一種雙水相體系分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙水相體系分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，包括以下步驟：(1)配液：以表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量為40～70％的兒茶素為原料，將其溶解在乙醇的水溶液中，得到深茶紅色溶液；(2)雙水相分離：將磷酸氫二鉀溶解在水中，然后向溶液中加入有機溶劑，形成雙水相體系，將步驟(1)得到的溶液加入該雙水相體系，用5～15％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至6～7，用離心機以轉(zhuǎn)速為1000～2000轉(zhuǎn)／分鐘的轉(zhuǎn)速離心分離2～5分鐘，分離有機相和水相，EGCG在有機相富集，雜質(zhì)在水相富集；(3)濃縮干燥：將有機相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到黃色固體結(jié)晶。采用本發(fā)明獲得的表沒食子兒茶素沒食子酸酯的純度高，雜質(zhì)項檢測容易達到食品安全要求。
【專利說明】一種雙水相體系分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以普通有機溶劑與鹽水形成的雙水相體系分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]雙水相萃取技術(shù)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下可以形成雙水相，由于被分離物在兩相中分配不同，便可實現(xiàn)分離。這一技術(shù)被廣泛用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取。雙水相萃取技術(shù)設(shè)備投資少，操作簡單，該類雙水相體系多為聚乙二醇/葡萄糖和聚乙二醇/無機鹽兩種。由于水溶性高聚物難以揮發(fā)，使反萃取必不可少，且鹽進入反萃取劑中，對隨后的分析測定帶來很大的影響。另外水溶性高聚物大多黏度較大，不易定量操作，也給后續(xù)工藝帶來麻煩。普通的能與水互溶的有機溶劑在無機鹽的存在下也可生成雙水相體系，并已用于血清銅和血漿鉻的形態(tài)分析。與水互溶的有機溶劑和鹽水相的雙水相萃取體系具有價廉、低毒、較易揮發(fā)而無需反萃取和避免使用黏稠水溶性高聚物等特點。
[0003]人們對雙水相體系中不同種類鹽分相能力及不同種類有機溶劑的分相情況進行開展研究。中國科學院化學研究所分子科學中心的王志華、馬會民等人研究了異丙醇、乙醇、丙酮等與水互溶的普通有機溶劑的雙水相體系，并考察了不同種類鹽如(nh4)2so4、Na2CO3' NaNO3> Na3PO4.12H20、Na2SO4' K2HPO4.3H20、NaCl、NaAc 的分相能力差異(應(yīng)用學，2001，18(3):173-175)。
[0004]兒茶素是一種分布廣泛的黃酮化合物，為黃烷醇的衍生物，作為鞣質(zhì)的前體，廣泛分布于于樹根、樹皮、種子和一些植物的樹葉中，特別是在茶葉中占有大量比例(占一片干燥的茶葉的10-20% )。兒茶素廣泛存在于植物茶葉中，包括表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG) 4種物質(zhì)，其中以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量最高，活性作用最顯著，現(xiàn)已被列為一種潛在的抗癌藥物在中美等國被研究。近年來隨著對其組分化學結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及生物活性研究的深入，需要提供大量高純度兒茶素作為制藥原料、標準品或生物合成品的前體物質(zhì)，新的領(lǐng)域?qū)Ξa(chǎn)品總兒茶素含量，特別是表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的含量提出了更高的要求。
[0005]關(guān)于提純制備EGCG的研究，主要還是以葡聚糖凝膠層析、色譜、樹脂分離為主。原理是利用兒茶素各單體之間的性質(zhì)差異，選擇不同的吸脫附劑，使之得到分離。例如專利文獻CN101386614A公開了一種樹脂吸附法制備表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，利用吸附分離高分子材料對各兒茶素單體及色素吸附選擇性的不同，進行柱色譜分離，并結(jié)合膜分離技術(shù)、凝膠色譜分離技術(shù)制備高純度EGCG單體。
[0006]汪健等報道將粗制的茶多酚溶于未飽和的食鹽水中，除去沉渣，然后再加食鹽析出多酚類物質(zhì)，再用乙醚抽提，冷凍干燥后可制得純品(適用技術(shù)薈萃(工業(yè))，1998:15)。嚴明潮、羅明志研究了鹽析對兒茶素提取的影響。鹽析純化兒茶素的工藝流程為:茶多酚粗提液-鹽析-過濾-(濾液)乙酸乙酯萃取回收-濃縮-干燥-成品。該研究發(fā)現(xiàn):在乙酸乙酯萃取前的茶湯中作鹽析處理，可對兒茶素制品的化學組成產(chǎn)生影響。在較低濃度(NaCl<5% )時，適當增加鹽濃度有利于酯溶性兒茶素OBEGCG)及兒茶素總量的提高，但達到一定的鹽濃度后，濃度的增加則不利于兒茶素純度的提高(中國茶葉，1999，(4):29~29)。專利文獻CN1367171A公開了一種高含量EGCG兒茶素的提取方法，經(jīng)過一系列惰性溶劑多步逆流萃取后，調(diào)整溶液的PH值在2.5~7.5之間，進行二價或三價金屬鹽沉淀反應(yīng)，沉淀經(jīng)過濾、熱水洗滌和酸溶后，用乙酸乙酯萃取，萃取的有機溶劑相進行水洗脫酸、減壓濃縮、重結(jié)晶的結(jié)晶物經(jīng)過濾、冷凍雙重水洗滌，最后進行冷凍干燥。兒茶素中EGCg有效含量達90%以上，可直接用于藥物原料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種雙水相體系分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，該方法工藝簡單、不使用有毒有機溶劑，產(chǎn)物純度高。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]一種雙水相體系分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，該方法包括以下步驟:
[0010](I)配液:以表沒食子兒茶素 沒食子酸酯的含量為40~70%的兒茶素為原料，將其溶解在乙醇的水溶液中，得到深茶紅色溶液；
[0011](2)雙水相分離:將磷酸氫二鉀溶解在水中，然后向溶液中加入有機溶劑，形成雙水相體系，將步驟(1)得到的溶液加入該雙水相體系，用5~15%的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至6~7，用離心機以轉(zhuǎn)速為1000~2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心分離2~5分鐘，分離有機相和水相，表沒食子兒茶素沒食子酸酯在有機相富集，雜質(zhì)在水相富集；
[0012](3)濃縮干燥:將有機相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到黃色表沒食子兒茶素沒食子酸酷固體結(jié)晶。
[0013]在步驟(1)中，所述乙醇的水溶液中乙醇的質(zhì)量百分比濃度為10~40%，且所得溶液中兒茶素原料的濃度為2~5g / L。
[0014]在步驟(2)中，有機溶劑與水的體積比為2: 8~8: 2，例如可以為2: 8、3: 7、
4: 6、5: 5、6: 4、7: 3、8: 2等，且每毫升水溶解0.1~0.9g磷酸氫二鉀。所述有機溶劑優(yōu)選為丙酮或異丙醇。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0016]與現(xiàn)有分離方法比較，本發(fā)明采用與水互溶的有機溶劑新型雙水相萃取體系:SP丙酮/鹽水體系或異丙醇/鹽水體系分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯，與水互溶的有機溶劑價廉、無毒、較易揮發(fā)而無需反萃取，與以往采用的聚乙二醇的雙水相體系分離純化過程相比，避免使用粘稠水溶性高聚物，易回收、易處理、環(huán)保、操作簡便。采用本發(fā)明獲得的表沒食子兒茶素沒食子酸酯的純度高，不夾雜以往分離樹脂中的大分子聚合物，雜質(zhì)項檢測容易達到食品安全要求。
【具體實施方式】[0017]以下通過具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。其中所用的丙酮、乙醇、異丙醇、K2HPO4均為試劑級。
[0018]實施例1
[0019]I)配液:選EGCG含量60%的兒茶素為原料，稱取0.05g，用10mL30%的乙醇水溶
液溶解，得深茶紅色的兒茶素藥液。
[0020]2)雙水相分離:采用丙酮/ K2HPO4雙水相體系萃取EGCG，其制備過程為:每毫升水中加入0.25gK2HP04，攪拌，使磷酸鹽充分溶解，然后加入丙酮形成雙水相體系，丙酮與水的體積比為8: 2。加入兒茶素藥液于雙水相體系中，用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使pH值在6~7范圍內(nèi)，用離心機分離，雙水相分配系數(shù)(K=Cwiwa / C7wa)為4.18，EGCG在有機相的收率Y= (C有機相X V有機相)/ 50mgX60% =98.43%。
[0021]3)濃縮干燥:利用分液漏斗把丙酮相分離出來，旋蒸得黃色固體結(jié)晶29.33mg，利用紫外分光光度計測得丙酮相得到的EGCG的純度為89.68%。
[0022]實施例2
[0023]I)配液:選EGCG含量60%的兒茶素為原料，稱取0.5g，用10mL30%的乙醇水溶液
溶解，得深茶紅色的兒茶素藥液。
[0024]2)雙水相分離:采用丙酮/ K2HPO4雙水相體系萃取EGCG，其制備過程為:每毫升水中加入0.5gK2HP04,攪拌，使磷酸鹽充分溶解，然后加入丙酮形成雙水相體系，丙酮與水的體積比為7: 3。加入兒茶素`藥液于雙水相體系中，用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使pH值在6~7范圍內(nèi)，用離心機分離，雙水相分配系數(shù)為2.32，EGCG在有機相的收率Y=95.53%。
[0025]3)濃縮干燥:利用分液漏斗把丙酮相分離出來，旋蒸得黃色固體結(jié)晶23.83mg，EGCG 純度為 80.98%。
[0026]實施例3
[0027]I)配液:選EGCG含量60%的兒茶素為原料，稱取0.5g，用10mL30%的乙醇水溶液
溶解，得深茶紅色的兒茶素藥液。
[0028]2)雙水相分離:采用丙酮/ K2HPO4雙水相體系萃取EGCG，其制備過程為:每毫升水中加入0.75g K2HPO4，攪拌，使磷酸鹽充分溶解，然后加入丙酮形成雙水相體系，丙酮與水的體積比為6: 4。加入兒茶素藥液于雙水相體系中，用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使pH值在6~7范圍內(nèi)，用離心機分離，雙水相分配系數(shù)為2.59，EGCG在有機相的收率Y=91.81%。
[0029]3)濃縮干燥:利用分液漏斗把丙酮相分離出來，旋蒸得黃色固體結(jié)晶21.86mg,EGCG 純度為 81.77%o
[0030]實施例4
[0031]I)配液:選EGCG含量60%的兒茶素為原料，稱取0.5g，用10mL30%的乙醇水溶液
溶解，得深茶紅色的兒茶素藥液。
[0032]2)雙水相分離:采用異丙醇/ K2HPO4體系萃取EGCG，其制備過程為:每毫升水中加入0.75g K2HPO4，攪拌，使磷酸鹽充分溶解，然后加入異丙醇形成雙水相體系，異丙醇與水的體積比為8: 2。加入兒茶素藥液于雙水相體系中，用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使pH值在6~7范圍內(nèi)，用離心機分離，雙水相的分配系數(shù)為1.46，EGCG在有機相的收率Y=88.46%。
[0033]3)濃縮干燥:利用分液漏斗把異丙醇相分離出來，旋蒸得黃色固體結(jié)晶17.99mg,EGCG 純度為 78.34%。
【權(quán)利要求】
1.一種雙水相體系分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)配液:以表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量為40~70%的兒茶素為原料，將其溶解在乙醇的水溶液中，得到深茶紅色溶液； (2)雙水相分離:將磷酸氫二鉀溶解在水中，然后向溶液中加入有機溶劑，形成雙水相體系，將步驟(1)得到的溶液加入該雙水相體系，用5~15%的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至6~7，用離心機以轉(zhuǎn)速為1000~2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心分離2~5分鐘，分離有機相和水相，表沒食子兒茶素沒食子酸酯在有機相富集，雜質(zhì)在水相富集； (3)濃縮干燥:將有機相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到黃色表沒食子兒茶素沒食子酸酯固體結(jié)晶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相體系分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述乙醇的水溶液中乙醇的質(zhì)量百分比濃度為10~40%，且所得溶液中兒茶素原料的濃度為2~5g / L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙水相體系分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特征在于，在步驟(2)中，有機溶劑與水的體積比為2: 8~8: 2，且每毫升水溶解0.1~0.9g磷酸氫二鉀。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙水相體系分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特征在于，有機溶劑與水的體積比為2: 8、3: 7、4: 6、5: 5、6: 4、7: 3或8: 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的雙水相體系分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特征在于，所述有機溶劑為丙酮或異丙醇。
【文檔編號】C07D311/62GK103804336SQ201410054314
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月18日
【發(fā)明者】霍清, 楊曉芳 申請人:北京聯(lián)合大學