Perkin Elmer)上收集細胞。將所有的抗體制劑在一式六份的培養(yǎng)物中進行測試。每孔的每分鐘計數(shù)(cpm)通過Meltilex? (Perkin Elmer)閃爍計數(shù)法在 1450Microbeta Wallac Trilux Liquid Scintillation Counter (Perkin Elmer)
上在paralux低本底計數(shù)中確定。將每種抗體樣品的每分鐘計數(shù)按僅AIM V?:培養(yǎng)基的對照進行歸一化。
[0090]對于ELISpot 測定，將 ELISpot 板(Millipore, Watford, UK)用 100 μ I/ 孔的 PBS中的IL-2捕獲抗體(R&D Systems, Abingdon, UK)包被。然后，將板在PBS中洗滌兩次，在封閉緩沖液(PBS中1%BSA (Sigma))孵育過夜并在AIM V?:培養(yǎng)基中洗漆。在第8天，在96孔ELISpot板中，將I X IO5個自體⑶4+T細胞加入到I X IO4個負載有抗原的DC(比例為10:1)中。將所有的抗體制劑在一式六份的培養(yǎng)物中進行測試。對于每種供體PBMC，還包括陰性對照(僅AIM V?;培養(yǎng)基)、無細胞對照和PHA (10 μ g/ml)陽性對照。
[0091]在繼續(xù)孵育7天之后，將ELISpot板在dH20和PBS中依次洗滌三次，然后加入100 μ I過濾的PBS/1%BSA中的生物素化檢測抗體(R&DSystems, Abingdon, UK),進行顯影。在37°C下孵育1.5小時后，將板再在PBS中洗滌三次，加入100 μ I過濾的PBS/1%BSA中的抗生物素蛋白鏈菌素-AP (R&D Systems)，維持I小時(在室溫下孵育)。棄去抗生物素蛋白鏈菌素-AP，并將板在PBS中洗滌四次。向每孔加入BCIP/NBT (R&D Systems),并在室溫下孵育30分鐘。通過用dH20洗滌孔和孔背面(back)三次來終止斑點顯影。將干燥的板在Immunoscan ?Analyser上掃描,使用Immunoscan?第4版軟件確定每孔斑點數(shù)(spw)。
[0092]對于增殖測定和IL_2ELISpot測定，結(jié)果表示為刺激指數(shù)(SI)，其定義為測試抗體相對于僅培養(yǎng)基對照的cpm (增殖測定)或斑點(ELISpot測定)的比例，對于陽性T細胞應答使用等于或大于2的SI闕值(SI ^ 2.0)。數(shù)據(jù)顯示，嵌合8H5抗體和嵌合3B10抗體在測試的50份供體PBMC中的8份或更多份中誘導T細胞應答(>=16%)，而所述人源化8H5抗體或3B10抗體沒有一種在50份供體中的多于2份供體中誘導T細胞應答(<=4%，平均數(shù)2%+-2%)，這表明人源化過程有效去除了 V-區(qū)域的T細胞應答。平行地，使用如實施例5所述的方法合成具有全人CTLA4抗體MDXOlO (易普利姆瑪)(Keler et al.，ibid)和Tremelimumab (Ribas et al., ibid)的V-區(qū)域序列的DNA,并用其產(chǎn)生這些抗體的重組IgGl/κ形式。然后，將這些抗體的來源于NSO的制劑用上述相同的50份供體PBMC在一式六份的培養(yǎng)物中針對CD4+輔助T細胞應答的誘導進行測試。對于易普利姆瑪，在平均4份供體中檢測到T細胞應答(8%+-2%)，對于Tremelimumab的IgGl/ κ形式，平均5份供體中檢測到T細胞應答(10%+-2%)，因此表明當在體外測試50份人全血樣品中⑶4+輔助T細胞應答的誘導時，僅本發(fā)明的人源化CTLA4抗體能夠在〈=4%的供體中給出CD4+T細胞應答。
[0093]實施例9-人混合的淋巴細胞細胞反應(MLR)模型
[0094]使用混合的淋巴細胞反應測定測量阻斷CTLA4途徑對IFN- Y分泌的效應，作為人T細胞激活的量度。將來自多個人 供體的新鮮血液(獲自UK National Blood TransfusionService,實施例8)用PBS/2%人血清進行1:1稀釋，并以900g離心使其在Lymphoprep溶液(Nycomed)上分層。將PBMC從分界面移出，洗滌并重懸于AM-V培養(yǎng)基(Invitrogen)。然后，將從不同的不匹配供體對產(chǎn)生的PBMC以1:1比例組合，并鋪板于96孔板中，以提供每樣品孔總共2.5 X IO5個PBMC。加入PHA (植物凝集素，Sigma Aldrich)至終濃度為2 μ g/ml，以刺激T細胞群的增殖。加入首要VH5/VK4 CTLA4抗體，MDXOlO CTLA4對照抗體(實施例8)或同種型對照IgGl抗體至終濃度150 μ g/ml。還使用5 μ g/mlCTLA4-Fc替代抗體作為對照，以證明對IFN-Y分泌的抑制。每孔總的終體積為150μ 1，對于每種供體組合，每種抗體測試五次。將96孔板在正常培養(yǎng)條件孵育72小時，然后取100 μ I上清液用于依照制造商推薦的方法通過ELISA (Thermo scientific,ESS0002)測量IFN-Y。根據(jù)圖19中的數(shù)據(jù)，對于所有的供體組合，所述首要VH5/VK4抗體顯示出比MDX010CTLA4對照抗體更高的T細胞激活，與MDX010相比VH5/VK4的T細胞激活的平均增加為>2倍。
[0095]實施例10-腫瘤動物模型
[0096]腫瘤動物模型被用于在體內(nèi)分析人CTLA4抗體對腫瘤生長的抑制。在所述模型中，在人CTLA4敲入小鼠(Oncolmmune, Inc.)中培養(yǎng)MC38鼠結(jié)腸腫瘤細胞(Corbett etal., (1975) Cancer Res35:2434-2439，由 Oncolmmune, Inc.，Ann Arbor, USA 提供)。
[0097]對CTLA4敲入小鼠(7-10周齡，各組中雄性和雌性相等分布)側(cè)面皮下注射0.1ml體積的5X105個MC38腫瘤細 胞。從給予腫瘤細胞之后的那天(“第2天”)起，每周以5mg/kg或10mg/kg劑量(劑量體積10ml/kg)注射所述首要VH5/VK4CTLA4抗體、MDX010 (實施例8)或同種型匹配對照抗體。在實驗過程中，每兩周一次通過測徑器測量取得腫瘤測量結(jié)果，腫瘤大小表示為立方體積(mm3)。跟蹤動物直至腫瘤體積達到2000mm3，或直到注射腫瘤細胞后的第45天。實施例19示出的結(jié)果表明，與MDX010相比首要VH5/VK4CTLA4抗體提高了對腫瘤生長的抑制。
【權利要求】
1.一種抑制CTLA4結(jié)合人B7的CTLA4抗體。
2.權利要求1的CTLA4抗體，其抑制CTLA4結(jié)合人B7.1和/或人B7.2。
3.權利要求1或權利要求2的CTLA4抗體，其包含具有至少一個、兩個、三個、四個或五個選自以下的CDR序列的可變區(qū)； (i)包含序列DYNMD (SEQ ID NO:9)的 CDRHl (ii)包含序列NINPNSEST SYNQKFKG (SEQ ID NO: 10)的 CDRH2 (iii)包含序列DGNRYDAWFAY (SEQ ID NO: 11)的 CDRH3 (iv)包含序歹IjSASSSVTYMH (SEQ ID NO: 12)的 CDRLl ； (V)包含序列 STSILAS (SEQ ID NO: 13)的 CDRL2 ;和 (vi)包含序列 QQRTSYPLT (SEQ ID NO: 14)的 CDRL3。
4.權利要求1或權利要求2的CTLA4抗體，其包含具有至少一個、兩個、三個、四個或五個選自如下的CDR序列的可變區(qū)； (i)包含序列SYWIN (SEQ ID NO:15)的 CDRHl (ii)包含序列RIAPGSGTTYYNEVFKG (SEQ ID NO: 16)的 CDRH2 (iii)包含序列⑶YGSY(SEQ ID NO:17)的 CDRH3 (iv)包含序列SASSSISYMH (SEQ ID NO: 18)的 CDRLl ； (V)包含序列 DTSKLAS (SEQ ID NO: 19)的 CDRL2 ;和 (vi)包含序列 HQRTSYPLT (SEQ ID NO:20)的 CDRL3。
5.權利要求1或權利要求2的CTLA4抗體，其包含選自SEQID NO:31-35的可變區(qū)序列用于重鏈可變區(qū)，選自SEQ ID NO:36-40的可變區(qū)序列用于輕鏈可變區(qū)。
6.權利要求1或權利要求2的CTLA4抗體，其包含選自SEQID NO:41-45的可變區(qū)序列用于重鏈可變區(qū)，選自SEQ ID NO:46-50的序列用于輕鏈可變區(qū)。
7.權利要求6的CTLA4抗體，其包含SEQID NO: 45用于重鏈可變區(qū)，SEQ ID NO: 49用于輕鏈可變區(qū)。
8.權利要求1-7任一項的CTLA4抗體，當在具有人群HLA-DR同種異型分布的至少50份人血樣中體外測試CD4+輔助T細胞應答的誘導時，所述CTLA4抗體給出〈=4%的T細胞應答。
9.權利要求1-8的抗體，其中所述可變區(qū)序列全部來源于人抗體可變區(qū)中的序列。
10.權利要求1-9的抗體，其中結(jié)合人CTLA4可阻斷結(jié)合人B7.1或B7.2至少90%。
11.權利要求1-10的抗體，其以至少10_8M的平衡解離常數(shù)(Kd)結(jié)合人CTLA4。
12.權利要求1-11的抗體，其由可變區(qū)以及同種型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恒定區(qū)或突變的IgG恒定區(qū)和同種型K的輕鏈恒定區(qū)組成。
13.權利要求12的抗體，其中所述人恒定區(qū)為IgGl和K。
14.權利要求12的抗體，其中所述人恒定區(qū)為IgG4和K。
15.權利要求1-11的抗體，其中所述抗體為scFv或Fab。
16.—種多特異性抗體,其包含一種或多種權利要求1-15的抗體。
17.—種多核苷酸,其編碼權利要求1-16任一項的抗體。
18.—種載體，其包含權利要求17的多核苷酸。
19.權利要求18的載體，其中所述載體為表達載體。
20.一種宿主細胞，其包含權利要求18或19的載體。
21.權利要求20的宿主細胞，其中所述宿主細胞是原核細胞
22.權利要求20的宿主細胞，其中所述宿主細胞是真核細胞。
23.權利要求22的宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。
24.一種組合物，其包含權利要求1-16任一項的CTLA4抗體。
25.一種組合物，其包含權利要求17-19任一項的多核苷酸。
26.一種治療疾病的方法，其包括向需要這種治療的受試者給予有效量的權利要求1-16任一項的抗體或權利要求17-19任一項的多核苷酸，所述疾病包括癌癥、細胞增殖性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(CNS)、血液系統(tǒng)疾病、炎性疾病、傳染性疾病、變態(tài)反應、T-細胞相關疾病、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病。
27.一種治療癌癥的方法，其包括向需要這種治療的受試者給予有效量的權利要求1-16任一項的抗體或權利要求17-19任一項的多核苷酸,其中所述癌癥為前列腺癌、腎癌、結(jié)腸癌、肺癌或乳癌。
28.權利要求26或27的方法，其還包括共給予有效量的化學治療劑。
29.權利要求26-28任一項的方法，其還包括共給予藥物載體，所述藥物載體包括疫苗。
30.權利要求1-16任一項的抗體在用于體外或體內(nèi)檢測樣品中人CTLA4抗原的存在情況以診斷人CTLA4相關疾病的方法中的用途。
31.權利要求1-16任一項的抗體或權利要求17-19任一項的多核苷酸用于治療疾病的用途，所述疾病包括癌癥、細胞增殖性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(CNS)、血液系統(tǒng)疾病、炎性疾病、傳染性疾病、變態(tài)反應、T-細胞相關疾病、移植物抗宿主病或宿主抗移植物病。
【文檔編號】C07K16/28GK103547595SQ201280022428
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年3月9日 優(yōu)先權日:2011年3月9日
【發(fā)明者】T·D·瓊斯, R·G·E·霍爾蓋特, F·J·凱爾 申請人:安迪拓普有限公司