專利名稱：生長因子神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白及其類似物的新應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及影響心肌收縮單位組合的多肽類的應(yīng)用，尤其是生長因子神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白及其類似物在改進(jìn)心臟患者心肌功能中的應(yīng)用。
心力衰竭影響1.5％的人口，美國約有300萬人患有心臟病，并以每年40萬人的速度在增加。目前對心力衰竭的治療主要是用血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑與利尿藥。ACE抑制劑對晚期心力衰竭顯示緩慢的改進(jìn)，僅有少于60％病人的癥狀得到減輕，死亡率僅降低15-20％。心臟移植由于缺乏供體心臟而受到限制。除了異羥基毛地黃毒苷外，其他有效藥物的長期應(yīng)用都會(huì)產(chǎn)生副作用，包括心律不齊與猝死。
在心臟發(fā)育期間，心肌細(xì)胞的生長從增殖轉(zhuǎn)為肥大。前者為增加心肌細(xì)胞的數(shù)量，后者則增大細(xì)胞，不合成DNA，細(xì)胞也不再分裂。這種轉(zhuǎn)換在心臟發(fā)育期間伴隨著心肌細(xì)胞的終極分化。轉(zhuǎn)換開始于胚胎晚期，終止于出生幾星期后。在這期間，基因的表達(dá)，特別涉及到細(xì)胞周期及信號被重新編制，細(xì)胞的表型也被改變成為細(xì)胞-細(xì)胞粘合，終極分化的心肌細(xì)胞中的收縮蛋白也被更有序地組合。
當(dāng)各種病理的刺激導(dǎo)致心肌受損后，或在心肌工作需求增加時(shí)，成人的心臟肥大是一種適應(yīng)性的生理反應(yīng)。正常的肥大細(xì)胞形體大，具有增加的并組合完好的收縮單位與強(qiáng)的細(xì)胞間粘合，而病態(tài)的肥大細(xì)胞中收縮蛋白組合無序，細(xì)胞間的粘合不好。
肌纖維與肌原纖維的排列錯(cuò)誤是心肌病的重要特征。前者是細(xì)胞間結(jié)合的混亂，后者是心肌內(nèi)收縮蛋白的無序組合。它們受特殊細(xì)胞信號的影響。這樣，一些如生長因子和激素的信號將改變細(xì)胞間粘合與肌原纖維節(jié)的結(jié)構(gòu)。沒有這些信號刺激，顯示出細(xì)胞骨架和肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤排列及細(xì)胞間相互作用的分離。因?yàn)樾募〖?xì)胞的分化與心臟細(xì)胞的重新構(gòu)建，粘合和收縮蛋白的組合緊密相關(guān)，這些刺激心肌細(xì)胞分化的因子可能對增強(qiáng)成熟的心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的裝配起決定性的作用。
心肌細(xì)胞離體模型系統(tǒng)的研究證實(shí)，一些物理、激素、生長因子和病理上的刺激能激發(fā)一些心肌肥大的獨(dú)立的表型特征(Chien等(1991)FASEBJ.53037-3046；Zhou等，(1995)PNAS，USA，927391-7395)。目前，在這些離體模型中，至少存在三種信號傳遞途徑，涉及到ras-，rho，和Gq蛋白依賴型的下游效應(yīng)物。
當(dāng)對激發(fā)心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的信號途徑的研究取得重大進(jìn)展時(shí)，相對關(guān)于特別刺激心肌細(xì)胞的終極分化和與之相聯(lián)的收縮蛋白的裝配機(jī)制卻知道得很少。能夠影響這些過程的化合物可能成為用于處理各種心臟疾病的一類主要的新治療劑。
神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulin)是一種表皮生長因子(EGF)類的生長因子。它能激活EGF受體族中erbB受體，并涉及到其他的一些生物反應(yīng)如刺激乳房癌細(xì)胞分化和乳蛋白的分泌；誘導(dǎo)神經(jīng)脊細(xì)胞分化為Schwann細(xì)胞；刺激骨胳肌細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿受體的合成；以及促進(jìn)心肌細(xì)胞成活和DNA合成。用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因嚴(yán)重缺陷的小鼠胚胎做的活體研究證明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對于心臟和神經(jīng)發(fā)育是必需的。然而，關(guān)于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白如何控制細(xì)胞分化和其下游信號途徑的信息是有限的。
在早期發(fā)育的心臟中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白和ErbB受體各自在心內(nèi)膜襯里和心臟肌肉內(nèi)表達(dá)。因?yàn)檫@二層分開很寬，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白必須穿過二層細(xì)胞中的空間，再激活ErbB受體。激活這些心肌細(xì)胞中的受體對于促進(jìn)肌肉細(xì)胞生長或遷移到心內(nèi)膜，從而在二層細(xì)胞中形成手指型結(jié)構(gòu)是必須的。以前尚不清楚是否神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激了心肌細(xì)胞的分化。
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白增強(qiáng)心肌細(xì)胞的分化，肌原纖維節(jié)和細(xì)胞骨架的組合與細(xì)胞間的粘合。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白多肽，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白衍生物，或那些有類似神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白作用的化合物，在本發(fā)明中縮寫為NRG。發(fā)明者現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白與它的細(xì)胞作用可能適用于探測，診斷與處理心臟疾病。
因此，本發(fā)明的目的是提供神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在體外促進(jìn)心肌細(xì)胞分化中的新應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維節(jié)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重建或細(xì)胞間粘合中的新的應(yīng)用。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在識別能抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激心肌細(xì)胞分化的多肽或化合物中的新的應(yīng)用。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在制備治療心臟病和心力衰竭藥物中的新的應(yīng)用。
本發(fā)明包括一種在體外促使心肌細(xì)胞分化的方法。該方法包括用有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白處理心肌細(xì)胞，從而激活MAP激酶途徑并引起心肌細(xì)胞分化。
本發(fā)明還包括一種在體外誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維節(jié)與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重建或細(xì)胞間粘合的方法。該方法包括用有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白處理細(xì)胞，從而激活MAP激酶途徑，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重新構(gòu)建或細(xì)胞間粘合。
神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可以直接提供給細(xì)胞，也可間接地由誘導(dǎo)那些涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白合成的基因表達(dá)來產(chǎn)生。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白可通過自身細(xì)胞或由其他細(xì)胞中基因表達(dá)來產(chǎn)生。
本發(fā)明包含識別能刺激心肌細(xì)胞分化的多肽或化合物的方法。此方法包括在心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)物神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白存在時(shí)，用其他多肽或化合物接觸心肌，并測定心肌細(xì)胞分化的發(fā)展。將心肌細(xì)胞分別暴露在神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，其他多肽，或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白與某種多肽的混合物下，測定細(xì)胞的分化。細(xì)胞的分化測定包括DNA合成的增減、心肌細(xì)胞內(nèi)MAP激酶在不同時(shí)間的磷酸化分析、細(xì)胞周期的抑制物-p21CIP1的表達(dá)數(shù)值、收縮單位的表型組合、收縮單位的堆積、細(xì)胞骨架中肌動(dòng)蛋白纖維的表型轉(zhuǎn)變、以及細(xì)胞間粘合的表型的測定。
在識別能刺激心肌細(xì)胞分化的多肽或化合物的方法中，第一個(gè)例子是將細(xì)胞用不同濃度的多肽或化合物培養(yǎng)，測定各種對心肌細(xì)胞分化的影響。
第二個(gè)例子是識別這些多肽或化合物誘導(dǎo)細(xì)胞分化的作用是否強(qiáng)于心肌細(xì)胞增殖的強(qiáng)誘導(dǎo)物—胰島素類生長因子(IGF-1)的作用。將細(xì)胞在單獨(dú)加IGF-1或IGF-1及其他多肽或化合物的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，測定這些多肽或化合物抑制IGF-1誘導(dǎo)DNA合成的能力，并測定肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的裝配與細(xì)胞間的粘合。
第三個(gè)例子是將細(xì)胞放入單獨(dú)加脫羥腎上腺素(PE)或再加試驗(yàn)用多肽或化合物的培養(yǎng)液培養(yǎng)。這些多肽或化合物增加由PE引起的心肌細(xì)胞分化的能力被確定。一個(gè)能刺激心肌細(xì)胞分化的多肽可刺激肌原纖維節(jié)的裝配，從而以多種方式增強(qiáng)心臟功能，包括激活神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的專一受體如ErbB2，ErbB3和ErbB4。
本發(fā)明還包含了一種識別能抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激心肌細(xì)胞分化的多肽或化合物的方法。該方法包括在神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白存在下，使試驗(yàn)的多肽或化合物接觸心肌細(xì)胞，并測定它們對神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激的抑制作用。一種化合物可以通過阻斷，壓制，逆轉(zhuǎn)或拮抗神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激心肌細(xì)胞分化的作用。具體步驟為測定心肌細(xì)胞的DNA合成。
本發(fā)明還包含了一種在哺乳動(dòng)物內(nèi)防止心肌細(xì)胞間粘合的分離和/或肌原纖維節(jié)錯(cuò)誤排列的治療方法。該方法包含對哺乳動(dòng)物施用有效劑量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或化合物。治療方法為直接處理由心肌細(xì)胞間粘合分離和/或肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)排列錯(cuò)誤引起的心力衰竭。
本發(fā)明還包含了一種防止或降低哺乳動(dòng)物心臟病發(fā)病率的方法。該方法包含防止或降低某些多肽或化合物對神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白及其受體作用的干擾或影響，這些影響產(chǎn)生心力衰竭。
在另一具體例子中，用一種酷似神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白作用的治療劑來處理或防止PE或IGF-1傳遞的心肌細(xì)胞的功能障礙。
另外，本發(fā)明還包含了一種確定受治療者心臟病或心力衰竭的素質(zhì)的方法。該方法包含測定受治療者的心肌細(xì)胞或相關(guān)細(xì)胞能否表達(dá)正?；蜃銐蛩降纳窠?jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其ErbB受體的能力。無此能力者預(yù)示具心臟疾病或心力衰竭的素質(zhì)。
本發(fā)明包括用神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白多肽，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白衍生物或具有類似神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白作用的化合物來制備用于處理或治療心臟病與心力衰竭的藥物。由神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白制得的該藥物還可選擇與某種能抑制不同的肥大誘導(dǎo)途徑的化合物結(jié)合長期使用。其他可選擇的成分包括用于充血性心力衰竭病例中的心臟營養(yǎng)抑制劑(如Ct-1對抗劑)、ACE抑制劑如卡托普利(captopril)、人生長因子及IGF-1，或另一些用于其他心力衰竭或心臟紊亂的病例中的抗肥大的，心肌營養(yǎng)的，抗心律不齊的，或影響肌收縮力的因子。
本發(fā)明還包括生產(chǎn)重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的方法。
通過培養(yǎng)心肌細(xì)胞作為模型，本發(fā)明者評估了心肌細(xì)胞分化成熟與肌原纖維節(jié)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的裝配或維持中的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白信號。用純化的重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(rhNRGB2)培養(yǎng)胚胎心肌細(xì)胞，測定神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白對細(xì)胞信號的影響。10-8M神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)生至少21小時(shí)長的MAP激酶持久激活，而10-10M的rhNRGB2僅能產(chǎn)生短暫的激活作用。Cdk的抑制物p21CIP1的表達(dá)在10-8M濃度時(shí)增加，在10-10M時(shí)不增加。增高NRG濃度，伴隨p21CIP1表達(dá)的增加，產(chǎn)生DNA合成減少導(dǎo)致終極分化。而在低濃度時(shí)，則觀察到DNA合成增加與細(xì)胞增殖的繼續(xù)。此外，當(dāng)rhNRGb2以10-8M，或10-10M濃度與IGF-1混合時(shí)，未見DNA合成的負(fù)影響，并顯著地阻斷了IGF-1所刺激的心肌細(xì)胞增殖。為了進(jìn)一步評估NRG刺激的心肌細(xì)胞分化，培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞的肌原纖維節(jié)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)被用鬼筆毒環(huán)肽染色與免疫熒光染色(用抗輔肌動(dòng)蛋白的抗體)來測定。NRG顯著地改進(jìn)了肌原纖維節(jié)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)與細(xì)胞間的粘合。用IGF-1或PE處理則沒有上述的作用。當(dāng)用rhNRGB2與IGF-1或PE混合時(shí)，rhNRGB2改進(jìn)了細(xì)胞結(jié)構(gòu)。10-8M濃度的rhNRGB2顯示了對肌原纖維節(jié)與細(xì)胞間粘合改進(jìn)的最大效應(yīng)。此外，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白重疊了由PE刺激傳遞的MHC-α的負(fù)調(diào)節(jié)。這些發(fā)現(xiàn)指出NRG的功能通過二種不同的途徑一種途徑在低濃度時(shí)引起心肌細(xì)胞生長，而另一種途徑在高濃度時(shí)通過持久地激活MAP激酶途徑傳遞，并引起終極分化與成熟。
本發(fā)明可通過給予有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白來處理及防止哺乳動(dòng)物心力衰竭或心肌細(xì)胞肥大。更可取的是可用于處理一個(gè)已患有或?qū)⒁夹牧λソ叩幕颊摺?br> 本發(fā)明還可用于防止那些患者由于使用某種藥物而引起心臟肥大或充血性心力衰竭。在發(fā)明的方法中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白多肽可在使用該種引起心臟疾病的藥物之前、同時(shí)或之后施用。
在發(fā)明的治療方法中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白多肽可長期或急性地注射入病人的靜脈。
本發(fā)明可與現(xiàn)今的治療方法結(jié)合用于心力衰竭的處理，如與ACE抑制劑處理結(jié)合。ACE抑制劑是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥物，它能防止血管緊張素I轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換為血管緊張素II。ACE抑制劑可通過降低全身血管抵抗及減輕循環(huán)的充血使充血心力衰竭者受益。ACE抑制劑包括那些商標(biāo)為Accupril(喹那普利)，Altace(雷米普利)，Capoten(卡托普利)，Lotensin(benazepril)，Monopril(福辛普利)，Prinivil(賴諾普利)，Vasotec(依那普利)，及Zestril(賴諾普利)。
本發(fā)明可與處理心臟疾病如高血壓的藥物治療結(jié)合。例如，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白多肽可與內(nèi)皮因子受體抵抗劑一起施用，如內(nèi)皮因子受體的抗體，肽類與小分子抵抗劑；β-腎上腺受體抵抗劑如卡維地洛；α1-腎上腺受體抵抗劑；抗氧化劑；多種作用的化合物(如β-封閉劑/α-封閉劑/抗氧化劑)；卡維地洛-類化合物或在卡維地洛中具多種功能的化合物組合；及生長因子等。
神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類似物單獨(dú)或與其他肥大壓制劑途徑促進(jìn)劑或抵抗已知的肥大誘導(dǎo)途徑的分子結(jié)合用，能作為處理哺乳動(dòng)物心力衰竭的藥物。
下面將參照下列附圖作進(jìn)一步詳細(xì)描述。


圖1表示神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在不同濃度下減少胚胎心肌細(xì)胞中DNA合成的情況。純化的心肌細(xì)胞在膠原蛋白涂層的96孔板里培養(yǎng)。加載體作為對照(X)，rhNRGB2(▲)，或IGF-1(◆)，在不同的濃度。細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)后用[3H]胸苷合并法([3H]thymidine incorporation)測定DNA。數(shù)據(jù)從5個(gè)培養(yǎng)皿中數(shù)據(jù)的平均值加上標(biāo)準(zhǔn)誤差所得。
圖2表示神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激引起心肌細(xì)胞內(nèi)MAP激酶的持久激活。(a)細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，加載體(-)，或加10-8M，或10-10M的rhNRGb2(+)，時(shí)間如表上所示。收集被處理的細(xì)胞并用特殊的Phospo-Mark抗體做Western印跡法。用抗erbB2抗體的Western印跡法來標(biāo)準(zhǔn)化。(b)條帶強(qiáng)度用密度計(jì)定量，二條時(shí)間曲線MAP激酶對10-8M配體(▲)，和10-10M配體(O)的反應(yīng)。
圖3表示神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激增加了心肌細(xì)胞內(nèi)p21CIP1的表達(dá)。(a)在血清(5％FBS)存在或不存在的條件下用10-8M，或10-10M的rhNRGb2刺激培養(yǎng)心肌細(xì)胞24小時(shí)。將細(xì)胞用電泳加樣緩沖液裂解后做Western印跡法分析。p21CIP1用抗p21CIP1的單克隆抗體測定。加樣的蛋白含量通過測定erbB2表達(dá)來標(biāo)準(zhǔn)化。(b)在第一行條帶的密度分析結(jié)果中，白色或水平條紋棒為不經(jīng)配體刺激的p21CIP1表達(dá)，灰色或垂直條紋棒為經(jīng)低濃度配體刺激，及黑色或斜紋棒為經(jīng)高濃度刺激。
圖4表示神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白抑制IGF-1刺激心肌細(xì)胞中的DNA合成。用最佳濃度(10-9M)的IGF-1，在10-8M，或10-10M的rhNRGb2存在或不存在下刺激96孔培養(yǎng)皿中的細(xì)胞。24小時(shí)后用[3H]胸苷合并法測定DNA合成。圖中的棒顯示了5孔測定的平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤差，結(jié)果來自至少三次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
圖5表示神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白所增強(qiáng)的心肌細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白纖維組合。新生大鼠心肌細(xì)胞用加或不加10-8M rhNRGb2的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)后，用鬼筆毒環(huán)肽固定，染色。在紫外熒光顯微鏡下，心肌肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞顯露出紅色的纖維，用40倍鏡拍照。
圖6表示神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白所增強(qiáng)的肌原纖維節(jié)蛋白的裝配與組合及細(xì)胞間粘合。新生大鼠心肌細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液(a)，加10-10M的rhNRGb2(b)，加10-8M的rhNRGb2(c)培養(yǎng)48小時(shí)。然后用抗α-輔肌動(dòng)蛋白的抗體進(jìn)行免疫-熒光染色。在紫外熒光顯微鏡下，肌原纖維節(jié)中的心臟輔肌動(dòng)蛋白顯露出綠色的纖維。用40倍鏡拍照。
圖7表示神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白所改進(jìn)的經(jīng)IGF-1刺激的心肌細(xì)胞中的肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞間粘合。心肌細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液(a)加10-9M的IGF-1，(b)(或)加10-9M的IGF-1與10-8M的rhNRGb2培養(yǎng)48小時(shí)。然后將細(xì)胞固定并用抗α-輔肌動(dòng)蛋白的抗體進(jìn)行免疫-熒光染色。在紫外熒光顯微鏡下，肌原纖維節(jié)中的心臟輔肌動(dòng)蛋白顯露出綠色的纖維。用40倍鏡拍照。
圖8表示神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白所改進(jìn)的經(jīng)PE刺激的心肌細(xì)胞中的肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞間粘合。將心肌細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液(a)加10-4M的PE(b)(或)加10-4M的PE與10-8M的rhNRGb2培養(yǎng)48小時(shí)。然后將細(xì)胞固定并用抗α-輔肌動(dòng)蛋白的抗體進(jìn)行免疫-熒光染色。在紫外熒光顯微鏡下，肌原纖維節(jié)中的心臟輔肌動(dòng)蛋白顯露出綠色的纖維。用40倍鏡拍照。二種細(xì)胞表型由PE單獨(dú)刺激被觀察并標(biāo)記為A和B。
圖9表示神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)PE-壓制的肌球蛋白重鏈α異構(gòu)體(MHC-α)的表達(dá)。心肌細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)并分別添加PE，NRG，或PE與NRG。相關(guān)的MHC-α和MHC-β的表達(dá)水平用較低周期(20個(gè)周期)的PT-PCR測定。PCR產(chǎn)量代表這兩個(gè)基因相對的表達(dá)水平。
利用心肌細(xì)胞分化的離體系統(tǒng)，與二個(gè)已確定的由α-腎上腺素促進(jìn)劑及IGF-1產(chǎn)生的激素與生長因子的刺激作比較，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激分化反應(yīng)的功能得到確認(rèn)。本發(fā)明已證實(shí)了神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白分化途徑存在于心肌細(xì)胞中，且神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白多肽能激活這些途徑。由于心肌細(xì)胞的分化包括肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的組合及細(xì)胞間粘合的過程，因此本發(fā)明提供了一個(gè)處理和防止心肌細(xì)胞中肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的組合及細(xì)胞間粘合錯(cuò)誤組合的有用方法，該方法亦能增強(qiáng)心肌病的心臟功能，識別激活心肌細(xì)胞分化途徑的多肽或化合物。
本文中所用的術(shù)語如下“神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類似物”是一些能激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3異二聯(lián)蛋白酪氨酸激酶的分子，如神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白異構(gòu)體，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白中的EGF區(qū)域，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白突變體，和任何能激活上述受體的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類的基因產(chǎn)物。本發(fā)明中用的“神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白”是以下的多肽，該多肽系人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白β2異構(gòu)體的一個(gè)片段，其中包含了受體結(jié)合區(qū)EGF-類區(qū)。
cDNA的順序?yàn)锳GC CAT CTT GTA AAA TGT GCG GAG AAG GAG AAA ACT TTC TGTGTG AAT GGA GGG GAG TGC TTC ATG GTG AAA GAC CTT TCA AAC CCCTCG AGA TAC TTG TGC AAG TGC CCA AAT GAG TTT ACT GGT GAT CGCTGC CAA AAC TAC GTA ATG GCC AGC TTC TAC AAG GCG GAG GAG CTGTAC CAG根據(jù)上述cDNA順序編碼的氨基酸順序?yàn)镾HLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ“心肌細(xì)胞分化”是一種狀態(tài)，其特征為DNA合成的降低大于10％，DNA合成被其他因子刺激的抑制大于10％，充分組合的肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞間的粘合，對MAP激酶的持久激活，與p21CIP1表達(dá)增加。
“有序的肌原纖維節(jié)或肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)”是一種狀態(tài)，其特征為心肌細(xì)胞中收縮蛋白通過α-輔肌動(dòng)蛋白的免疫-熒光染色顯出直排列。細(xì)胞中α-輔肌動(dòng)蛋白的直排列在圖表中可用顯微鏡檢查及相連的攝影來區(qū)別。
“肌原纖維節(jié)或肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤組合或排列”與上述定義意義相反。
“細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的組合或增強(qiáng)的組合”是一種狀態(tài)，其特征為通過對心肌細(xì)胞的鬼筆毒環(huán)肽染色所顯示的直的肌動(dòng)蛋白纖維。細(xì)胞中直的肌動(dòng)蛋白纖維在圖表中可用顯微鏡檢查及相連的攝影來區(qū)別。
“細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的無序組合或排列”與上述定義意義相反。
“MAP激酶的持久激活”是指MAP激酶的磷酸化狀態(tài)P42/44在細(xì)胞中維持至少24小時(shí)。
“p21CIP1表達(dá)增加”是指p21CIP1表達(dá)至少增加50％并在細(xì)胞中維持至少24小時(shí)。
“心臟疾病的處理”包括所有合適的方法，如靜脈注射神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白多肽，基因治療方法，用編碼神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或衍生物的基因植入心臟或其他細(xì)胞去處理心臟疾病。例如，用腺病毒或與腺病毒結(jié)合的病毒作為載體運(yùn)送神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白基因進(jìn)入心臟或其他細(xì)胞，然后被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能表達(dá)并分泌神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白多肽，從而激活心肌細(xì)胞內(nèi)的ErbB(受體)。
術(shù)語“處理”與類似詞用于此通常指一個(gè)計(jì)劃獲得的藥理及/或生理的效應(yīng)。該效應(yīng)可以是預(yù)防完全或部分地防止一種疾病或癥狀；也可以是治療完全或部分地治療一種疾病及/或提供對此疾病相反的作用。“處理”在此覆蓋了對哺乳動(dòng)物疾病的處理，特別對人類的疾病的處理。并包括防止該疾病在那些尚未被診斷但被預(yù)處理的受治療者中發(fā)作。
控制該種疾病。如控制疾病發(fā)展或減輕該疾病，使疾病退化等。
本發(fā)明直接處理那些具有心臟疾病和相關(guān)條件如心力衰竭發(fā)展危險(xiǎn)的病人。
“心力衰竭”是指心臟功能不正常，心臟不能以適合的速度泵出足夠的血液以滿足代謝的組織。心力衰竭的范圍包括充血的心力衰竭，心肌梗塞，心動(dòng)過速(快速心律不齊)，家族肥大型心肌病，局部缺血心臟病，自發(fā)擴(kuò)大的心臟病，及心肌炎。局部缺血，充血，風(fēng)濕性，及自發(fā)形式中任何一種因素都能引起心力衰竭。慢性的心肌肥大是充血性心力衰竭與心臟停博的前體的一種顯著病態(tài)。
“處理”涉及治療處理與預(yù)防或防止的測定。已具紊亂或具紊亂傾向的病人需處理。肥大可由任何對視黃酸應(yīng)答的原因所引起，包括先天性的，病毒的，自發(fā)的，心臟或肌肉營養(yǎng)的原因，或因局部缺血或局部缺血造成的損害如心肌梗塞所引起。處理被用于終止或減緩肥大的進(jìn)程，特別當(dāng)心臟局部缺血造成損害心肌梗塞后。這些藥劑應(yīng)立即施用，可防止或減小肥大。
在下列實(shí)施例中采用了下述這些試劑與抗體IGF(Boehringer)；膠原酶(Worthington)；胰酶(Gibco BRL)；MEK1(MAPKK)抑制劑(PD98059)(New England)；[甲基-3H]胸苷(Amersham)；抗-erbB2單克隆抗體(Novocastra)；單克隆IgG2b；p21CIP1(F-5)(Santa Cruz)；抗-磷酸酪氨酸辣根過氧化物酶(HRPO)偶聯(lián)的單克隆抗體，RC20(Transduction Laboratories)；抗-α-sacromeric actin單克隆抗體(clone 5c5)，HRPO-偶聯(lián)的抗兔Ig，和抗-小鼠Ig(Sigma)；PhosphoPlus p44/42MAP激酶(Thr202/Tyr204)抗體盒(New England)；抗-FLAG M1親和凝膠和抗-FLAG M2單克隆抗體(Eastman Kodak)。
實(shí)施例1 重組NRGb2的表達(dá)與純化A.編碼人NRGb2 cDNA的擴(kuò)增用Rneasy Mini試劑盒從能高表達(dá)NGR的人乳腺癌細(xì)胞株MDAMB-231中分離全部RNA。合成第一鏈DNA，NRG的cDNA片斷通過PCR擴(kuò)增，正向引物(GATCAAGCTTAGCCATCTTGTAAAATGTGCG)包含一個(gè)四種核苷酸的引導(dǎo)序列及一個(gè)Hind III位點(diǎn)(加下線者)，與NRGb2反向的引物(5-GATCAAGCTTCTACTGGTACAGCTCCTCCGC-3)，含有一個(gè)引導(dǎo)序列，一個(gè)Hind III位點(diǎn)(加下線者)，與一個(gè)讀框內(nèi)的終止密碼子(黑體與加下線者)。
將編碼人NRGb2異構(gòu)體(rhNRGb2)的EGF區(qū)(氨基酸殘基177-237)插入pFLAG1表達(dá)載體(IBI)。rhNRGb2與1FLAG-多肽在它的N-末端相連。在大腸桿菌DH5α的胞質(zhì)中表達(dá)。用抗FLAGM1的單克隆抗體的親和層析純化。純化后的rhNRGb2純度超過90％。
B.重組NRGb2的表達(dá)編碼NRGb2的PCR產(chǎn)物用Hind III降解并克隆到PFLAG.1表達(dá)載體(International Biotechnologies)。轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α后，測定含有NRGb2編碼的cDNA克隆的菌落儲藏在甘油中。pFLAG.1原核表達(dá)載體被設(shè)計(jì)為產(chǎn)生一個(gè)可溶的重組蛋白，該蛋白在轉(zhuǎn)化細(xì)菌的胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，其中摻入了8個(gè)氨基酸殘基pFLAG.1及21個(gè)氨基酸殘基的引導(dǎo)順序(ompA)，引導(dǎo)順序?qū)⑷芎系鞍滓孜恢涟|(zhì)空間，ompA順序在易位過程中被切除。重組的溶合蛋白可用M1抗-FLAG單克隆抗體的親和層析來純化。
轉(zhuǎn)化的E.coli在37℃振蕩培養(yǎng)直至OD600值達(dá)到0.8，然后加入500μM的異丙基-1-硫-β-D吡喃(型)半乳糖苷孵化2小時(shí)。在初始實(shí)驗(yàn)中決定每一個(gè)E.coli細(xì)胞成分的表達(dá)水平，將異丙基-1-硫-β-D吡喃(型)半乳糖苷誘導(dǎo)的100ml培養(yǎng)液分成3份，離心收集細(xì)胞。將一份細(xì)胞沉淀重新懸浮在SDS-PAGE加樣緩沖液中，分離出全部細(xì)胞成分。通過加5ml抽提緩沖液A[50mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，0.25mg/ml溶菌酶，50μg/ml NaN3]，再加0.5ml抽提緩沖液B[1.5MNaCl，0.1M CaCl2，0.1M MgCl2，0.02μg/ml DNase I，0.2mM NaVO3，0.2mM苯甲基磺酰氟，0.2mM亮抑酶肽，0.2mM抑蛋白酶肽]，第二份沉淀被用于將全部細(xì)胞沉淀分級成可溶與不溶成分。產(chǎn)生的懸浮液用18000xg離心1小時(shí)，分出溶解與不溶的成分。不溶成分用SDS-PAGE加樣緩沖液重新懸浮，而可溶成分用2X的加樣緩沖液等體積混合。最后，第三份細(xì)胞沉淀重懸于8ml的OS緩沖液
并用3500xg在10℃離心10分鐘。細(xì)胞立刻用5ml冰水重新懸浮以釋放胞質(zhì)蛋白。然后在10℃用3500xg離心10分鐘，收集上清液，將10μl上清液與同體積的SDS-PAGE加樣緩沖液混合，電泳及轉(zhuǎn)移后，蛋白用抗-FLAGM2單克隆抗體及增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法(ECL，Amersham)檢測。M2抗體的檢測含有ompA-切除與非切除形式的FLAG蛋白。
C.重組蛋白的純化在胞質(zhì)空間表達(dá)的NRGb2用僅與ompA-切除FLAG溶合蛋白結(jié)合的抗-FLAG M1單克隆的親和層析分離純化。這種抗體僅在鈣離子存在時(shí)與FLAG多肽結(jié)合；因此，胞質(zhì)細(xì)胞組分用含2mM CaCl2的TBS(150mM NaCl和50mMTris-HCl，pH7.5)并過柱。結(jié)合在柱上的蛋白用含2mM EDTA的TBS洗脫，然后用M2抗-FLAG的抗體做Western印跡法及考馬氏藍(lán)SDS-PAGE膠染色分析純度。
實(shí)施例2 小鼠心肌細(xì)胞的初級培養(yǎng)小鼠胚胎(E11.5-12.5)被用于準(zhǔn)備初級的心肌細(xì)胞。心臟組織在無菌條件下從胚胎中分離如前所述。用5ml磷酸緩沖液(PBS，pH7.4)洗三次。組織用0.05％胰蛋白酶/0.57mM EDTA在37℃降解15分鐘。丟棄分離的細(xì)胞，留下的組織用含0.41mg/ml膠原酶和0.6mg/ml胰酶的PBS在37℃震蕩(100rpm)15-30分鐘。將二步處理所分離的細(xì)胞與相同體積的冷小牛血清(FBS)混合，終止降解反應(yīng)，在室溫下1500rpm離心5分鐘。去除上清液，沉淀用Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco BRL)加10％FBS，10mM谷氨酰胺，100單位/ml青霉素和鏈霉素重新懸浮。通過預(yù)涂在培養(yǎng)皿3-5次(1小時(shí)/次)，心肌細(xì)胞被濃縮。再將細(xì)胞在明膠預(yù)處理的6孔或96孔的培養(yǎng)皿中，最終密度分別為2.5×105細(xì)胞/孔或2×103細(xì)胞/孔培養(yǎng)20小時(shí)。在用NRG或其他生長因子在無血清培養(yǎng)液(DMEM)37℃處理前撤除血清。
用此方法，本發(fā)明者可常規(guī)地得到大于90％的心肌細(xì)胞(數(shù)據(jù)未提供)。用單克隆抗α-肌原纖維節(jié)肌動(dòng)蛋白的抗體(克隆5c5)(Sigma)對細(xì)胞進(jìn)行免疫-熒光染色。在顯微鏡下觀察評定。
實(shí)施例3 心肌細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞用PBS洗后，用4％多聚甲醛加0.1％Triton X-100在室溫固定30分鐘。固定的細(xì)胞用含5％脫脂牛奶的PBS阻斷30分鐘，然后用抗-a-輔肌動(dòng)蛋白(actinine)抗體(SIGMA)在室溫下孵育45分鐘。用PBS洗后，用抗-小鼠IgG與FITC(Silenus Laboratory，Australia)偶聯(lián)的抗體(SIGMA)在室溫下孵育30分鐘。用PBS洗后，將細(xì)胞用含1％對苯二胺(1mg/ml，Sigma)的甘油，裝蓋，封閉。用40倍鏡的紫外熒光顯微鏡檢查并拍照。對于鬼筆毒環(huán)肽染色，細(xì)胞在室溫下用4％甲醛固定1小時(shí)。用PBS洗二次后，細(xì)胞用鬼筆毒環(huán)肽在暗處染色小時(shí)。細(xì)胞用PBS洗五次后將細(xì)胞用含1％對苯二胺(1mg/ml，Sigma)的甘油制標(biāo)本，在紫外熒光顯微鏡下檢查。
p185neu與MAP激酶的磷酸化在6孔板中無血清培養(yǎng)的心肌細(xì)胞用rhNRGb2處理不同時(shí)間去激活erbB受體與MAP激酶。使細(xì)胞立即在200ml冷裂解緩沖液(50mM Hepes，pH7.5，150mMNaCl，10％甘油，1％(v/v)Triton X-100，1.5mM MgCl2，1mM 乙二醇四乙胺(EGTA)，10mM焦磷酸鈉，10mM NaF，2mM原釩酸鈉，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，10mg/ml抑蛋白酶肽及10mg/ml亮抑酶肽)中裂解。產(chǎn)生的裂解物用HRPO-偶聯(lián)的單抗RC20(12,000)探測erbB受體，用磷酸專一的p44/42 MAP激酶抗體(1∶1000)探測磷酸化的MAP激酶，用加強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)免疫印跡探測系統(tǒng)(Amersham)?？筫rbB受體被用于標(biāo)準(zhǔn)化加樣蛋白。熒光標(biāo)記的蛋白在薄膜上產(chǎn)生的條帶用密度計(jì)來定量。
p21CIP1蛋白的表達(dá)用不同濃度的rhNRGb2單獨(dú)或加MEK抑制劑PD98059刺激用無血清培養(yǎng)的細(xì)胞24小時(shí)，用加樣緩沖液(50mM Tris-Cl，pH6.8，100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚藍(lán)與10％甘油)裂解，并用p21CIP1抗體(1∶1,000)做免疫印跡分析。用HRPO-偶聯(lián)抗小鼠Ig(1∶3,000)，p21CIP1被用ECL免疫印跡系統(tǒng)測定。加樣的蛋白含量通過測定erbB2受體來標(biāo)準(zhǔn)化。免疫斑用密度計(jì)來定量。
胸苷合并法無血清24小時(shí)后，細(xì)胞用rhNRGb2或IGF-I在無血清的DMEM培養(yǎng)12小時(shí)，然后加入[甲基-3H]胸苷(0.5m Ci/孔)用冰的5％三氯醋酸洗二次，及冰的PBS洗5次。用100ml 1％SDS溶解細(xì)胞，液閃記數(shù)計(jì)記數(shù)。所有的數(shù)據(jù)用平均數(shù)加標(biāo)準(zhǔn)誤差表達(dá)。
初級小鼠胚胎心肌細(xì)胞(E11.5-12.5)中的DNA合成在經(jīng)過rhNRGb2刺激后被評估，研究細(xì)胞生長對NRG的反應(yīng)。在圖1中，10-10M濃度的rhNRGb2使DNA合成增加約2倍。然而當(dāng)配體濃度增加時(shí)，DNA合成顯著地減少。與對rhNRGb2的反應(yīng)相反，重組人IGF-1僅引起細(xì)胞增殖反應(yīng)，該反應(yīng)與施用的生長因子濃度無關(guān)。高濃度的NRG對DNA合成的抑制不是因?yàn)閞hNRGb2試劑中的E.coli蛋白所引起的，因?yàn)檫@些蛋白從用FLAG載體轉(zhuǎn)染的細(xì)菌中提純后，并沒有顯示對心肌細(xì)胞增殖的負(fù)作用。
erbB受體族的活化激發(fā)了一個(gè)分子相互作用的鏈鎖反應(yīng)，最終導(dǎo)致MAP激酶的刺激。如前報(bào)道，MAP激酶活化的持久對細(xì)胞分化是決定性的(Traverse等(1994)Current Biology 4694-701)。在用10-8M或10-10M的rhNRGb2處理后，通過用能識別被激活的p42/p44 MAP激酶專一的磷酸-MAP激酶抗體來研究MAP激酶活化的時(shí)間過程。如圖2所示，在高用量rhNRGb2時(shí)，p42/p44 MAP激酶的活化能持久至少21小時(shí)，而在低濃度時(shí)，MAP激酶的活化短暫并在不到3小時(shí)內(nèi)回落到基礎(chǔ)水平。
由于MAP激酶的短暫激活與p21CIP1的短暫表達(dá)直接有關(guān)，并且p21CIP1的積累導(dǎo)致細(xì)胞周期停留在G1期，發(fā)明者提出是否MAP激酶的持久激活導(dǎo)致一個(gè)高水平p21CIP1表達(dá)的問題。圖3中顯示，p21CIP1表達(dá)的增加僅在用高濃度的rhNRGb2時(shí)被觀察到。這個(gè)對p21CIP1表達(dá)的效應(yīng)獨(dú)立于細(xì)胞培養(yǎng)條件，因?yàn)樵谟脽o血清及含血清培養(yǎng)液時(shí)，均觀察到相似的效應(yīng)。10-8M rhNRGb2增加p21CIP1表達(dá)能持久至少24小時(shí)。這樣在NRG刺激的心肌細(xì)胞中，p21CIP1表達(dá)的持久對DNA合成的抑制是決定性的。
通過混合rhNRGb2與IGF-I后測定心肌細(xì)胞的DNA合成，評價(jià)NRG傳遞的心肌細(xì)胞分化是否對抗由其他生長因子所刺激的增殖。這個(gè)問題非常重要，因?yàn)樵隗w內(nèi)，心肌細(xì)胞暴露在多種多肽激素與生長因子下。在此實(shí)驗(yàn)中，IGF-1的最佳濃度(10-9M)與10-8M，或10-10M的NRG結(jié)合用。如圖4所示，與單用NRG不同，低濃度的NRG對DNA合成產(chǎn)生很小的負(fù)效應(yīng)，而高濃度的NRG顯著地阻斷了心肌細(xì)胞對IGF-1刺激的反應(yīng)。后一結(jié)果支持以上的數(shù)據(jù)一個(gè)特殊的細(xì)胞內(nèi)的途徑是由高濃度的NRG激活的。
通過用專一性抗肌原纖維節(jié)或肌原纖維蛋白α-輔肌動(dòng)蛋白抗體的免疫-熒光染色與對肌動(dòng)蛋白纖維的鬼筆毒環(huán)肽染色，評估培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞的表型。
在無血清培養(yǎng)液中的細(xì)胞顯示出細(xì)胞骨架無序組合(圖5)，而加NRG培養(yǎng)的細(xì)胞具有有序組合的肌動(dòng)蛋白纖維(圖5)。圖6顯示，在用抗α-輔肌動(dòng)蛋白抗體的免疫-熒光染色的細(xì)胞中，與不加NRG的細(xì)胞相比，NRG顯著地改進(jìn)了肌原纖維節(jié)的裝配。NRG的濃度也扮演了一個(gè)重要角色高濃度的NRG(10-8M)產(chǎn)生了更有組織的肌原纖維節(jié)(圖6)。細(xì)胞間的粘合也被NRG，特別在高濃度時(shí)的刺激所增強(qiáng)。由NRG處理的細(xì)胞結(jié)構(gòu)也與IGF-1或PE刺激的細(xì)胞進(jìn)行了比較。IGF-1對細(xì)胞肌原纖維節(jié)與細(xì)胞間的粘合不具有明顯的效應(yīng)(圖7)，然而，PE的刺激產(chǎn)生了二種類型的細(xì)胞A型細(xì)胞與NRG刺激的細(xì)胞相似，具充分分化及很有組織的肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)；B型細(xì)胞有一個(gè)大的細(xì)胞表面積與相對較差的肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞間的粘合(圖8)。重要地是，當(dāng)細(xì)胞被NRG(10-8M)與IGF-1同時(shí)刺激時(shí)，與單獨(dú)用IGF-1刺激的細(xì)胞相比，它們顯示了改進(jìn)的肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)(圖7)。當(dāng)NRG(10-8M)與PE一起用于刺激細(xì)胞時(shí)，僅A型細(xì)胞被觀察到(圖8)。心肌細(xì)胞的分化與成熟伴隨著MHC-α表達(dá)的增加與MHC-β表達(dá)的減少。PE作為一個(gè)強(qiáng)力的肥大因子，抑制了MHC-α的表達(dá)(圖9)。然而，NRG單獨(dú)具有對MHC-α表達(dá)確認(rèn)的正效應(yīng)，并能抵消PE-傳遞的對MHC-α表達(dá)的負(fù)效應(yīng)(圖9)。
提供的證據(jù)表明，NRG的濃度是決定MAP激酶的短暫或持久的激活狀態(tài)的一個(gè)重要因素。MAP激酶的持久激活狀態(tài)產(chǎn)生了胚胎心肌細(xì)胞內(nèi)Cdk抑制劑p21CIP1的表達(dá)水平的增加，并伴隨DNA合成的減少。這個(gè)發(fā)現(xiàn)對于配體濃度梯度決定細(xì)胞分化與胚胎發(fā)育的結(jié)局提供了明確的證據(jù)，并進(jìn)一步提供了細(xì)胞內(nèi)信號途徑如何區(qū)分基于配體濃度的信號強(qiáng)度的分子觀察。
配體濃度在細(xì)胞分化中的重要性被猜想基于以下的觀察1)胚胎發(fā)育的模式與配體的梯度聯(lián)系。
2)離體時(shí)，配體濃度對細(xì)胞分化是關(guān)鍵的。
3)細(xì)胞中受體的過多表達(dá)改變了它們響應(yīng)配體刺激的結(jié)局。
考慮這些觀察，胚胎心肌細(xì)胞中NRG濃度依賴的MAP激酶激活建立了一個(gè)對進(jìn)一步描述erbB受體相連的細(xì)胞信號對配體濃度改變的反應(yīng)機(jī)制的模型。
NRG是心肌細(xì)胞分化因子的概念被NRG誘導(dǎo)胚胎心肌細(xì)胞中的p21CIP1表達(dá)的發(fā)現(xiàn)所支持。由于p21CIP1被完全確定為Cdk的抑制物，而Cdk能促進(jìn)細(xì)胞周期中的G1進(jìn)入S期，因此p21CIP1表達(dá)的增加對起始終極分化是關(guān)鍵的。這個(gè)概念也被以前發(fā)現(xiàn)的活體內(nèi)心肌細(xì)胞終極分化(Parker等(1995)Science 2671024-1027)與骨胳肌細(xì)胞分化發(fā)生時(shí)(Dias等(1994)Semin.Diagn Pathol.113-14)p21CIP1表達(dá)增加所支持。在后一過程中，p21CIP1表達(dá)增加最終導(dǎo)致退出細(xì)胞周期開始分化。因?yàn)閜21CIP1表達(dá)增加的發(fā)生早于其他細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子，它可作為骨胳肌分化的早期標(biāo)志。如這里所證實(shí)的，在NRG刺激的心肌細(xì)胞中，p21CIP1表達(dá)伴隨著DNA合成的減少，暗示NRG-刺激的p21CIP1表達(dá)的生理角色。此外，由ERK激酶抑制劑對MAP激酶與p21CIP1的抑制評定NRG-刺激的p21CIP1表達(dá)是MAP激酶激活的一個(gè)直接結(jié)果。
培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中持久的MAP激酶激活是誘導(dǎo)p21CIP1組成型表達(dá)所必需的，反之短暫的MAP激酶激活導(dǎo)致短暫的p21CIP1表達(dá)。后者不足以調(diào)節(jié)Cdk的活性，因?yàn)閜21CIP1將很快地降解而組成型表達(dá)對阻斷細(xì)胞周期蛋白/Cdk復(fù)合物是必需的。在PC12細(xì)胞中，持久的MAP激酶途徑被局限于應(yīng)答來自NGF受體的特殊信號。持久的MAP激酶激活使PC12細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞。然而，這個(gè)途徑在心肌細(xì)胞中能區(qū)別地應(yīng)答NRG基于濃度的信號強(qiáng)度。
進(jìn)一步支持NRG是一個(gè)分化因子的證據(jù)是當(dāng)心肌前體細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞時(shí)，NRG刺激肌原纖維節(jié)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的裝配。以前的觀察也指出分化程度高的細(xì)胞具有更有序的肌原纖維節(jié)(Rumynatsev，P.P.(1977)International ReviewCytology 51，p.187-273)。與PE或IGF-1刺激的細(xì)胞比較，NRG刺激的細(xì)胞有組合最好的肌原纖維節(jié)。更重要的是，當(dāng)NGF與PE或IGF-1混合時(shí)，NRG極大地改進(jìn)了肌原纖維節(jié)，指出當(dāng)其他細(xì)胞信號存在時(shí)NRG刺激肌原纖維節(jié)裝配占優(yōu)勢。NRG重疊PE-傳達(dá)的對MHC-a表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)，這表明NRG涉及維持收縮蛋白的成年型。如以前的研究指出，NRG、ErbB2和ErbB4在成年心臟中表達(dá)，NRG應(yīng)在維持心肌細(xì)胞分化狀態(tài)中起重要作用。
伴有心肌病的心力衰竭患者體內(nèi)有兩個(gè)非常重要的特征它們是肌原纖維與肌原纖維節(jié)的錯(cuò)誤排列。前者是細(xì)胞間粘合的松弛，后者是肌原纖維節(jié)組合的松弛。這些病理的狀態(tài)廣泛地存在于從充血的心力衰竭到擴(kuò)大的心肌病中，并嚴(yán)重地影響心臟功能?，F(xiàn)今沒有處理細(xì)胞間粘合及肌原纖維節(jié)裝配的辦法。NRG已被確認(rèn)在裝配與維持細(xì)胞間粘合及肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的過程中扮演一個(gè)角色。NRG刺激心肌細(xì)胞分化與裝配肌原纖維節(jié)結(jié)構(gòu)的結(jié)果指出心肌細(xì)胞分化與其細(xì)胞結(jié)構(gòu)重新構(gòu)建相聯(lián)系。此結(jié)論與對心肌細(xì)胞分化在心臟發(fā)育期間總的觀察相符分化的心肌細(xì)胞總是具有充分組合的肌原纖維節(jié)。
概括地說，NRG是心肌細(xì)胞的分化因子被下列證據(jù)所支持1)NRG刺激持久的MAP激酶激活；2)NRG增加p21CIP1表達(dá)；
3)NRG抑制IGF-1傳達(dá)的DNA合成；及4)NRG刺激心肌細(xì)胞裝配肌原纖維節(jié)與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)；5)NRG刺激成熟型MHC基因的表達(dá)。
實(shí)施例4治療用促進(jìn)劑配方的制備和應(yīng)用通過混合具有所需純度的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白或其類似物與可選擇的生理可接受的載體、賦型劑、或穩(wěn)定劑，可以制得治療心臟紊亂的促進(jìn)劑配方，并可以凍干或水溶液的形式保存。(Remington’s Pharmaceutical Sciences，16thedition，Oslo，A.，Ed.，1980)?？山邮艿妮d體、賦型劑、或穩(wěn)定劑施用的劑量與濃度對接受者是無毒的，并含有緩沖液，如磷酸，檸檬酸和其他的有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑，包括維生素C；低分子量(少于10個(gè)氨基酸殘基)肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水多聚物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸；單糖，雙糖和其他糖包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合試劑，如EDTA；乙醇糖，如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽離子，如鈉；非離子表面活性劑，如Tween，Pluronics或聚乙烯醇(PEG)。拮抗劑也適合與一種非蛋白多聚物(如聚乙二醇、聚丙二醇，或聚亞烷基類(polyalkylenes))連接。載體的用量可占總量的1-99％，最佳為重量的90-99％。
神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類似物在體內(nèi)施用應(yīng)該是無菌的。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類似物一般將以凍干或溶液形式保存。在凍干及重構(gòu)之前，類似物應(yīng)通過無菌的過濾膜。
治療用的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類似物成分一般被置于有無菌入口處的容器，一個(gè)靜脈內(nèi)的溶液袋或有被注射針穿透的塞子的小瓶。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類似物的施用僅以長期方式用下列途徑中的一種進(jìn)行注射或灌注通過靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，大腦內(nèi)，肌肉內(nèi)，眼內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，或損害部位內(nèi)，口服或用持久-釋放系統(tǒng)如下所注。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類似物可通過灌輸來連續(xù)給藥，或如果清除率足夠低的話，采取階段性濃縮注射，或給予血流或淋巴。更好的給藥方式是把心臟作為直接目標(biāo)，從而將神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類似物的副作用減到最小。
持久-釋放制劑的合適實(shí)例包括蛋白的疏水聚合物半透基質(zhì)，如薄膜或微型膠囊。持久-釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠如聚丙烯酸2-羥乙基-甲酯樹脂(Langer等(1981)J.Biomed.Mater.Res.15167-277和Langer(1982)Chem.Tech.1298-105)或聚乙烯醇、聚交酯(美國專利No 3,773,919，EP58,481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酰胺的共聚物(Sidman等(1983)Biopolymers22547-556)，非降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(Langer等(1981)同上)、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和leuprolideacetate組成的可注射中心體)，及聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。
神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類似物也可包在制備的微型膠囊內(nèi)，例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合技術(shù)(羥甲基纖維素或明膠-微型膠囊與聚-[甲基丙烯酸甲酯樹脂]微型膠囊，在膠態(tài)的傳送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白中心體、微乳膠、小顆粒和小膠囊)中，或在大乳膠中。這些技術(shù)發(fā)表在Remington’s Pharmaceutical Sciences(同上)中。
某些聚合物(如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸)能釋放分子超過100天，某些水凝膠則在短期內(nèi)釋放分子。當(dāng)被包在膠囊中的分子長時(shí)間保留在體內(nèi)，作為暴露在37℃濕度中的結(jié)果它們可能變性或凝聚，導(dǎo)致喪失生物活性。若采用合適的添加劑，和發(fā)展特殊的聚合物基質(zhì)成分等可設(shè)計(jì)出穩(wěn)定的機(jī)制。
持久-釋放的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類似物的成分也包括脂質(zhì)包裹的類似物。含有神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白類似物的脂質(zhì)體的制備方法是DE 3,218,121；Epstein等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688-3692；Hwang等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA774030-4034；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本專利申請83-118008；美國專利No.4,485,045和4,544,545；和EP 102,324。普通的脂質(zhì)體體積很小(約200-800)，為單層型，脂質(zhì)成分含大于30％摩爾數(shù)的膽固醇，調(diào)節(jié)膽固醇的比例而獲得最佳的治療效果。一個(gè)適當(dāng)?shù)某志?釋放配方的具體例子在EP647,449中。
用于治療的NRG有效劑量將根據(jù)治療對象、給藥途徑以及病人的狀況來定。醫(yī)生一般需要滴定劑量并根據(jù)需要調(diào)節(jié)給藥途徑以獲得最佳的治療效果。
NRG可選擇與其他因子結(jié)合施用來處理充血的心力衰竭，這些因子包括ACE抑制劑、CT-1抑制劑、人生長因子和/或IGF-1。如果被施用，這些因子的有效用量將由醫(yī)生決定。劑量的施用與調(diào)節(jié)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來確定，以獲得對充血心力衰竭的最佳治療效果，并理想地考慮到利尿藥的使用及一些疾病(如低血壓和腎臟損害)等。此外，劑量還取決于諸如所用藥物類型和待治療患者具體情況之類的因素。一般來說，如果藥物不加促進(jìn)劑，用量將是相同的；但應(yīng)根據(jù)存在的負(fù)作用、處理狀況、患者類型、促進(jìn)劑及藥物的種類及總量等因素，來給出治療的有效劑量。
例如ACE抑制劑，試驗(yàn)用的依那普利為5mg，若病人能承受，可增加到每天10-20mg，每天一次。作為另一個(gè)例子，病人初始試口服6.25mg的卡托普利，然后逐級增加劑量，當(dāng)病人能承受至每天二次或三次總量為25mg時(shí)，可滴定到50mg每天二次或三次。承受的水平通過測定是否血壓下降或伴隨低血壓的癥狀來估計(jì)。如有上述指征，劑量可增加到100mg每天二次或三次。卡托普利與氫氯噻嗪結(jié)合作為有效的成分被施用，并作為pH穩(wěn)定的中心它有一個(gè)保護(hù)卡托普利的緩釋的外殼直到卡托普利到達(dá)結(jié)腸。生產(chǎn)的卡托普利有片劑或膠囊。關(guān)于卡托普利與其他ACE抑制劑劑量的討論、施用、指征和禁忌癥在Physicians Desk Reference，Medical Economics Data Production Co.，Montvale，NJ.2314-2320(1994)中可找到。
在一個(gè)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的可注射治療成分的例子中，配方包含1％神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白與99％的鹽水，其中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白是多肽。在另一個(gè)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的可注射治療成分的例子中，配方包含5％的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白多肽，1％的ACE抑制劑卡托普利，與94％的鹽水。
權(quán)利要求
1.神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在體外促使心肌細(xì)胞分化中的應(yīng)用，該應(yīng)用包括用有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白處理心肌細(xì)胞。
2.神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在體外誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維節(jié)與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重新構(gòu)建或細(xì)胞間粘合的應(yīng)用，該應(yīng)用包括用有效量的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白處理心肌細(xì)胞。
3.神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在識別能抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激心肌細(xì)胞分化的多肽或化合物中的應(yīng)用，該應(yīng)用包括在神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白存在下使待識別的多肽或化合物在體外與心肌細(xì)胞接觸，并測定它們對神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激心肌細(xì)胞分化的抑制作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中細(xì)胞分化的測定包括DNA合成的增減。
5.神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白在制備用于治療心臟病和心力衰竭的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述藥物還可任選地與ACE抑制劑、CT-1抑制劑、人生長因子和/或IGF-1結(jié)合使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生長因子神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白及其類似物在體外促進(jìn)心肌細(xì)胞分化,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維節(jié)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重建或細(xì)胞間粘合,識別能抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白刺激心肌細(xì)胞分化的多肽或化合物,以及制備治療心臟病和心力衰竭藥物中的新的應(yīng)用。
文檔編號C07K14/435GK1276381SQ9910717
公開日2000年12月13日 申請日期1999年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月4日
發(fā)明者邱列群, 周明東 申請人:邱列群, 周明東