片段縮合制備特利加壓素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種特利加壓素的片段縮合方法，固相制備特利加壓素的全保護(hù)第一肽片段序列樹脂，環(huán)化形成二硫鍵，然后將環(huán)化的全保護(hù)第一肽片段序列從樹脂上裂解下來；液相中環(huán)化的全保護(hù)第一肽片段序列與H-Gly-NH2縮合得到環(huán)化的全保護(hù)第二肽片段序列；液相或者固相制備特利加壓素的第三肽片段序列；環(huán)化的全保護(hù)第二肽片段序列脫氨基端保護(hù)后與第三肽片段序列縮合，然后脫去所有保護(hù)基得到特利加壓素粗品，純化轉(zhuǎn)鹽得到產(chǎn)品醋酸特利加壓素；第一肽片段序列為特利加壓素序列中的第4-11位氨基酸，第二肽片段序列為特利加壓素序列中的第4-12位氨基酸，第三肽片段序列為特利加壓素序列中的第1-3位氨基酸。
【專利說明】片段縮合制備特利加壓素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體地說，涉及一種醋酸特利加壓素的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 特利加壓素的化學(xué)名稱為三甘氨酰賴氨酸加壓素，結(jié)構(gòu)式如下：
[0003] H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-GIy-NH?
[0004] 它是一種新型的人工合成的長效血管加壓素制劑，主要用于胃腸道和泌尿生殖 系統(tǒng)的出血，如食道靜脈曲張、胃和十二指腸潰瘍、功能性及其它原因引起的子宮出血、生 產(chǎn)和/或流產(chǎn)等等引起的出血的治療，與血管加壓素相比，它作用持久，不引起危險性并發(fā) 癥。
[0005] 目前特利加壓素的制備方法主要以固相縮合為主。例如專利CN1865282B和 CN101693738A 和 201310214366. 4,均以 Rink Amide 或者 Sieber 樹脂為起始原料，以 Fmoc 保護(hù)的氨基酸為單體，以HBTU/H0Bt/DIEA、DIC/H0Bt或PyBOP/HOBt/DIEA為縮合劑，依次逐 個接上氨基酸，裂解獲得還原型粗品，氧化獲得特利加壓素粗品，最后HPLC進(jìn)行分離純化， 獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0006] 以上方法有如下一些問題：a)固相合成隨著肽鏈的增長，偶聯(lián)越來越困難，尤其 是最后幾個氨基酸的縮合；最近另一申請專利《一種特利加壓素及其雜質(zhì)的超高效液相色 譜檢測方法》（專利申請?zhí)?：201310673625.X)指出逐個固相合成會出現(xiàn)多個氨基末端的缺 陷肽。b)使用Rink Amide或者Sieber樹脂羧基端氨基酸取代值不能太高，合成不經(jīng)濟(jì)； 并且兩種樹脂相對于2-氯-三苯甲基氯樹脂價格不菲，尤其后者。c)液相氧化二硫鍵反應(yīng) 時間較長，產(chǎn)生較多廢液。所以本領(lǐng)域技術(shù)人員仍然期待以高產(chǎn)品收率獲得具有良好品質(zhì) 的廣品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有制備方法收率低，而且產(chǎn)品純化困難，不 易得到高純度的特利加壓素的缺點，提供一種片段縮合制備特利加壓素的方法，提高了產(chǎn) 率和純度；由于采用2-氯-三苯甲基氯樹脂和固相環(huán)化使得成本降低，利于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009]方案一：
[0010] 一種特利加壓素的片段縮合方法，固相制備特利加壓素的全保護(hù)第一肽片段序列 樹脂，在固相中使用I2氧化兩個半胱氨酸形成二硫鍵，然后將環(huán)化的全保護(hù)第一肽片段序 列從樹脂上裂解下來；液相中環(huán)化的全保護(hù)第一肽片段序列與H-Gly-NH2縮合得到環(huán)化的 全保護(hù)第二肽片段序列；液相或者固相制備特利加壓素的第三肽片段序列；環(huán)化的全保護(hù) 第二肽片段序列脫氨基端保護(hù)后與第三肽片段序列縮合，然后脫去側(cè)鏈保護(hù)得到特利加壓 素粗品，經(jīng)純化轉(zhuǎn)鹽得到產(chǎn)品醋酸特利加壓素；
[0011] 第一肽片段序列為特利加壓素序列中的第4-11位氨基酸，
[0012] 第二肽片段序列為特利加壓素序列中的第4-12位氨基酸，
[0013] 第三肽片段序列為特利加壓素序列中的第1-3位氨基酸。
[0014] 上述特利加壓素的片段縮合方法具體包括如下步驟：
[0015] a.固相制備特利加壓素的全保護(hù)第一肽片段序列樹脂；
[0016] 所述的全保護(hù)第一肽片段序列為：
[0017] Fmoc-Cys(Rl)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Rl)-Pro-Lys(Boc)-0H,
[0018] 其中，Rl 為 Trt 或者 Acm ;
[0019] I2氧化全保護(hù)第一肽片段序列樹脂，使得第4和第9位的半胱氨酸形成二硫鍵， 得到環(huán)化的全保護(hù)第一肽片段序列樹脂；將環(huán)化的全保護(hù)第一肽片段序列從固相樹脂上裂 解；
[0020] b.將步驟a得到的脫除了固相樹脂的環(huán)化的全保護(hù)第一肽片段序列與H-Gly-NH2 縮合得到環(huán)化的全保護(hù)第二肽片段序列；
[0021] c.液相或者固相合成特利加壓素的第三肽片段序列；
[0022] 所述的第三肽片段序列為：R2-Gly-Gly-Gly_0H，其中R2為Boc或者Fmoc ;
[0023] d.脫除步驟b得到的環(huán)化的全保護(hù)第二肽片段序列的氨基端保護(hù)基，然后與步驟 c得到的第三肽片段序列縮合得到全保護(hù)特利加壓素；
[0024] e.將全保護(hù)特利加壓素裂解脫去所有保護(hù)基得到特利加壓素粗品；
[0025] f.特利加壓素粗品經(jīng)純化轉(zhuǎn)鹽得到醋酸特利加壓素。
[0026] 步驟a中，全保護(hù)第一肽片段序列樹脂是由氨基酸依次偶聯(lián)在固相樹脂上獲得 的，其中，所用的固相載體為酸敏感樹脂，優(yōu)選為2-氯-三苯甲基氯樹脂；
[0027] 固相制備特利加壓素的全保護(hù)第一肽片段序列樹脂的過程中，所使用的氨基脫保 護(hù)試劑為20 %哌啶的DMF溶液（V/V)、或者1 % DBU的DMF溶液（V/V);優(yōu)選20 %哌啶的DMF 溶液（V/V);
[0028] 所用的偶聯(lián)劑為HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合、或者DIC與HOBt按 摩爾比1:1的組合、或者PyBOP與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合。優(yōu)選HBTU與HOBt 與DIEA按摩爾比1:1:2的組合；待偶聯(lián)的氨基酸與HOBt的摩爾比是1:1。
[0029] 使用的二硫鍵氧化劑為I2，二硫鍵與I2摩爾比為1:5?10,溶劑為DMF或者DCM。 優(yōu)選二硫鍵與I 2摩爾比為1:6。反應(yīng)時間優(yōu)選為2小時。
[0030] 使用的裂解劑為體積百分含量為0. 5?1 %的TFA的DCM溶液、體積百分含量為 20 %的TFE的DCM溶液、或者TFE與AcOH與DCM按照體積比1:2:7的混合物。優(yōu)選體積百 分含量為〇. 5?1 % TFA的DCM溶液。
[0031] 步驟b中，縮合反應(yīng)使用的縮合劑為HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組 合、或者HBTU與HOAt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合、或者EDC與HOBt按摩爾比1:1的組 合、或者PyBOP與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合，優(yōu)選HBTU與HOBt與DIEA按摩爾 比1:1:2的組合；縮合反應(yīng)的溶劑為DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一種或幾種的組合，優(yōu) 選 DMF。
[0032] 步驟c中，
[0033] 液相合成 Boc-Gly-Gly-Gly-OH 的方法是，首先 Boc-Gly-OH 與 H-Gly-OMe 反應(yīng)得 到 Boc-Gly-Gly-OMe，脫去 Boc 保護(hù)后與 Boc-Gly-OH 反應(yīng)得到 Boc-Gly-Gly-Gly-OMe，皂化 得到 Boc-Gly-Gly-Gly-OH ;
[0034] 液相合成 Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH 的方法是，首先 Fmoc-Gly-OH 與 H-Gly-OtBu 反應(yīng)得到Fmoc-Gly-Gly-OtBu,脫去Fmoc保護(hù)后與Fmoc-Gly-OH反應(yīng)得到 Fmoc-Gly-Gly-Gly-OtBu,然后 TFA:DCM 按體積比 1:1 反應(yīng)，得到 Fmoc-Gly-Gly-Gly-〇H。
[0035] 固相合成R2-Gly-Gly-Gly-0H的方法是，F(xiàn)moc-Gly-OH與2-氯-三苯甲基氯樹脂 反應(yīng)得到肽樹脂，脫去Fmoc保護(hù)后與Fmoc-Gly-OH反應(yīng)得到二肽樹脂，再脫去Fmoc保護(hù)后 與R2-Gly-0H反應(yīng)得到三肽樹脂；用裂解劑將R2-Gly-Gly-Gly-0H從固相樹脂上裂解，得到 R2-Gly-Gly-Gly-0H，其中，所述的裂解劑為體積百分含量為0. 5?1%的TFA的DCM溶液、 體積百分含量為20 %的TFE的DCM溶液、或者TFE與AcOH與DCM按照體積比1:2:7的混合 物。
[0036] 步驟d中，氨基脫保護(hù)為16 %的哌啶的DMF溶液，或者體積百分含量為1 %的DBU 的DMF溶液；縮合反應(yīng)使用的縮合劑為HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合、或者 HBTU與HOAt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合、或者EDC與HOBt按摩爾比1:1的組合、或者 PyBOP與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合，優(yōu)選HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2 的組合；縮合反應(yīng)的溶劑為DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一種或幾種的組合，優(yōu)選DMF。
[0037] 步驟e中，全保護(hù)特利加壓素裂解使用的裂解液為TFA與H2O按體積比95:5的混 合溶液、或者TFA與EDT與TIS與PhoH與H 2O按體積比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA 與EDT與TIS與H2O按體積比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。優(yōu)選TFA與EDT與TIS與 H2O按體積比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。
[0038] 步驟f中，純化為反相高效液相色譜純化換鹽，即色譜柱為C18柱；流動相為醋酸 水溶液和乙腈水溶液。
[0039] 方案二：
[0040] 一種特利加壓素的片段縮合方法，固相制備特利加壓素的全保護(hù)第四肽片段序列 樹脂，在固相中使用I2氧化兩個半胱氨酸形成二硫鍵，然后將環(huán)化的全保護(hù)第四肽片段序 列從樹脂上裂解下來；液相中環(huán)化的全保護(hù)第四肽片段序列與H-Gly-NH2縮合，然后脫去側(cè) 鏈保護(hù)得到特利加壓素粗品，經(jīng)純化轉(zhuǎn)鹽得到產(chǎn)品醋酸特利加壓素；
[0041] 第四肽片段序列為特利加壓素序列中的第1-11位氨基酸。
[0042] 上述特利加壓素的片段縮合方法具體包括如下步驟：
[0043] a.固相制備特利加壓素的全保護(hù)第四肽片段序列樹脂，
[0044] 所述的第四肽片段序列為：
[0045] R2-Gly-Gly-Gly-Cys(Rl)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Rl)-Pro-Lys (Boc) -0H，其中 Rl 為 Trt 或者為 Acm，R2 為 Boc 或者 Fmoc ;
[0046] I2氧化全保護(hù)第四肽片段序列樹脂，使得第4和第9位的半胱氨酸形成二硫鍵， 得到環(huán)化的全保護(hù)第四肽片段序列樹脂；將環(huán)化的全保護(hù)第四肽片段序列從固相樹脂上裂 解；
[0047] b.將步驟a得到的脫除了固相樹脂的環(huán)化的全保護(hù)第四肽片段序列與H-Gly-NH2 縮合得到全保護(hù)特利加壓素；
[0048] c.將全保護(hù)特利加壓素裂解脫去所有保護(hù)基得到特利加壓素粗品；
[0049] d.特利加壓素粗品經(jīng)純化轉(zhuǎn)鹽得到醋酸特利加壓素。
[0050] 步驟a中，全保護(hù)第四肽片段序列樹脂是由氨基酸依次偶聯(lián)在固相樹脂上獲得 的，其中，所用的固相載體為酸敏感樹脂，優(yōu)選為2-氯-三苯甲基氯樹脂；
[0051] 固相制備特利加壓素的全保護(hù)第四肽片段序列樹脂的過程中，所使用的氨基脫保 護(hù)試劑為20 %哌啶的DMF溶液（V/V)、或者1 % DBU的DMF溶液（V/V);優(yōu)選20 %哌啶的DMF 溶液（V/V);
[0052] 所用的偶聯(lián)劑為HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合、或者DIC與HOBt按 摩爾比1:1的組合、或者PyBOP與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合。優(yōu)選HBTU與HOBt 與DIEA按摩爾比1:1:2的組合；待偶聯(lián)的氨基酸與HOBt的摩爾比是1:1。
[0053] 使用的二硫鍵氧化劑為I2，二硫鍵與I2摩爾比為1:5?10,溶劑為DMF或者DCM。 優(yōu)選二硫鍵與I 2摩爾比為1:6。反應(yīng)時間優(yōu)選為2小時。
[0054] 使用的裂解劑為體積百分含量為0. 5?1 %的TFA的DCM溶液、體積百分含量為 20 %的TFE的DCM溶液、或者TFE與AcOH與DCM按照體積比1:2:7的混合物。優(yōu)選體積百 分含量為〇. 5?1 %的TFA的DCM溶液。
[0055] 步驟b中，縮合反應(yīng)使用的縮合劑為HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組 合、或者HBTU與HOAt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合、或者EDC與HOBt按摩爾比1:1的組 合、或者PyBOP與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合，優(yōu)選HBTU與HOBt與DIEA按摩爾 比1:1:2的組合；縮合反應(yīng)的溶劑為DMF、DCM、NMP和DMSO中的任意一種或幾種的組合，優(yōu) 選DMF
[0056] 步驟c中，全保護(hù)特利加壓素裂解使用的裂解液為TFA與H2O按體積比95:5的混 合溶液、或者TFA與EDT與TIS與PhOH與H 2O按體積比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA 與EDT與TIS與H2O按體積比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。優(yōu)選TFA與EDT與TIS與 H2O按體積比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。
[0057] 步驟d中，純化為反相高效液相色譜純化換鹽，即色譜柱為C18柱；流動相為醋酸 水溶液和乙腈水溶液。
[0058] 有益效果：本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：
[0059] 1、本發(fā)明利用高荷載量（>0. 8mmol/g樹脂）的樹脂為起始原料，先采用標(biāo)準(zhǔn)的固 相肽合成（SPPS)技術(shù)合成選定結(jié)構(gòu)的高純度肽片段，再采用液相縮合技術(shù)使肽片段縮合， 從而獲得商純度（〉99 % )、商收率（MO % )的目標(biāo)膚；
[0060] 2、相比較固相合成特利加壓素的工藝，本發(fā)明：
[0061] a. 2-氯-三苯甲基氯樹脂重復(fù)使用方法簡便，相比Rink Amide樹脂價格低廉；每 個片段可使用高荷載量（>〇.8mmol/g樹脂）的固相載體，相比較Rink Amide樹脂荷載量限 制（0. 25-0. 4mmol/g樹脂），物料通量增加；
[0062] b.氨基酸及試劑投量為1. 5-2倍量，遠(yuǎn)低于固相肽合成常規(guī)的3-4倍甚至5倍過 量，節(jié)約物料成本；
[0063] c.固相環(huán)化利用固相載體假稀釋作用，使得環(huán)化產(chǎn)率提高，減少反應(yīng)時間。
[0064] 3、采用超酸敏感型樹脂合成的10個或10個左右氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)肽片段序列純 度非常高，不必用色譜技術(shù)純化，只需要進(jìn)行沉淀、研磨即可使用；片段液相偶合，其雜質(zhì)主 要為未偶合的片段，而不是缺少一個或數(shù)個氨基酸的缺陷肽，在最終高效液相色譜純化中 容易得多，從而減少制備次數(shù)，降低了特利加壓素的制備成本，有利于實現(xiàn)規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化 生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0065] 圖1為本發(fā)明制備的特利加壓素粗肽分析色譜圖；
[0066] 圖2為本發(fā)明制備的特利加壓素純肽分析色譜圖；
[0067] 圖3為本發(fā)明制備的特利加壓素純肽質(zhì)譜圖。

【具體實施方式】
[0068] 根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0069] 本發(fā)明中，合成特利加壓素所涉及的目的肽及中間體的各個肽片段的氨基酸序列 見表1。本發(fā)明中肽片段組合方式見表2。本發(fā)明所涉及氨基酸的縮寫見表3。本發(fā)明中所 使用的物料縮寫的含義見表4。
[0070] 表1特利加壓素相應(yīng)的編碼氨基酸序列
[0071]

【權(quán)利要求】
1. 一種特利加壓素的片段縮合方法，其特征在于，固相制備特利加壓素的全保護(hù)第一 肽片段序列樹脂，在固相中使用12氧化兩個半胱氨酸形成二硫鍵，然后將環(huán)化的全保護(hù)第 一肽片段序列從樹脂上裂解下來；液相中環(huán)化的全保護(hù)第一肽片段序列與H-Gly-NH2縮合 得到環(huán)化的全保護(hù)第二肽片段序列；液相或者固相制備特利加壓素的第三肽片段序列；環(huán) 化的全保護(hù)第二肽片段序列脫氨基端保護(hù)后與第三肽片段序列縮合，然后脫去所有保護(hù)基 得到特利加壓素粗品，純化轉(zhuǎn)鹽得到產(chǎn)品醋酸特利加壓素； 第一肽片段序列為特利加壓素序列中的第4-11位氨基酸， 第二肽片段序列為特利加壓素序列中的第4-12位氨基酸， 第三肽片段序列為特利加壓素序列中的第1-3位氨基酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，它包括如下步驟： a. 固相制備特利加壓素的全保護(hù)第一肽片段序列樹脂； 所述的全保護(hù)第一肽片段序列為： Fmoc-Cys(Rl)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Rl)-Pr〇-Lys(Boc)-OH, 其中，R1為Trt或者Acm; 使用I2氧化全保護(hù)第一肽片段序列樹脂，使得第4和第9位的半胱氨酸形成二硫鍵， 得到環(huán)化的全保護(hù)第一肽片段序列樹脂；將環(huán)化的全保護(hù)第一肽片段序列從固相樹脂上裂 解； b. 將步驟a得到的環(huán)化的全保護(hù)第一肽片段序列與H-Gly_NH2縮合得到環(huán)化的全保護(hù) 第二肽片段序列； c. 液相或者固相合成特利加壓素的第三肽片段序列， 所述的第三肽片段序列為：R2-Gly-Gly-Gly-0H，其中R2為Boc或者Fmoc ; d. 脫除步驟b得到的環(huán)化的全保護(hù)第二肽片段序列的氨基端保護(hù)基，然后與步驟c得 到的第三肽片段序列縮合得到全保護(hù)特利加壓素； e. 將全保護(hù)特利加壓素裂解脫去所有保護(hù)基得到特利加壓素粗品； f. 特利加壓素粗品經(jīng)純化轉(zhuǎn)鹽得到醋酸特利加壓素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟a中，全保護(hù)第一肽片段序列樹脂 是由氨基酸依次偶聯(lián)在固相樹脂上獲得的，其中，所述的固相樹脂為2-氯-三苯甲基氯樹 脂； 固相制備特利加壓素全保護(hù)第一肽片段序列樹脂的過程中，所使用的氨基脫保護(hù)試劑 為體積百分含量為20%的哌啶的DMF溶液、或者體積百分含量為1 %的DBU的DMF溶液。 所用的偶聯(lián)劑為HBTU與HOBt與DIEA的組合、或者DIC與HOBt的組合、或者PyBOP與 HOBt與DIEA的組合。 使用的二硫鍵氧化劑為12，二硫鍵與12摩爾比為1:5?10,溶劑為DMF或者DCM。 使用的裂解劑為體積百分含量為〇. 5?1%的TFA的DCM溶液、體積百分含量為20% 的TFE的DCM溶液、或者TFE與AcOH與DCM按照體積比1:2:7的混合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟b中，縮合反應(yīng)使用的縮合劑為HBTU 與HOBt與DIEA的組合、或者HBTU與HOAt與DIEA的組合、或者EDC與HOBt的組合、或者 PyBOP與HOBt與DIEA的組合；縮合反應(yīng)的溶劑為DMF、DCM、NMP和DMS0中的任意一種或幾 種的組合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟c中， 液相合成Boc-Gly-Gly-Gly-OH的方法是，首先Boc-Gly-OH與H-Gly-OMe反應(yīng)得到 Boc-Gly-Gly-OMe，脫去 Boc 保護(hù)后與 Boc-Gly-OH 反應(yīng)得到 Boc-Gly-Gly-Gly-OMe，皂化得 到 Boc-Gly-Gly-Gly-OH ; 液相合成Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH的方法是，首先Fmoc-Gly-OH與H-Gly-〇tBu反應(yīng)得到 Fmoc-Gly-Gly-〇tBu，脫去 Fmoc 保護(hù)后與 Fmoc-Gly-〇H 反應(yīng)得到 Fmoc-Gly-Gly-Gly-〇tBu， 然后 TFA:DCM 按體積比 1:1 反應(yīng)，得到 Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH。 固相合成R2-Gly-Gly-Gly-0H的方法是，F(xiàn)moc-Gly-OH與2-氯-三苯甲基氯樹脂反應(yīng) 得到肽樹脂，脫去Fmoc保護(hù)后與Fmoc-Gly-OH反應(yīng)得到二肽樹脂，再脫去Fmoc保護(hù)后與 R2-Gly-0H反應(yīng)得到三肽樹脂；用裂解劑將R2-Gly-Gly-Gly-0H從固相樹脂上裂解，得到 R2-Gly-Gly-Gly-0H，其中，所述的裂解劑為體積百分含量為0. 5?1%的TFA的DCM溶液、 體積百分含量為20 %的TFE的DCM溶液、或者TFE與AcOH與DCM按照體積比1:2:7的混合 物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟d中，氨基脫保護(hù)為體積百分含量 16 %的哌啶的DMF溶液，或者體積百分含量為1 %的DBU的DMF溶液；縮合反應(yīng)使用的縮合 劑為HBTU與HOBt與DIEA的組合、或者HBTU與HOAt與DIEA的組合、或者EDC與HOBt的組 合、或者PyBOP與HOBt與DIEA的組合；縮合反應(yīng)使用的反應(yīng)溶劑為DMF、DCM、NMP和DMS0 中的任意一種或幾種的組合。
7. -種特利加壓素的片段縮合方法，其特征在于，固相制備特利加壓素的全保護(hù)第四 肽片段序列樹脂，在固相中使用12氧化兩個半胱氨酸形成二硫鍵，然后將環(huán)化的全保護(hù)第 四肽片段序列從樹脂上裂解下來；液相中環(huán)化的全保護(hù)第四肽片段序列與H-Gly-NH2縮合， 然后脫去所有保護(hù)基得到特利加壓素粗品，經(jīng)純化轉(zhuǎn)鹽得到產(chǎn)品醋酸特利加壓素； 第四肽片段序列為特利加壓素序列中的第1-11位氨基酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，它包括如下步驟： a. 固相制備特利加壓素的全保護(hù)第四肽片段序列樹脂， 所述的第四肽片段序列為： R2-Gly-Gly-Gly-Cys(Rl)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn (Trt)-Cys(Rl)-Pr〇-Lys(Boc )-0H，其中R1為Trt或者為Acm，R2為Boc或者Fmoc ; 使用I2氧化全保護(hù)第四肽片段序列樹脂，使得第4和第9位的半胱氨酸形成二硫鍵， 得到環(huán)化的全保護(hù)第四肽片段序列樹脂；將環(huán)化的全保護(hù)第四肽片段序列從固相樹脂上裂 解； b. 將步驟a得到的脫除了固相樹脂的環(huán)化的全保護(hù)第四肽片段序列與H-Gly_NH2縮合 得到全保護(hù)的特利加壓素； c. 將全保護(hù)的特利加壓素裂解脫去全部保護(hù)基得到特利加壓素粗品； d. 特利加壓素粗品經(jīng)純化轉(zhuǎn)鹽得到醋酸特利加壓素。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟a中，全保護(hù)第四肽片段序列樹脂 是由氨基酸依次偶聯(lián)在固相樹脂上獲得的，其中，所述的固相樹脂為2-氯-三苯甲基氯樹 脂； 固相制備特利加壓素的全保護(hù)第四肽片段序列樹脂的過程中，所使用的氨基脫保護(hù)試 劑為體積百分含量為20%的哌啶的DMF溶液、或者體積百分含量為1 %的DBU的DMF溶液。 所用的偶聯(lián)劑為HBTU與HOBt與DIEA的組合、或者DIC與HOBt的組合、或者PyBOP與 HOBt與DIEA的組合。 使用的二硫鍵氧化劑為12，二硫鍵與12摩爾比為1:5?10,溶劑為DMF或者DCM。 使用的裂解劑為體積百分含量為〇. 5?1%的TFA的DCM溶液、體積百分含量為20% 的TFE的DCM溶液、或者TFE與AcOH與DCM按照體積比1:2:7的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟b中，縮合反應(yīng)使用的縮合劑為 HBTU與HOBt與DIEA的組合、或者HBTU與HOAt與DIEA的組合、或者EDC與HOBt的組合、 或者PyBOP與HOBt與DIEA的組合；縮合反應(yīng)的溶劑為DMF、DCM、NMP和DMS0中的任意一 種或幾種的組合。
【文檔編號】C07K7/16GK104371008SQ201410554759
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】常民, 王銳, 彭雅麗, 薛宏祥 申請人:蘭州大學(xué)