粗毛韌革菌菌體在制備銀杏內(nèi)酯b中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了粗毛韌革菌菌體在制備銀杏內(nèi)酯B中的應(yīng)用，本發(fā)明通過對(duì)粗毛韌革菌菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，從試管斜面、液體搖瓶、種子培養(yǎng)和菌體分離，利用菌體作為催化劑，轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯合成銀杏內(nèi)酯B，轉(zhuǎn)化液經(jīng)過離心、乙酸乙酯萃取、無水酒精結(jié)晶把銀杏內(nèi)酯B從發(fā)酵液分離出來。利用該方法所得到的銀杏內(nèi)酯B的純度≥99％，銀杏內(nèi)酯轉(zhuǎn)化率>90％。
【專利說明】粗毛韌革菌菌體在制備銀杏內(nèi)酯B中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及粗毛韌革菌菌體在制備銀杏內(nèi)酯B中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]研究證明銀杏內(nèi)酯是銀杏葉中主要的活性成分之一，是一類特異有效的血小板活化因子(Platelet activating factor PAF)受體拮抗劑。血小板活化因子是由血小板和多種炎癥組織分泌產(chǎn)生的一種內(nèi)源性磷酯，是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的血小板聚集誘導(dǎo)劑，與許多疾病的產(chǎn)生、發(fā)展密切相關(guān)。銀杏內(nèi)酯作為PAF受體特異性拮抗劑，具有廣泛的藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)與缺血損傷有保護(hù)作用，抗休克、抗過敏、抗菌抗炎作用，以及抗器官移植中的排斥反應(yīng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B可降低肝門靜脈壓提高全身血管耐受性，說明它對(duì)肝硬化有一定的療效。銀杏內(nèi)酯對(duì)于腎損傷有治療作用。這些作用都與銀杏內(nèi)酯B作為 PAF受體拮抗劑有關(guān)，并且它目前被認(rèn)為是作用最強(qiáng)的、最有臨床應(yīng)用前景的天然血小板活化因子(PAF)受體拮抗劑。
[0003]目前國內(nèi)外生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B的方法主要是從銀杏葉提取物，已見報(bào)導(dǎo)的銀杏內(nèi)酯B的專利共有51篇，其中一部分是關(guān)于銀杏內(nèi)酯B的制劑的制備(如:一種銀杏內(nèi)酯B固體分散體及其制備方法，申請?zhí)?CN200910204198.4)，三篇關(guān)于銀杏內(nèi)酯B及其衍生物的生理學(xué)功能(銀杏內(nèi)酯B的一種新用途；申請?zhí)?CN200910092750.5 ;銀杏內(nèi)酯B衍生物在制藥中的新用途，申請?zhí)?CN200910234319.X ;銀杏內(nèi)酯B水解衍生物及其用途，申請?zhí)?CN201010122039.2)。而關(guān)于銀杏內(nèi)酯B的制備只有九篇(一種從銀杏葉或銀杏葉提取物中提取銀杏內(nèi)酯B的新方法，申請?zhí)?00510063407.X ;—種從銀杏內(nèi)酯混合物中分離銀杏內(nèi)酯B的方法，申請?zhí)?CN201010608847.X，等等)，銀杏內(nèi)酯中含有銀杏內(nèi)酯A、B、C、M等同系物，這些專利是采用分離技術(shù)從銀杏內(nèi)酯混合物中分離銀杏內(nèi)酯B，難以在工業(yè)上大批量生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供的是粗毛韌革菌菌體在制備銀杏內(nèi)酯B中的應(yīng)用，該以粗毛韌革菌(Stereum hirsutum)為菌種通過液體培養(yǎng)技術(shù)得到菌體,菌體作為催化劑,轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯A、C和M生成銀杏內(nèi)酯B，以及通過提取步驟獲得銀杏內(nèi)酯B制品。
[0005]本發(fā)明一方面涉及粗毛韌革菌菌體在制備銀杏內(nèi)酯B中的應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟:
[0006]在銀杏內(nèi)酯(包括銀杏內(nèi)酯A、B、C和M)加入蒸餾水和酸，調(diào)節(jié)ρΗ6.0-7.0，配成20-30克銀杏內(nèi)酯/升的反應(yīng)液，將粗毛韌革菌和反應(yīng)液按照重量/體積1:20-30混合，在溫度20-30°C，攪拌速率100-150轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)10小時(shí)以上；
[0007]反應(yīng)之后的反應(yīng)液按照4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10_20分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調(diào)節(jié)PH2.0-3.0,連續(xù)用乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C以下結(jié)晶70小時(shí)以上，過濾，濾渣水洗，干燥得到銀杏內(nèi)酯B。
[0008]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的粗毛韌革菌通過如下方式獲得:以粗毛韌革菌為出發(fā)菌株，進(jìn)行試管菌種傳代、液體搖瓶菌種、種子罐菌種、催化轉(zhuǎn)化等步驟制得含有銀杏內(nèi)酯B的轉(zhuǎn)化液，含有銀杏內(nèi)酯B的轉(zhuǎn)化液經(jīng)過離心、乙酸乙酯萃取、濃縮、酒精復(fù)溶，-20°C結(jié)晶、過濾、烘干等提取工藝得到銀杏內(nèi)酯B晶體。其中所述的試管菌種的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(葛健，王正祥，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊，1994:P367);其中所述的試管斜面菌種培養(yǎng)工藝為斜面菌種切成4X4mm小塊菌種，挑取一小塊轉(zhuǎn)接含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的試管中，20-32°C培養(yǎng)5-20天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆?；其中所述的液體搖瓶培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白胨I-20，KH2PO4I-6，MgSO4I-4，加水至適當(dāng)體積，起始pH值為5.0-8.0，100-140°C滅菌20-60分鐘；其中所述的搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是:250mL三角瓶裝液量為60-150mL，接種3-4塊4X4mm小塊菌種，置于溫度22-30°C，轉(zhuǎn)速120-160轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間24-48小時(shí)；其中所述的種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白胨I-10，KH2PO4I-6，MgSO41-4，消泡劑0.1-
0.8，加水至適當(dāng)體積，起始pH值為5.0-8.0,100-140°C滅菌20-60分鐘；其中所述種子罐的培養(yǎng)條件是:接種量5-10% (種子液體積/接種后體積),培養(yǎng)溫度22-30°C，攪拌速率90-150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0.3-Iv / V / m，培養(yǎng)時(shí)間80-90小時(shí)；其中所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液為(單位為克/升):銀杏內(nèi)酯10-50，起始pH值為5.0-8.0 ;其中所述的轉(zhuǎn)化工藝條件是:種子液4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5-20分鐘，收集菌體，菌體與反應(yīng)液按1:5-50 (重量:體積)混勻，在溫度22-30°C，攪拌速率90-150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0.3-Iv / V / m，反應(yīng)6-18小時(shí)；其中所述的銀杏內(nèi)酯B提取工藝為，轉(zhuǎn)化液4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-20分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調(diào)節(jié)pHl.0-4.0，連續(xù)用0.3-3倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C結(jié)晶24-120小時(shí)，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內(nèi)酯B純品。`
[0009]本發(fā)明所使用的粗毛韌革菌菌種為金耳的伴生菌，可選任意一種金耳子實(shí)體，例如云南、西藏或山西的金耳子實(shí)體，通過組織分離即可得到野粗毛韌革菌菌種。該菌不形成或很難形成子實(shí)體，菌絲體遇氫氧化鉀溶液變暗或變黑。生殖菌絲疏松地交織在一起，分枝，有鎖狀聯(lián)合，近無色。
[0010]本發(fā)明所述的工藝銀杏內(nèi)酯B白色，純度> 99%，銀杏內(nèi)酯轉(zhuǎn)化率>90%。
[0011]根據(jù)此工藝采用的銀杏內(nèi)酯測定方法為:精密稱取銀杏內(nèi)酯B對(duì)照品10mg，溶于ImL色譜級(jí)甲醇中，配制成10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。0.2 μ m微孔濾膜過濾，控制進(jìn)樣量為1,2, 3,4, 5，6，7和8μ 1，利用高效液相色譜儀(HIMADZU(島津)LC-20AT)測定銀杏內(nèi)酯B含量。色譜柱為硅膠柱(4.6.ιΧ250πιπι，5μπι)。測定條件為流動(dòng)相:甲醇:0.1 %磷酸溶液=10:90 ;柱溫:30°C，流速:0.8mL / min，檢測波長:270nm。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，求得銀杏內(nèi)酯濃度與峰面積的線性回歸方程。吸取樣品液(發(fā)酵過程中和發(fā)酵后)的上清液少量，用0.45 μ m微孔濾膜過濾，按上述色譜條件分別測定峰面積，采用外標(biāo)峰面積根據(jù)上述求得的銀杏內(nèi)酯B濃度與峰面積的回歸方程計(jì)算銀杏內(nèi)酯B含量。
[0012]銀杏內(nèi)酯B轉(zhuǎn)化率按下列公式⑴計(jì)算:
[0013]
[0014]式中，Rt為t時(shí)間銀杏內(nèi)酯B的轉(zhuǎn)化率；C0(mg / L)，V0(mL)為O小時(shí)加入的銀杏內(nèi)酯濃度和反應(yīng)液體積；Ct(mg/L)和Vt(mL)為反應(yīng)t小時(shí)銀杏內(nèi)酯B的濃度和反應(yīng)液體積。
【具體實(shí)施方式】
[0015]為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案所涉及的材料及工藝，給出了以下實(shí)施例。這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0016]實(shí)施例1
[0017]試管菌種的制備
[0018]馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的制備:稱取馬鈴薯200g，切成片狀、加入IOOOmL水，煮沸30分鐘，過濾，濾液定各至IOOOmL,加入瓊脂20g,加熱待瓊脂完全融化后，分裝18 X 200mm的試管，每管15mL培養(yǎng)基，120°C滅菌30分鐘，冷卻到50°C，擺成斜面，斜面長度為試管長度的一半；將保藏的從金耳子實(shí)體中分離的粗毛韌革菌菌種切成4X4mm小塊菌種，挑取一小塊轉(zhuǎn)接含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的試管中，20°C培養(yǎng)20天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0019]含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液的制備
[0020]1、液體搖瓶菌種的制備
[0021]液體搖瓶菌種培養(yǎng)基配方為(單位為克/升)葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨1，KH2PO4I,MgSO4I,起始pH值為5.0。共配制5500mL，分裝250mL三角瓶，每瓶60mL，共84瓶，100°C滅菌60分鐘。共配制5500mL，分裝250mL三角瓶，每瓶60mL，共84瓶，將保存的從云南金耳子實(shí)體中分離的粗毛韌革菌試管斜面菌種切成4X4mm大小的小塊，挑取3塊轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于22°C、90轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)24小時(shí)。
[0022]2、種子罐菌種的制備
[0023]75L種子罐裝有45L種子培養(yǎng)基，其中種子培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨1，KH2PO4I, MgSO4I，消泡劑0.5，起始pH值為5.0,100。。滅菌60分鐘，冷卻后，將上述培養(yǎng)的菌種5000mL接入種子罐中，即接種量10% (種子液體積/接種后體積)，維持罐溫22°C，罐壓0.05MPa,攪拌速度90轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0.3v / v / m,發(fā)酵時(shí)間90小時(shí)。
[0024]3、銀杏內(nèi)酯B轉(zhuǎn)化
[0025]種子液4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收集菌體，得到鮮菌體2kg。準(zhǔn)確稱取銀杏內(nèi)酯100克，加蒸餾水10L，用鹽酸調(diào)節(jié)pH5.0，配成10克/升的反應(yīng)液，2kg與IOL反應(yīng)液(1:5，重量/體積)混合，在溫度22°C，攪拌速率90轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0.3v / V / m,反應(yīng)18小時(shí)。
[0026]4、銀杏內(nèi)酯B的提取
[0027]上述反應(yīng)液4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調(diào)節(jié)pH4.0,連續(xù)用3倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C結(jié)晶24小時(shí)，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內(nèi)酯B純品。經(jīng)分析銀杏內(nèi)酯B含量99.1%，轉(zhuǎn)化率90.8%。
[0028]含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液的制備
[0029]1、搖瓶菌種的制作
[0030]搖瓶培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH2P043，MgS042，起始pH值為6.5，共配制4500mL,分裝250mL三角瓶(共50瓶)，每瓶90mL, 120。。滅菌40分鐘。冷卻后，將保存的從山西金耳子實(shí)體中分離的粗毛韌革菌試管斜面菌種切成4 X 4mm大小的小塊,試管斜面菌種切成4 X 4mm大小的小塊,挑取4塊轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶培養(yǎng)基的三角瓶中，置于25°C、120轉(zhuǎn)/分鐘搖床上，培養(yǎng)36小時(shí)。
[0031]2、種子罐菌種的制備
[0032]100L種子罐裝有50L種子培養(yǎng)基，其中種子罐培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH2P043, MgS042，消泡劑0.1，起始pH值為6.5，120°C滅菌40分鐘。冷卻后，將上述培養(yǎng)的菌種4000mL接入100L種子罐中，即接種量7.4% (種子液體積/接種后體積)，種子罐中發(fā)酵液的總體為54L ;維持罐溫25°C，罐壓0.05MPa,攪拌速度120轉(zhuǎn)每分鐘，通風(fēng)量1:0.5v / V / m，培養(yǎng)時(shí)間90小時(shí)。
[0033]3、銀杏內(nèi)酯B轉(zhuǎn)化
[0034]種子液5000轉(zhuǎn)/分鐘離心12分鐘收集菌體，得到鮮菌體3.5kg。準(zhǔn)確稱取銀杏內(nèi)酯1250克，加蒸餾水50L，用鹽酸調(diào)節(jié)pH6.5，配成25克/升的反應(yīng)液，2kg與50L反應(yīng)液(1:25，重量/體積)混合，在溫度25°C，攪拌速率120轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0.8v / v / m，反應(yīng)12小時(shí)。`
[0035]4、銀杏內(nèi)酯B的提取
[0036]上述反應(yīng)液5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調(diào)節(jié)pH2.5，連續(xù)用2倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于-20°C結(jié)晶72小時(shí)，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內(nèi)酯B純品，經(jīng)分析銀杏內(nèi)酯B含量99.5 %，轉(zhuǎn)化率95.8%。
[0037]實(shí)施例4含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液的制備
[0038]1、搖瓶菌種的制作
[0039]搖瓶培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH2P046，MgS044,起始pH值為8.0。共配制2000mL，分裝250mL三角瓶(共10瓶)，每瓶150mL，140°C滅菌20分鐘。冷卻后，將保存的從西藏金耳子實(shí)體中分離的粗毛韌革菌試管斜面菌種切成4X 4mm大小的小塊，挑取4塊轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶培養(yǎng)基的三角瓶中，置于30°C、150轉(zhuǎn)/每分鐘搖床上培養(yǎng)46小時(shí)。
[0040]2、種子罐菌種的制備
[0041]50L種子罐裝有30L種子培養(yǎng)基，其中種子罐培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升):葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH2P046,MgS044,消泡劑0.8，起始pH值為8.0,140°C滅菌20分鐘。冷卻后，將上述液體搖瓶培養(yǎng)的菌種1600mL接入50L種子罐中，即接種量5.1%(種子液體積/接種后體積);維持罐溫30°C，罐壓0.05MPa,攪拌速度150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:lv / V / m,發(fā)酵時(shí)間90小時(shí)。[0042]3、銀杏內(nèi)酯B轉(zhuǎn)化
[0043]種子液6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘收集菌體，得到鮮菌體1.2kg。準(zhǔn)確稱取銀杏內(nèi)酯3000克，加蒸餾水60L，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH8.0，配成50克/升的反應(yīng)液，1.2kg鮮菌體與60L反應(yīng)液(1:50，重量/體積)混合，在溫度30°C，攪拌速率150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:1v / V / m,反應(yīng)6小時(shí)。
[0044]4、銀杏內(nèi)酯B的提取
[0045]上述反應(yīng)液6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調(diào)節(jié)pHl.0,連續(xù)用0.3倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于-20 0C結(jié)晶120小時(shí)，過濾，濾渣水洗，80 0C干燥得到銀杏內(nèi)酯B純品。經(jīng)分析銀杏內(nèi)酯B含量99.9 %，轉(zhuǎn)化率98.5.8%。
[0046]以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的 保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.粗毛韌革菌菌體在制備銀杏內(nèi)酯B中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于以粗毛韌革菌為出發(fā)菌株，通過試管斜面菌種、液體搖瓶菌種、種子罐菌種、離心獲得菌體，菌體催化銀杏內(nèi)酯合成含有銀杏內(nèi)酯B的反應(yīng)液，含有銀杏內(nèi)酯B的反應(yīng)液經(jīng)過離心、乙酸乙酯萃取、濃縮、酒精復(fù)溶，-20°C結(jié)晶、過濾、烘干等提取工藝得到銀杏內(nèi)酯B晶體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述的粗毛韌革菌菌種為從云南、山西和西藏的任意一種金耳子實(shí)體中分離出的金耳伴生菌菌種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于粗毛韌革菌通過液體搖瓶、種子罐和菌體轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯，分離提取得到銀杏內(nèi)酯B。其中所述的液體搖瓶種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白胨I-20，KH2PO4I-6，MgSO4I-4，加水至適當(dāng)體積，起始PH值為5.0-8.0,100-140°C滅菌20-60分鐘；其中所述的種子罐培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白胨I-10，KH2PO4I-6，MgSO4I-4，消泡劑0.1-0.8，加水至適當(dāng)體積，起始pH值為5.0-8.0,100-140°C滅菌20-60分鐘；其中所述轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯反應(yīng)液組成為(單位為克/升):銀杏內(nèi)酯10-50，起始PH值為5.0-8.0 ;其中所述的搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是:250mL三角瓶裝液量為60-150mL，接種3-4塊4X4mm小塊菌種，置于溫度22-30°C，轉(zhuǎn)速120-160轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間24-48小時(shí)；其中所述種子罐的培養(yǎng)條件是:接種量5-10% (種子液體積/接種后體積)，培養(yǎng)溫度22-30°C，攪拌速率90-150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0.3-Iv / v / m，培養(yǎng)時(shí)間80-90小時(shí)；其中所述的轉(zhuǎn)化工藝條件是:種子液4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5-20分鐘，收集菌體，菌體與反應(yīng)液按1:5-50 (重量:體積)混勻，在溫度22-30°C，攪拌速率90-150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1: 0.3-Iv / V / m，轉(zhuǎn)化6-18小時(shí)；按照該轉(zhuǎn)化工藝，其中在進(jìn)行搖瓶培養(yǎng) 之前，首先將粗毛韌革菌的斜面菌種接入新配制的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22-30°C，培養(yǎng)時(shí)間24-248小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，轉(zhuǎn)化液4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘離心，濾液用鹽酸或硫酸調(diào)節(jié)pHl.0-4.0，連續(xù)用0.3-3倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C結(jié)晶24-120小時(shí)，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內(nèi)酯B純品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，制得的銀杏內(nèi)酯B白色，純度>99%，銀杏內(nèi)酯轉(zhuǎn)化率>90%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟: 在銀杏內(nèi)酯(包括銀杏內(nèi)酯A、B、C和M)加入蒸餾水和酸，調(diào)節(jié)pH6.0-7.0，配成20-30克銀杏內(nèi)酯/升的反應(yīng)液，將粗毛韌革菌和反應(yīng)液按照重量/體積1:20-30混合，在溫度20-30°C，攪拌速率100-150轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)10小時(shí)以上； 反應(yīng)之后的反應(yīng)液按照4000-6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-20分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調(diào)節(jié)PH2.0-3.0，連續(xù)用乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C以下結(jié)晶70小時(shí)以上，過濾，濾渣水洗，干燥得到銀杏內(nèi)酯B。
【文檔編號(hào)】C07D493/22GK103450217SQ201310393185
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】張志才 申請人:張志才