一種裂解胸腺素β4的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種裂解胸腺素β4的方法,包括對(duì)胸腺素β4肽樹脂進(jìn)行裂解得到粗肽的步驟;所述裂解,采用三氟乙酸、茴香硫醚、乙二硫醇、苯酚、水、甲硫醚、碘化銨的混合溶劑作為裂解試劑;本發(fā)明的裂解胸腺素β4的方法,大大提高了粗肽純度,同時(shí)大大提高了總收率,降低了生產(chǎn)成本,工藝簡單,便于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】—種裂解胸腺素β 4的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多肽的裂解方法,具體涉及胸腺素β 4的裂解方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胸腺肽(thymosin)由Goldstein和White于1966年首次從小牛胸腺中提取得到。根據(jù)等電點(diǎn)的不同,可將胸腺肽分為α (ΡΙ〈5)、β (5〈ΡΙ〈7)和Y(ΡΙ>7)等3類,目前已有20多種β胸腺肽(Τ β )異構(gòu)體被鑒定,而人體內(nèi)主要存在3種,即胸腺素β4 (Τβ4)、Τβ 10和Τβ 15,其中胸腺素β 4含量最高。胸腺素β 4是由43個(gè)氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)高度保守的水溶性多肽,相對(duì)分子質(zhì)量為4964。
[0003]胸腺素β 4的分子式為: Ac-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-1le-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-S er—Lys—Leu—L
ys-LyS-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Se r-Lys-Glu-Thr-1Ie-Glu-Gln-GIu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-OH胸腺素β 4被認(rèn)為是主要的球形肌動(dòng)蛋白(G-肌動(dòng)蛋白)結(jié)合肽,能與G-肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合從而阻斷其聚合。此外,胸腺素β 4還具有多種生物學(xué)功能,如促進(jìn)血管生成、創(chuàng)傷愈合、角膜修復(fù)、抑制炎癥,以及調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移等。
[0004]最近的研究發(fā)現(xiàn),在心肌、角膜和皮膚的創(chuàng)傷愈合過程中,胸腺素β 4主要是作為一種化學(xué)誘導(dǎo)因子,調(diào)節(jié)多種生長因子的表達(dá)以及趨化新生細(xì)胞的遷移。由于機(jī)體自身修復(fù)愈合的能力極其有限,一旦發(fā)生損傷或者病變很難自愈,甚至導(dǎo)致潰瘍或瘢痕形成,多需要外緣性修復(fù)或啟動(dòng)內(nèi)源性修復(fù),但目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的藥物,胸腺素β 4為創(chuàng)傷愈合藥物的研究提供了一個(gè)新方向。
[0005]裂解是將肽樹脂經(jīng)過裂解試劑處理得到粗肽的過程,目前,胸腺素β 4以及其他多肽類產(chǎn)品的裂解方法主要有以下方法:
方法I氟化氫裂解,第一步先將氟化氫氣體冷凍成液體,第二步將氟化氫液體加入到樹脂中反應(yīng)2小時(shí),控制反應(yīng)溫度O度,裂解完畢真空抽走氟化氫,第三步用乙醚洗滌樹脂,第四步過濾除掉乙醚,第五步用水溶解粗肽過濾除掉樹脂,得到粗肽水溶液。
方法2對(duì)三氟甲基水楊酸裂解,第一步配置裂解液30% 二甲硫醚、20%清除劑、40%三氟乙酸、10%三氟甲基水楊酸,第二步將樹脂加入裂解液中裂解2小時(shí),第三步過濾抽去反應(yīng)液,保留樹脂,第四步將樹脂再次用100%三氟甲基水楊酸裂解2小時(shí),第五步過濾收集濾液,加乙醚沉淀,離心得到粗肽。
上述方法存在以下缺陷:
方法I所需的設(shè)備要求高,成本投入較大,操作危險(xiǎn)性大,對(duì)環(huán)境污染較嚴(yán)重。
方法2操作過程繁瑣,且操作危險(xiǎn)性大,試劑使用量大,使產(chǎn)品成本提高。
由于胸腺素β 4具有特殊性,上述方法不適合胸腺素β 4的裂解,本發(fā)明經(jīng)過研究,找到了一種新的裂解方法,特別適合胸腺素β 4的裂解。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種胸腺素β4的裂解方法,提高胸腺素β4的粗肽純度,進(jìn)而提聞總收率。
[0007]本發(fā)明提供一種裂解胸腺素β 4的方法,包括以下步驟:1)胸腺素β 4肽樹脂的制備,2)對(duì)胸腺素β 4肽樹脂裂解得到粗品胸腺素β 4,3)精制。
其中,I)胸腺素β 4肽樹脂的制備包括以下步驟:
[0008]用Fmoc-Ser (tbu)-OH和羥基樹脂,得到Fmoc-Ser (tbu)-羥基樹月旨;將Fmoc-Ser (tbu)-羥基樹脂逐一偶聯(lián)得到胸腺素β 4肽樹脂。
優(yōu)選可以采用以下方法進(jìn)行多肽的固相合成: 其中所述的羥基樹脂選自:wang樹脂、二氯三苯甲基氯樹脂,優(yōu)選wang樹脂。因?yàn)閣ang樹脂比二氯三苯甲基氯樹脂更穩(wěn)定,價(jià)格更低。Fmoc-Ser (tbu)-羥基樹脂的制備優(yōu)選如下操作:將wang樹脂加入反應(yīng)柱中,加入DMF溶脹,溶脹結(jié)束,將Fmoc-Ser (tbu)-OH、HOBT,DMAP和DIC用DMF溶解后加入至上述反應(yīng)柱中,室溫下氮?dú)夤呐?20分鐘,反應(yīng)完成,抽去反應(yīng)液,用DMF洗滌3次,加入乙酸酐、吡啶反應(yīng)120分鐘,抽去反應(yīng)液,用DMF洗滌3次,DCM洗滌3次,甲醇洗滌3次。
[0014]所述由Fmoc-Ser (tbu)-0H、羥基樹脂出發(fā)得到Fmoc-Ser (tbu)-羥基樹脂和由Fmoc-Ser (tbu)-羥基樹脂采用Fmoc/tbu策略逐一偶聯(lián)得到胸腺素β 4肽樹脂,所使用的偶聯(lián)劑體系為HOBT和DIC,或者偶聯(lián)劑體系為TBTU和DIEA。其中步驟2)中胸腺素β 4肽樹脂的制備優(yōu)選如下,將Fmoc-Ser (tbu)-羥基樹脂加入到反應(yīng)柱中,加入DMF溶脹后,用25%六氫吡啶的DMF溶液脫FMOC兩次,每次15-20分鐘,然后用DMF洗滌6次,將Fmoc-Glu(otbu)-0H,HOBT和DIC用DMF溶解后加入至上述反應(yīng)柱中,室溫下氮?dú)夤呐?20分鐘,茚三酮檢測反應(yīng)完全,真空抽去反應(yīng)液,用DMF洗滌3次,用25%六氫吡啶的DMF溶液脫FMOC兩次,每次15-20分鐘,然后用DMF洗滌6次,重復(fù)偶聯(lián)Fmoc-Glu (otbu) -OH的操作,接下來對(duì)
Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)_0H、
Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、
Fmoc-Glu (otbu) -OH、Fmoc-1le_0H、Fmoc-Thr (tBu) -OH、
Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、
Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、
Fmoc-Lys(Boc) -OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、
Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(otbu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、
Fmoc-Lys(Boc) -OH、Fmoc-Lys(Boc) -OH、Fmoc-Leu-OH、
Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、
Fmoc-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys (Boc) -OH、
Fmoc-Glu (otbu) -OH、Fmoc-1le_0H、Fmoc-Glu (otbu) -OH、
Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、
Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH和
Fmoc-Ser (tBu) -OH進(jìn)行偶聯(lián),最后得到
Fmoc-Ser(tbu)-Asp(otbu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(otbu)-Met-Ala-Glu(otb u)-1le-Glu(otbu)-Lys(Boc)-Phe-Asp(otbu)-Lys(Boc)-Ser(tbu)-Lys(B oc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tbu)-Glu(otbu)-Thr(tbu)-Gln(trt)-G Iu(otbu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Pro-Leu-Pro-Ser(tbu)-Lys(Boc)-Glu(otb u)-Thr(tbu)-1le_Glu(otbu)-Gln(trt)-Glu(otbu)-Lys (Boc) -Gln (trt) -Ala-Gly-Glu (otbu) -Ser (tbu) -wang樹脂,用 25%六氫吡唳的 DMF溶液脫FMOC兩次,每次15-20分鐘,然后用DMF洗滌6次,加入乙酸酐和吡啶,室溫下氮?dú)夤呐?20分鐘,反應(yīng)結(jié)束,抽去反應(yīng)液,用DMF洗滌3次,DCM洗滌3次,甲醇洗滌3次,真空干燥,得到胸腺素β 4肽樹脂,
AC-Ser (tbu)-Asp (otbu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(otbu)-Met-Ala-Glu(otbu)-1le-Glu(otbu)-Lys(Boc)-Phe-Asp(otbu)-Lys(Boc)-Ser(tbu)-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tbu)-Glu(otbu)-Thr(tbu)-Gln(trt)-Glu(otbu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Pro-Leu-Pro-Ser(tbu)-Lys(Boc)-Glu(otbu)-Thr(tbu)-1le-Glu(otbu)-Gln(trt)-Glu(otbu)-Lys (Boc) -Gln (trt) -Ala-Gl y-Glu (otbu) -Ser (tbu) -wang 樹脂。
本發(fā)明最重要的發(fā)明點(diǎn)為2)對(duì)胸腺素β 4肽樹脂裂解得到粗品胸腺素β4的方法,所述方法步驟如下:
[0009]將裂解試劑和胸腺素β 4肽樹脂混合反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后,過濾,收集濾液,將濾液加入冰乙醚中沉淀,過濾,收集固體,得到胸腺素β 4粗肽。
其中所述裂解試劑是三氟乙酸:茴香硫醚:乙二硫醇:苯酚:水:甲硫醚:碘化銨的混合物。
它們的質(zhì)量配比如下:三氟乙酸:茴香硫醚:乙二硫醇:苯酚:水:甲硫醚:碘化銨=(81 ~85): (2 ~6): (I ~ 5): (2 ~6): (I ~5): (I ~3):(0.5 ~1.5)。
最優(yōu)選:
三氟乙酸:茴香硫醚:乙二硫醇:苯酚:水:甲硫醚:碘化銨=83.5:4:3:4:3:2:0.5。
三氟乙酸:茴香硫醚:乙二硫醇:苯酚:水:甲硫醚:碘化銨=83:4:3:4:3:2:1。
三氟乙酸:茴香硫醚:乙二硫醇:苯酚:水:甲硫醚:碘化銨=82:4:3:4:3:2:2。
其中裂解試劑和胸腺素β 4肽樹脂的重量比例可以是93%-99%:
1%~7%之間,優(yōu)選95%:5%。
[0010]本發(fā)明優(yōu)選的裂解方法如下:
稱量93%-99%重量份的裂解試劑:三氟乙酸,茴香硫醚,乙二硫醇,苯酚,水,甲硫醚,碘化銨的混合溶液至燒杯中,攪拌均勻,稱量1%~7%重量份的胸腺素β4肽樹脂,加入上述燒杯中,反應(yīng)100-150分鐘,反應(yīng)結(jié)束,用砂芯漏斗過濾上述反應(yīng)液,收集濾液,用三氟乙酸洗滌濾餅,合并濾液,將濾液加入冰乙醚中沉淀,用砂芯漏斗過濾,收集濾餅,用冰乙醚洗滌濾餅,濾餅放入真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行真空干燥,得到胸腺素β 4粗肽。
[0011]本發(fā)明進(jìn)一步包括對(duì)胸腺素β 4粗肽進(jìn)行3)精制的過程,所述精制,步驟如下: 粗肽經(jīng)過純化、轉(zhuǎn)鹽、凍干得到胸腺素β4精肽;
[0012]其中:粗肽經(jīng)過純化、轉(zhuǎn)鹽、凍干得到胸腺素β 4精肽;是采用反相高效液相色譜法進(jìn)行純化、轉(zhuǎn)鹽,色譜柱為十八烷基鍵合硅膠的反相硅膠柱,最后通過凍干得到胸腺素β4精肽。
[0013]本發(fā)明提供了一種裂解胸腺素β 4的方法。相較于現(xiàn)有技術(shù),本發(fā)明的重點(diǎn)創(chuàng)新之處在于在裂解胸腺素β 4時(shí)在裂解試劑中加入了碘化銨,同時(shí)將各組分的配比調(diào)整到最佳比例,采用此種裂解試劑的好處在于,能夠有效的清除肽鏈上的側(cè)鏈保護(hù)基,能夠有效防止肽鏈的氧化,進(jìn)而提高粗肽純度;同時(shí)大大提高了總收率,降低了生產(chǎn)成本,工藝簡單,便于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0014]為進(jìn)一步說明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn),以下通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)加以證明:
【權(quán)利要求】
1.一種裂解胸腺素β 4的方法,其特征在于,包括對(duì)胸腺素β4肽樹脂進(jìn)行裂解得到粗肽的步驟,其中所述裂解,采用三氟乙酸、茴香硫醚、乙二硫醇、苯酚、水、甲硫醚、碘化銨混合溶液作為裂解試劑;其質(zhì)量配比如下:三氟乙酸:茴香硫醚:乙二硫醇:苯酚:水:甲硫醚:碘化銨=(81 ~85): (2 ~6): (I ~5): (2 ~6): (I ~5): (I ~3):(0.5 ~1.5)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:所述的裂解試劑,其質(zhì)量配比如下:三氟乙酸:茴香硫醚:乙二硫醇:苯酚:水:甲硫醚:碘化銨=83.5:4:3:4:3:2:0.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:所述的裂解試劑,其質(zhì)量配比如下:三氟乙酸:茴香硫醚:乙二硫醇:苯酹:水:甲硫醚:碘化銨=83:4:3:4:3:2:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:所述的裂解試劑,其質(zhì)量配比如下:三氟乙酸:茴香硫醚:乙二硫醇:苯酚:水:甲硫醚:碘化銨=82:4:3:4:3:2:2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:所述方法步驟如下:將裂解試劑和胸腺素β 4肽樹脂混合反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后,過濾,收集濾液,將濾液加入冰乙醚中沉淀,過濾,收集固體,得到胸腺素β 4 粗肽,其中裂解試劑和胸腺素β4肽樹脂的重量比例為93%-99%:1%~7%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:其中裂解試劑和胸腺素β4肽樹脂的重量比例為95%:5%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟如下: 稱量93%-99%重量份的裂解試劑:三氟乙酸,茴香硫醚,乙二硫醇,苯酚,水,甲硫醚,碘化銨的混合溶液至燒杯中,攪拌均勻,稱量1%~7%重量份的胸腺素β4肽樹脂,加入上述燒杯中,反應(yīng)100-150分鐘,反應(yīng)結(jié)束,用砂芯漏斗過濾上述反應(yīng)液,收集濾液,用三氟乙酸洗滌濾餅,合并濾液,將濾液加入冰乙醚中沉淀,用砂芯漏斗過濾,收集濾餅,用冰乙醚洗滌濾餅,濾餅放入真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行真空干燥,得到胸腺素β 4粗肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟如下: 配置裂解液100克,三氟乙酸:茴香硫醚:乙二硫醇:苯酚:水:甲硫醚:碘化銨=83.5:4:3:4:3:2:0.5,將配置好的裂解液攪拌均勻。稱量5克的胸腺素β 4肽樹脂,加入上述裂解液中,反應(yīng)120分鐘,反應(yīng)結(jié)束,用砂芯漏斗過濾上述反應(yīng)液,收集濾液,用三氟乙酸洗滌濾餅,合并濾液。將濾液加入1000ml冰乙醚中沉淀,用砂芯漏斗過濾,收集濾餅,用冰乙醚洗滌濾餅,濾餅放入真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行真空干燥,得到胸腺素β 4粗肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟如下: 配置裂解液100克,三氟乙酸:茴香硫醚:乙二硫醇:苯酚:水:甲硫醚:碘化銨=83:4:3:4:3:2:1,將配置好的裂解液攪拌均勻,稱量5克胸腺素β 4肽樹脂,加入上述裂解液中,反應(yīng)120分鐘,反應(yīng)結(jié)束,用砂芯漏斗過濾上述反應(yīng)液,收集濾液,用三氟乙酸洗滌濾餅,合并濾液,將濾液加入1000ml冰乙醚中沉淀,用砂芯漏斗過濾,收集濾餅,用冰乙醚洗滌濾餅,濾餅放入真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行真空干燥,得到胸腺素β 4粗肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟如下: 配置裂解液100克,三氟乙酸:茴香硫醚:乙二硫醇:苯酚:水:甲硫醚:碘化銨=82:4:3:4:3:2:2,將配置好的裂解液攪拌均勻,稱量5克的胸腺素β 4肽樹脂,加入上述裂解液中,反應(yīng)120分鐘,反應(yīng)結(jié)束,用砂芯漏斗過濾上述反應(yīng)液,收集濾液,用三氟乙酸洗滌濾餅,合并濾液。將濾液加入1000ml冰乙醚中沉淀,用砂芯漏斗過濾,收集濾餅,用冰乙醚洗滌濾餅,濾餅 放入真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行真空干燥,得到胸腺素β 4粗肽。
【文檔編號(hào)】C07K1/04GK103724422SQ201410014225
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】冷國慶, 余榮熹, 王艷, 王浩, 遲帥, 劉宇帥, 田輝, 張琪, 李迎新, 肖明輝, 李喜全, 趙民喜, 蘇宏健 申請(qǐng)人:哈爾濱吉象隆生物技術(shù)有限公司