一種制備抗Lp（a）多克隆抗血清的引物、質(zhì)粒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開了一種用于制備抗Lp（a）多克隆抗血清的引物、質(zhì)粒及該引物和質(zhì)粒的應(yīng)用。本申請(qǐng)率先采用克隆表達(dá)技術(shù)制備了抗Lp（a）多克隆抗血清，并設(shè)計(jì)了其特異性克隆引物，以及基于該引物的質(zhì)粒。采用本申請(qǐng)的引物或質(zhì)粒制備抗原獲得的抗Lp（a）多克隆抗血清，與傳統(tǒng)的提取純化人血清制備免疫原方法制備的Lp（a）抗血清相比，抗血清效價(jià)高，可達(dá)1:256；特異性強(qiáng)，不會(huì)與LDL或PLG發(fā)生交叉反應(yīng)；同時(shí)，采用本申請(qǐng)的引物或質(zhì)粒制備抗原獲得的抗Lp（a）多克隆抗血清的方法還克服了傳統(tǒng)方法的血漿來源困難、社會(huì)供給不足的問題；提高了Lp(a)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和有效性，為Lp(a)檢測(cè)的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】-種制備抗Lp (a)多克隆抗血清的引物、質(zhì)粒及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及抗血清制備領(lǐng)域，特別是涉及一種用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清的 引物、質(zhì)粒，以及該引物和質(zhì)粒的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 血漿脂蛋白按密度分為四大類：乳糜微粒（縮寫，CM)、極低密度脂蛋白（縮寫， VLDL)、低密度脂蛋白（縮寫，LDL)和高密度脂蛋白（縮寫，HDL)。同時(shí)，在血漿中還存在一 類特殊的脂蛋白：脂蛋白（a)(縮寫，Lp(a))，它是一個(gè)獨(dú)立的脂蛋白系統(tǒng)。Lp(a)的脂質(zhì)成 分與LDL相似，主要由膽固醇脂和甘油三酯組成，表面被覆一層磷脂和游離膽固醇，甘油三 酯的組份大于LDL，Lp(a)與LDL均是膽固醇轉(zhuǎn)移蛋白的底物。Lp(a)含有兩類載脂蛋白： ΑροΒΙΟΟ和Apo (a)，前者與LDL的ΑροΒΙΟΟ相同，ΑροΒΙΟΟ上有LDL受體結(jié)合位點(diǎn)；后者是 Lp (a)的獨(dú)特載脂蛋白，ΑροΒ 100和Apo (a)通過1至2個(gè)二硫鍵共價(jià)相連。
[0003] 從Apo (a)的N-末端到C-末端，所有的Kringle域通過兩兩之間的大約30個(gè)氨 基酸的中間序列依次相連。除最靠近C端的Kringle域與纖溶酶原中的Kringle5同源外， 其余Kringle域均與纖溶酶原中的Kringle4同源，并依次被命名為Kringle IV 1?10型； 需要說明的是，人類Apo (a)與人纖維蛋白溶酶原（英文名，Plasminogen.縮寫，PLG)在DNA 和蛋白質(zhì)水平均存在80%的同源性，從而具有共同的抗原決定簇，呈免疫交叉反應(yīng)。在所有 這10型的Kringle IV中，不同個(gè)體的Kringle IV 2型的串聯(lián)重復(fù)數(shù)一般在3?43之間變 化，因此Apo (a)的分子量也就在250?838kD的范圍中變化，其體積與分子量在相同的個(gè) 體內(nèi)或不同的個(gè)體間都具有較大的差異，因其這種特性，決定了 Lp(a)在不同的個(gè)體間具 有較大的差異。Kringle IV 9型中有7個(gè)半胱氨酸，其中未參與分子內(nèi)二硫鍵的第4057位 半胱氨酸（縮寫，Cys4057)與載脂蛋白B-100中的第4326位半胱氨酸（縮寫，Cys4326)形 成分子間二硫鍵，進(jìn)而組成完整的Lp (a)。
[0004] Lp(a)是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是冠心?。–HD)、心肌梗塞（MI)、腦卒中、 動(dòng)脈重新狹窄的危險(xiǎn)因子。另外，Lp (a)水平可作為慢性腎功能衰竭合并心腦血管病及血栓 形成的預(yù)示指標(biāo)。Lp(a)的血清水平受遺傳因素的高度影響，個(gè)體差異很大，主要由Apo(a) 基因決定，因種族而異，與性別、年齡無關(guān)，不易受環(huán)境，生活方式和一般降脂藥物的干擾， 僅能夠被腎衰、急性免疫反應(yīng)輕微影響。一般把人血清Lp (a)正常值定為<300mg/L。因此， Lp (a)的檢測(cè)對(duì)臨床分析和病理分析具有重要的參考價(jià)值。
[0005] 目前，已知的檢測(cè)Lp (a)濃度的方法有酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、熒光免疫測(cè)定法 和免疫比濁法，以上免疫檢測(cè)方法均需要特異性強(qiáng)的Lp(a)抗血清/抗體作為核心原料。目 前基本上都是采用提純?nèi)搜宓姆椒ㄖ苽涿庖咴璍p (a)或Apo (a)，即利用超高速離心機(jī)通 過密度梯度離心制取Lp (a)，或者利用SDS-PAGE電泳分離獲得Apo (a)抗原；再利用抗原免 疫動(dòng)物獲得抗血清。如前面分析，因?yàn)長p (a)含有兩類載脂蛋白：ΑροΒΙΟΟ和Apo (a)，其中 ΑροΒΙΟΟ與LDL的ΑροΒΙΟΟ相同，所以利用Lp (a)作為免疫原制備的抗血清會(huì)與LDL存在免 疫交叉反應(yīng)。而利用Apo (a)作為免疫原，因 Apo (a)的氨基酸結(jié)構(gòu)與PLG很相似，而PLG是 一種以較高濃度存在于人血液中的蛋白質(zhì)，因此，利用Apo (a)作為免疫原制得的抗血清會(huì) 因與PLG發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，無論是Lp (a)還是Apo (a)作為抗原制備的抗血清都無法準(zhǔn) 確地測(cè)定Lp (a)含量。并且，采用提純?nèi)搜宓姆椒ㄖ苽涿庖咴璍p (a)或Apo (a)所需血漿 來源困難、社會(huì)供給不足；制備的抗血清不僅會(huì)與LDL或PLG有交叉反應(yīng)，特異性較差；而 且，抗血清的效價(jià)也不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本申請(qǐng)的目的是提供一種全新的制備抗Lp (a)多克隆抗血清的引物，基于該引物 的制備抗Lp (a)多克隆抗血清的質(zhì)粒，以及該引物和質(zhì)粒的應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本申請(qǐng)的一方面公開了一種用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清 的引物，該引物包括上游引物和下游引物，上游引物含有Seq ID No. 1所示序列，下游引物含 有所示序列；
[0008] Seq ID No. 1 :5, -GACATATGAGAAAAGCCCTGTGGTCC-3，
[0009] Seq ID No. 2 :5, -GACTCGAGCCCACAATCAAATGAAGA-3,。
[0010] 本申請(qǐng)的另一面還公開了一種用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清的質(zhì)粒，該質(zhì)粒包 括載體和插入序列；插入序列為本申請(qǐng)的引物以LPA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物。 優(yōu)選的，插入序列含有Seq ID No. 3所示序列。
[0011] 優(yōu)選的，載體選自但不僅限于pET系列載體和pGEM-T系列載體中的一種。更優(yōu)選 的，載體為pet28a+。
[0012] 本申請(qǐng)的另一面公開了本申請(qǐng)的引物在制備抗Lp (a)多克隆抗血清中的應(yīng)用。
[0013] 本申請(qǐng)的再一面公開了本申請(qǐng)的質(zhì)粒在制備抗Lp (a)多克隆抗血清中的應(yīng)用。
[0014] 本申請(qǐng)的質(zhì)粒在制備抗Lp (a)多克隆抗血清中的應(yīng)用具體包括，將本申請(qǐng)的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)細(xì)胞或真核表達(dá)細(xì)胞中進(jìn)行融合蛋白表達(dá)，然后提取純化蛋白質(zhì)，獲得抗 原，采用獲得的抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)，獲得本申請(qǐng)的Lp (a)多克隆抗血清。
[0015] 優(yōu)選的，原核表達(dá)細(xì)胞選自但不僅限于大腸桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌和 鏈霉菌中的一種，真核表達(dá)細(xì)胞選自但不僅限于釀酒酵母和畢赤巴斯德酵母中的一種。
[0016] 本申請(qǐng)的實(shí)施方式中抗原含有Seq ID No. 4所示序列，優(yōu)選的，大腸桿菌選自 HB101，BL21，JM109 和 DH5a 中的一種。
[0017] 由于采用以上技術(shù)方案，本申請(qǐng)的有益效果在于：
[0018] 本申請(qǐng)率先采用克隆表達(dá)技術(shù)制備了抗Lp (a)多克隆抗血清，采用本申請(qǐng)的引物 或質(zhì)粒制備抗原獲得的抗Lp (a)多克隆抗血清，與傳統(tǒng)的提取純化人血清制備免疫原方 法制備的Lp (a)抗血清相比，抗血清效價(jià)高，特異性強(qiáng)，不會(huì)與LDL或PLG發(fā)生交叉反應(yīng)； 同時(shí)，采用本申請(qǐng)的引物或質(zhì)粒制備抗原獲得的抗Lp (a)多克隆抗血清的方法還克服了 傳統(tǒng)方法的血漿來源困難、社會(huì)供給不足的問題；提高了 Lp(a)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和有效性，為 Lp (a)檢測(cè)的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中克隆片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，其中Μ為marker，l和2為 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣品；
[0020] 圖2 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中收集的融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖，其中marker為 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)，apo (a)為受檢樣品；
[0021] 圖3 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中收集的融合蛋白的WESTERN-BLOT分析結(jié)果圖，其中 marker為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)，apo (a)為受檢樣品；
[0022] 圖4 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中融合蛋白純化后再次進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)的結(jié)果圖，其中A 為電泳結(jié)果圖，B為基于電泳結(jié)果的數(shù)值分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 本申請(qǐng)的關(guān)鍵在于采用克隆表達(dá)方法獲得高效、準(zhǔn)確的抗原，從而制備出高特異 性的抗血清。需要說明的是，雖然克隆表達(dá)的原理是已知的，并且，克隆表達(dá)制備抗原在多 克隆抗體制備中的應(yīng)用也是蛋白免疫檢測(cè)領(lǐng)域比較常用的；但是，目前并沒有采用克隆表 達(dá)方法制備抗Lp (a)多克隆抗血清的研究，至少，這方面的研究不甚理想；正是如此，本申 請(qǐng)為了填補(bǔ)該漏洞，通過對(duì)Lp (a)蛋白基因進(jìn)行研究，創(chuàng)造性的基于LPA基因設(shè)計(jì)了特異 性引物，通過該特異性引物構(gòu)建可用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清制備的質(zhì)粒，從而制備 出特異性強(qiáng)、效價(jià)高的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0024] 本申請(qǐng)的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)在于所選擇的克隆片段以及特異性的引物序列，可以理解， 對(duì)于本申請(qǐng)的用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清的質(zhì)粒來說，插入片段是其重點(diǎn)，因此，理論 上實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的原核表達(dá)載體，比如PET系列載體、pGEM-T系列載體等都適用于本申 請(qǐng)；本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案中選擇的是pet28a+。
[0025] 另外，在進(jìn)行轉(zhuǎn)化、表達(dá)的過程中，同樣，目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的原核表達(dá)細(xì)胞，如 大腸桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌和鏈霉菌等都適用于本申請(qǐng)，其中，大腸桿菌中常 規(guī)使用的HB101，BL21，JM109和DH5a等也可以用于本申請(qǐng)的融合蛋白表達(dá)。當(dāng)然，原核 表達(dá)細(xì)胞的選擇要和選擇的載體相符。另外，可以理解，除了可以采用原核表達(dá)細(xì)胞體系以 夕卜，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的真核細(xì)胞表達(dá)體系同樣適用于本申請(qǐng)，比如釀酒酵母、畢赤巴斯德酵 母等。
[0026] 下面通過具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅僅對(duì) 本申請(qǐng)進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對(duì)本申請(qǐng)的限制。
[0027] -、材料與方法
[0028] 1、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
[0029] (1)引物設(shè)計(jì)
[0030] 經(jīng)過大量的分析，本申請(qǐng)以人LPA基因?yàn)檠芯繉?duì)象，選取基因序列號(hào)： NM_005577. 2, X06290. 1的序列中第12050-12990位片段，共941bp的片段進(jìn)行克隆表達(dá)，并 設(shè)計(jì)其特異性引物，引物序列如表1所示。所設(shè)計(jì)的引物在生物試劑公司合成。
[0031] 表1用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清的引物
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物 和下游引物，所述上游引物含有Seq ID No. 1所示序列，所述下游引物含有所示序列； Seq ID No. 1 :5' -GACATATGAGAAAAGCCCTGTGGTCC-3' Seq ID No. 2 :5, -GACTCGAGCCCACAATCAAATGAAGA-3,。
2. -種用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清的質(zhì)粒，其特征在于：所述質(zhì)粒包括載體和插 入序列；所述插入序列為權(quán)利要求1所述引物以LPA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒，其特征在于：所述插入序列含有Seq ID No. 3所示序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒，其特征在于：所述載體選自但不僅限于pET系列載體 和pGEM-T系列載體中的一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒，其特征在于：所述載體為pet28a+。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物在制備抗Lp (a)多克隆抗血清中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的質(zhì)粒在制備抗Lp (a)多克隆抗血清中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：包括將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)細(xì)胞或 真核表達(dá)細(xì)胞中進(jìn)行融合蛋白表達(dá)，然后提取純化蛋白質(zhì)，獲得抗原，采用所述抗原進(jìn)行動(dòng) 物免疫試驗(yàn)，獲得所述Lp (a)多克隆抗血清。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述原核表達(dá)細(xì)胞選自但不僅限于大腸 桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌和鏈霉菌中的一種；所述真核表達(dá)細(xì)胞選自但不僅限于 釀酒酵母和畢赤巴斯德酵母中的一種。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述大腸桿菌選自HB101，BL21，JM109 和DH5 α中的一種；所述抗原含有Seq ID No. 4所不序列。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK104059908SQ201410085897
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】謝桂華, 柴寶玲 申請(qǐng)人:深圳市寶凱侖科技有限公司