專利名稱：人干細(xì)胞生長因子突變蛋白及其制法和藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種活性和表達(dá)量有所提高的重組人干細(xì)胞生長因子突變蛋白。另外，本發(fā)明還涉及該突變蛋白的制備方法以及含有該突變蛋白的藥物組合物。
背景技術(shù)：
自1990年美國3個研究組幾乎同時報道干細(xì)胞因子以來，世界各地進(jìn)行了廣泛深入的研究。干細(xì)胞因子又稱肥大細(xì)胞生長因子(MGF)，Kit配體(KL)及Steel因子(SLF)。它是由骨髓微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種酸性糖蛋白。其糖基連在肽鍵的N和O基團(tuán)上，相對分子質(zhì)量31000～36000，由非共價結(jié)合的兩個相同亞基組成。等電點(diǎn)PI＝3.8。
SCF在小鼠由10號染色體Steel位點(diǎn)編碼。在人中位于12 q22～24。SCF有2種存在形式可溶性和膜結(jié)合型。在人中，編碼248個氨基酸的mRNA(SCF248)，其第6個外顯子中有一蛋白切割位點(diǎn)。由此mRNA表達(dá)165個氨基酸的可溶性SCF。編碼220個氨基酸的mRNA(SCF220)，其第6個外顯子中無蛋白切割位點(diǎn)。由此mRNA表達(dá)膜結(jié)合型SCF。在鼠中，可溶性SCF可由SCF248在第6外顯子切割或SCF248和SCF220的第7外顯子切割而成。膜結(jié)合型SCF由SCF220表達(dá)。2種形式SCF均有生物學(xué)活性(Huang EJ等，Mol Biol Cell，1992，3349)。鼠和人SCF對人造血細(xì)胞幾乎有相等的生物學(xué)活性，但對鼠細(xì)胞，鼠SCF比人SCF生物效應(yīng)強(qiáng)800倍(Martin FH等，Cell，1990，63(1)203)。
基因重組SCF和天然SCF有著相同生物學(xué)活性。2種形式SCF對造血都起重要作用。但Dolci等(Namre，1991，352(6338)809)發(fā)現(xiàn)結(jié)合型SCF比可溶性SCF支持造血長幾個星期，對原始胚細(xì)胞存活刺激作用以結(jié)合型SCF為強(qiáng)?？扇苄許CF激活c-kit受體短暫，誘導(dǎo)細(xì)胞表面c-kit受體下調(diào)更迅速。
SCF和其他細(xì)胞因子一起誘導(dǎo)干和祖細(xì)胞增生、延長其存活期及引起干和祖細(xì)胞動員。雖然SCF的受體在祖細(xì)胞無顯著不同，但SCF誘導(dǎo)紅系祖細(xì)胞增生比粒-單祖細(xì)胞強(qiáng)，可能是其他特異性因素影響祖細(xì)胞對SCF的反應(yīng)性(Olweus J等.Blood，1996(5)，881594)。給小鼠應(yīng)用SCF和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，外周血干細(xì)胞和祖細(xì)胞第1天即達(dá)高峰，6周后正常。骨髓中干和祖細(xì)胞第1天下降，第14天升高達(dá)10倍，6周后正常。表明最初外周血干和祖細(xì)胞升高是由骨髓中動員到外周血(Bodine DM等，Blood，1996，88(1)89)。Mauch等(Blood，1995，86(12)4674)報道SCF和IL-11合用增加長期骨髓增殖細(xì)胞(LTMRC)從骨髓動員到未切脾鼠的脾和切脾鼠的血液。Yonemura等(Blood，1997，89(6)1915)認(rèn)為SCF單獨(dú)在體外不能維持干細(xì)胞數(shù)量，體內(nèi)作用是SCF和其他細(xì)胞因子相互作用的結(jié)果。
在體外SCF和IL-7協(xié)同促進(jìn)前體B細(xì)胞增生。Takeda等(Blood，1997，89(2)518)認(rèn)為體內(nèi)B細(xì)胞發(fā)育不是受體c-kit和SCF相互作用，而另一受體型酪氨酸激酶(FLK2)對B細(xì)胞發(fā)育比c-kit更重要。
SCF在肥大細(xì)胞發(fā)育和存活中起關(guān)鍵作用。小鼠SCF的基因缺失導(dǎo)致結(jié)締組織和粘膜表面肥大細(xì)胞缺乏。由于SCF引起肥大細(xì)胞脫粒，應(yīng)用時一般以減少劑量為代價。Nocka等(Blood，1997，90(10)3874)發(fā)現(xiàn)二硫化物相聯(lián)系的二聚體SCF比普通SCF刺激細(xì)胞增生強(qiáng)10～20倍。但對肥大細(xì)胞脫粒并不比普通SCF強(qiáng)。
SCF既有化學(xué)激動性，也有化學(xué)趨化性。膜結(jié)合型SCF促進(jìn)造血祖細(xì)胞回到骨髓。靜脈輸注kit+造血祖細(xì)胞后其沿著SCF的梯度移動到骨髓。這是由kit粘附到骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面的SCF引起(Okumura N等，Blood，1996，87(10)4100)。Kim等(Blood，1998，91(1)100)認(rèn)為基質(zhì)細(xì)胞源因子-1(SDF-1)只有化學(xué)趨化性，它作為生理抗移動因子抑制造血祖細(xì)胞移出骨髓。
應(yīng)用SCF、促血小板生長因子(TPO)、IL-12、IL-3處理冷凍骨髓細(xì)胞移植給鼠，其恢復(fù)血小板和中性粒細(xì)胞比用未處理的骨髓移植早3～6天(RatajczakMZ等，Blood，1998，91(1)353)。在鼠模型中，受者在應(yīng)用5-FU前和后給予SCF注射，可以使干細(xì)胞從靜止期進(jìn)入細(xì)胞周期。這樣干細(xì)胞對5-FU敏感，易于殺死，為供者骨髓移入受者提供了穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，有利于骨髓移植的成功(Van os R，等，Blood，1997，89(7)2376)。
將蟲熒光素酶基因連在質(zhì)粒上，該基因以聚賴氨酸(PL)與抗生蛋白鏈菌素(SA)共價連接，生物素?；腟CF以生物素與SA連接，腺病毒與PL共價連接，用此載體轉(zhuǎn)染人MBO2和MO-7e細(xì)胞(兩者均表達(dá)c-kit)，孵育2小時通過SCF與c-kit結(jié)合轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90％(Schwarzenberger.Blood，1996，87(2)472)。但Fielding等(Blood，1998，91(5)1802)報道逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過連接SCF使SCF與造血細(xì)胞表面c-kit粘附，則病毒不能轉(zhuǎn)染造血細(xì)胞，對不表達(dá)c-kit的非造血細(xì)胞卻能轉(zhuǎn)染。
曾經(jīng)將血清SCF低下作為引起造血功能障礙的原因。據(jù)報道在再障、骨髓增生異常綜合征中，骨髓移植后患者血清SCF水平低下。Abkowitz等(Blood，1996，87(9)4017)檢測了34例純紅系再障患者血清SCF與正常人比較，無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。認(rèn)為血清SCF水平可能與臨床無相關(guān)性。但血清SCF是可溶性SCF，至于膜結(jié)合型SCF尚無法檢測。
Weaver等(Blood，1996，88(9)3323)將48例上皮卵巢癌患者第1天給予3g·(m2)-1環(huán)磷酰胺輸注，4小時輸完，美司鈉6g·(m2)-1輸注12小時。然后48例隨機(jī)分成4組，每人均注射5μg·kg·d-1G-CSF，每組中有9例加用重組人的SCF。按組別分別給予5μg·kg-1·d-1、10μg·kg-1·d-1、15μg·kg-1·d-1、20μg·kg-1·d-1?；熀?8小時開始應(yīng)用，直到外周血WBC≥4.0×109L-1。這時進(jìn)行外周血單成分采集。結(jié)果發(fā)現(xiàn)長期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LTC-IC)在SCF 20μg·kg-1·d-1組比單用G-CSF組增加5.8倍，CD34+細(xì)胞增加3倍，CD34+CD33-細(xì)胞增加64倍。Glaspy等(Blood，1997，90(8)2939)將215例高危期乳癌患者化療后隨機(jī)分組，單用G-CSF 10mg·kg-1·d-1達(dá)7d，G-CSF 10μg·kg-1·d-1和重組人SCF5、10、15、20、25、30μgkg-1·d-1聯(lián)合用藥達(dá)7、10、13d。每種療法的最后3d進(jìn)行外周血白細(xì)胞單成分采集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用20μg·kg-1·d-1SCF和10μg·kg-1·d-1G-CSF后，第5天開始進(jìn)行外周血單采是動員外周血祖細(xì)胞的最適劑量和最佳方案。Begley等(Blood，1997，90(9)3378)將62例早期乳癌患者化療前隨機(jī)分組接受12μg·kg-1·d-1G-CSF和同劑量G-CSF加rhSCF 5、10、15μg·kg-1·d-1達(dá)7天，以及用10d 10μg·kg-1·d-1SCF且第4天加用G-CSF達(dá)7天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)先用SCF3天作預(yù)治療，再用二者聯(lián)合治療組，外周血造血祖細(xì)胞升高更加明顯。SCF一般為皮下注射。最普遍的副反應(yīng)是注射局部皮膚有輕度水腫，外有一圈紅腫。一般在注射后4小時開始，持續(xù)24～48小時，以后恢復(fù)正常。偶有過敏反應(yīng)報道，應(yīng)用前可給予抗過敏預(yù)防。
綜上所述，人干細(xì)胞生長因子具有廣泛的應(yīng)用。然而，目前市售的人干細(xì)胞生長因子制品的活性仍需要進(jìn)一步提高。而且，目前用大腸桿菌來表達(dá)人干細(xì)胞生長因子的方法的表達(dá)量不夠高，且蛋白質(zhì)在純化時需要復(fù)性。因此，目前本領(lǐng)域中仍然需要一種生物活性和表達(dá)量更高的人干細(xì)胞生長因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分離的人干細(xì)胞生長因子突變蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述突變蛋白的DNA分子。本發(fā)明的另一目的是提供一種含有上述突變蛋白的藥物組合物。本發(fā)明還有一個目的是提供制備上述突變蛋白的方法。
為了滿足上述發(fā)明目的，本發(fā)明一個方面提供了一種分離的人干細(xì)胞生長因子突變蛋白，該突變蛋白含有Arg23Gly、Tyr110Ser和Pro288Ala突變。在一個較佳的實(shí)例中，所述突變蛋白具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明另一個方面提供了一種分離的DNA序列，該DNA序列包含上述人干細(xì)胞生長因子突變蛋白編碼序列。在一個較佳實(shí)例中，該DNA序列具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
本發(fā)明另一個方面提供了一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有編碼上述人干細(xì)胞生長因子突變蛋白的DNA序列以及與該DNA序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
本發(fā)明還有一個方面提供了一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞被上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。在較佳的實(shí)例中，該宿主細(xì)胞是大腸桿菌和枯草桿菌。
本發(fā)明另一個方面提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有藥學(xué)上有效量的上述人干細(xì)胞生長因子突變蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還有一個方面提供了一種制備上述人干細(xì)胞生長因子突變蛋白的方法，該方法包括下列步驟a)提供一表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有編碼上述人干細(xì)胞生長因子突變蛋白DNA序列以及與該DNA序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列；b)用步驟a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；c)在適合表達(dá)所述突變蛋白的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細(xì)胞；和d)分離純化獲得所表達(dá)出的突變蛋白。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于上述人干細(xì)胞生長因子突變蛋白的生物活性比天然的干細(xì)胞生長因子高10倍，而且其在大腸桿菌等宿主細(xì)胞中的表達(dá)量也有大幅度提高。本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)可通過下面的詳細(xì)描述得知。
附圖簡述

圖1顯示了本文所用的pUC18表達(dá)載體的圖譜以及pUC18表達(dá)載體中多克隆位點(diǎn)的核苷酸序列。
圖2顯示了用Microsoft Excel作出的SCF活性測定曲線圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種含有Arg23Gly、Tyr110Ser和Pro288Ala突變的分離的人干細(xì)胞生長因子突變蛋白。
本文所用的術(shù)語“干細(xì)胞生長因子”可以是具有天然野生型序列的人干細(xì)胞生長因子蛋白，也可以是具有突變序列的衍生型或重組人干細(xì)胞生長因子蛋白，只要該突變序列中不包括Arg23Gly、Tyr110Ser和Pro288Ala突變即可。天然的人干細(xì)胞生長因子蛋白的編碼序列及其氨基酸序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO1所示。
本發(fā)明者通過研究發(fā)現(xiàn)，通過將該蛋白質(zhì)氨基酸序列的23位的精氨酸(Arg)、110位的酪氨酸(Tyr)和288位的脯氨酸(Pro)分別突變成甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)和丙氨酸(Ala)，可使突變蛋白的生物活性大幅度提高。本文中所用的術(shù)語“Arg23Gly”即表示第23位的氨基酸由Arg變?yōu)镚ly。術(shù)語“Tyr110Ser”即表示第110位的氨基酸由Tyr變?yōu)镾er。術(shù)語“Pro288Ala”即表示第288位的氨基酸由Pro變?yōu)锳la。
本文所用的術(shù)語“分離的”在用于核酸或蛋白質(zhì)時，表示核酸或蛋白質(zhì)基本上不含其它在天然狀態(tài)下相關(guān)的細(xì)胞成分，其最好呈均質(zhì)狀態(tài)，但也可以是干的或水溶液。純度和均一性通?？捎梅治龌瘜W(xué)方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法測定。
在另一較佳的實(shí)施例中，還可使本發(fā)明突變蛋白與另一多肽、較佳的是與信號肽序列或在成熟多肽N端有特異性斷裂位點(diǎn)的其它多肽融合表達(dá)。通常，該信號肽編碼序列可以是載體的一個組件，或者它可以是插入載體的多肽DNA的一部分。該信號肽的功能是引導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物以活性的形式轉(zhuǎn)移(分泌)到基質(zhì)中，以便以后的純化并避免復(fù)性過程。本發(fā)明下文實(shí)施例中采用的一個例子是大腸桿菌OmpA的信號肽序列KKTAIAIAVALAGFATVAQA(20氨基酸，SEQ ID NO6)(GenBank ACCESSIONNumberU40577)，其編碼序列為aaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggcc(60bp，SEQ ID NO5)(GenBank Accession NumberU40577)。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可采用熟知的其它信號肽序列。
本發(fā)明還提供了一種編碼本發(fā)明上述人干細(xì)胞生長因子突變蛋白的DNA序列。在一個較佳的實(shí)例中，所述DNA序列具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可利用本領(lǐng)域中熟知的遺傳密碼的簡并性獲得編碼上述氨基酸序列的所有其它核酸序列。另外，還可針對該DNA序列以及任選插入的信號肽編碼序列進(jìn)行密碼子偏好設(shè)計，以便進(jìn)一步提高其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量。
本發(fā)明的突變蛋白可通過以下方法來進(jìn)行制備。首先，提供含有編碼本發(fā)明突變蛋白的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列的表達(dá)載體。
本文所用的術(shù)語“表達(dá)調(diào)控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達(dá)的序列。表達(dá)調(diào)控序列包括與目標(biāo)核苷酸序列操作性相連的啟動子和終止信號。它們通常還包括核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列。“操作性相連”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動子或增強(qiáng)子增加了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列是操作性相連的。
上述編碼突變型干細(xì)胞生長因子蛋白的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段來獲得，例如，根據(jù)已經(jīng)本文公開的人干細(xì)胞生長因子蛋白的DNA序列來合成引物進(jìn)行PCR法擴(kuò)增，或用諸如定點(diǎn)誘變、盒式誘變和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)誘變等方法進(jìn)行誘變。
在獲得了具有定點(diǎn)突變后的DNA序列后，就可通過本領(lǐng)域熟知的各種方法將其連入合適的表達(dá)載體中。本發(fā)明中所用的表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種市售的表達(dá)載體，例如購自Qiagen和Promega公司的表達(dá)載體，如pUC18。
然后，用上述獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳的宿主細(xì)胞是大腸桿菌和枯草桿菌。
最后，在適合本發(fā)明突變蛋白表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞，然后用離子交換層析、疏水層析和分子篩層析等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的突變蛋白。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該組合物含有藥學(xué)上有效量的本發(fā)明突變蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予動物或人時，它們不會產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明的突變蛋白相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低藥物組合物的效果?？勺鳛樗帉W(xué)上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。
本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進(jìn)行施用。
下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實(shí)施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明。
實(shí)施例1基因合成首先，提供一個具有大腸桿菌OmpA信號肽編碼序列且經(jīng)過密碼子偏好設(shè)計的突變型人干細(xì)胞生長因子編碼序列(如SEQ ID NO4所示)。在該序列中，第124位堿基由C變?yōu)镚，使得第42位(對應(yīng)于除去信號肽序列后的第23位)氨基酸由精氨酸變?yōu)楦拾彼?；?86位堿基由A變?yōu)镃，第387位堿基由C變?yōu)門，使得其編碼的第129位(對應(yīng)于除去信號肽序列后的第110位)氨基酸由酪氨酸變?yōu)榻z氨酸；第919位堿基由C變?yōu)镚，第921位堿基由G變?yōu)門，使得其編碼的第307位(對應(yīng)于除去信號肽序列后的第288位)氨基酸由脯氨酸變?yōu)楸彼?。將該基因結(jié)構(gòu)記作SCF/ompA。合成基因時在該結(jié)構(gòu)的5’端加上一個EcoRI切點(diǎn)，在3’-端加入一個HindIII切點(diǎn)。
根據(jù)上述SCF/ompA基因序列，按照常規(guī)引物設(shè)計的原則將上述序列及其互補(bǔ)鏈拆分成26個長度約為83～88b長度的寡核苷酸片段并委托上海生工公司合成。然后，利用PCR方法獲得各SCF/ompA基因片段，具體操作如下反應(yīng)體系在0.2毫升PCR管中加入以下各物質(zhì)。
組分 體積10×Pfu PCR緩沖液 5微升各寡片段(100毫微克/微升) (每種)1微升50×dNTP混合物1微升50×Pfu DNA聚合酶 1微升PCR級水 至40微升總體積50微升(2)反應(yīng)條件預(yù)變性94℃2分鐘；主循環(huán)95℃1分鐘，60℃40秒，72℃1分鐘，循環(huán)35次；后延伸72℃10分鐘。
(3)電泳觀察結(jié)果并膠回收hSCF/ompA全長基因片段。
把膠回收的基因片段按照常規(guī)方法克隆于質(zhì)粒pGEM-T Easy(Promega公司，Madison，WI)上并進(jìn)行基因測序。測序工作委托上?；倒具M(jìn)行。根據(jù)測序結(jié)果確定了一個序列完全正確的克隆，記作pSCF/ompA。
實(shí)施例2.表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例采用pUC18載體作為表達(dá)載體，該表達(dá)載體購自(Promega公司，圖1中顯示出了該載體的圖譜)。將上述完全正確的pSCF/ompA的DNA用EcoRI及HindIII酶切，在1％瓊脂糖電泳上分離，用PROMEGA公司的膠回收試劑盒回收長度大約1kb左右的片段。然后用MBI公司的連接試劑盒把SCF/ompA基因片段連接于原核表達(dá)載體pUC18載體的上，構(gòu)成pUC18-SCF/ompA表達(dá)載體。詳細(xì)操作過程如下1)用EcoRI及HindIII酶切表達(dá)質(zhì)粒pUC18。在微量離心管中加入以下各物質(zhì)
pUC18質(zhì)粒DNA3微克10×限制酶緩沖液3微升EcoRI和HindIII 15U1毫克/毫升乙酰化BSA 3微升無核酸酶的水至40微升37℃孵育4小時，以DNA標(biāo)記作為對照進(jìn)行電泳，膠回收酶切的質(zhì)粒pUC18，置-20℃保存待用。
2)用EcoRI及HindIII酶切攜帶目的基因的質(zhì)粒pGEM-T Easy，切下目的基因并膠回收。方法同上。
3)連接酶切表達(dá)質(zhì)粒pUC18及目的基因片段。在0.2毫升PCR管中加入以下各物10×連接酶緩沖液 2微升100mM DTT 2微升10mM ATP 1微升50毫微克/微升制得的pUC18載體 2微升T4連接酶(0.2-0.4Weise單位/微升)1微升制備的目的基因(0.2pmol)1微升無核酸酶的水 11微升總體積 20微升4℃連接過夜。
4)把連接構(gòu)建好的質(zhì)粒pUC18轉(zhuǎn)化入表達(dá)工程菌DH5a中。
5)用以下方法酶切鑒定轉(zhuǎn)化質(zhì)粒挑取氨芐青霉素培養(yǎng)皿上單個表達(dá)工程菌菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，用EcoRI及HindIII酶切鑒定，方法同前。酶切產(chǎn)物在1％瓊脂糖電泳上進(jìn)行鑒定，初步確定了11個克隆帶有目的插入序列。選取其中2個正確克隆進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果確認(rèn)1個克隆的插入序列是完全正確的，記作pUC18-SCF/ompA。
實(shí)施例3.誘導(dǎo)目的基因表達(dá)取正確克隆的菌液100微升分別接種到5毫升含氨芐青霉素(100微克/毫升)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，260rpm震蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)0.4～1.0，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1毫摩爾/升。培養(yǎng)3小時，從每種培養(yǎng)物中取出1毫升轉(zhuǎn)移到離心管中，離心，去上清；裂解菌體進(jìn)行SDS蛋白電泳，用考馬斯亮藍(lán)對SDS聚丙烯酰胺進(jìn)行染色，檢測目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，該菌株表達(dá)的目的產(chǎn)物占菌體可溶性蛋白的68％，比國外已經(jīng)發(fā)表的直接將天然基因表達(dá)的方法所獲得的表達(dá)量15％(Chen W，Di X，Li J，Song F，Chen S.cDNA cloning of human stem cell factor and itshigh level expression in E.coli，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，1997 Feb；19(1)29-34)高出至少4倍。這一高表達(dá)結(jié)果對于實(shí)現(xiàn)該基因的產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。
實(shí)施例4.目的蛋白的純化及其活性檢測按照上述方法在LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)該基因表達(dá)并經(jīng)過離子交換層析、疏水層析和分子篩層析后獲得了純度在95％以上的該重組蛋白。
用下述ELISA方法對上述菌株的表達(dá)量進(jìn)行研究。ELISA方法用MO-7E細(xì)胞株進(jìn)行。在含8％的小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時的MO-7E細(xì)胞500RPM離心收集細(xì)胞，用含有10％小牛血清的DEME培養(yǎng)基配制成5×104細(xì)胞/毫升的懸液。
取96孔板，每孔中加入100微升細(xì)胞懸液，100微升系列稀釋的SCF待測樣品(200毫微克/毫升)或者標(biāo)準(zhǔn)品(重組天然人SCF，購自Pharmacia)(200毫微克/毫升)，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。以不加SCF作為陰性對照。每處理3個重復(fù)孔。
取經(jīng)過上述處理的細(xì)胞0.1毫升，加入1/10體積濃度為5毫克/毫升的MTT溶液，37℃培養(yǎng)30分鐘后在酶標(biāo)儀上讀取570nm處的光吸收。以三個重復(fù)孔讀數(shù)的平均數(shù)作為計算和比較的依據(jù)。結(jié)果表明，經(jīng)過SCF處理的細(xì)胞比未經(jīng)處理的對照光吸收明顯提高，讀數(shù)比對照高36％～670％。待測樣品與陽性對照的比較結(jié)果顯示在下表1中。
表1 SCF活性測定結(jié)果

根據(jù)上述數(shù)據(jù)，用Excel作圖(見圖2)。
從表1和圖2可以看出，本發(fā)明的待測樣品的活性明顯高于天然結(jié)構(gòu)的SCF。天然結(jié)構(gòu)的ED50(即達(dá)到50％最大效果所需要的劑量)為10毫微克/毫升左右，而本發(fā)明的SCF的生物活性大幅提高，其ED50大約為1nm/毫升左右，二者大約相差一個數(shù)量級。
序列表<110>上海中信國健藥業(yè)有限公司<120>人干細(xì)胞生長因子突變蛋白及其制法和藥物組合物<130>020770<160>6<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>323<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Gln Ala Ala Trp Leu Leu Gly Ala Leu Val Val Pro Gln Leu Leu1 5 10 15Gly Phe Gly His Gly Ala Arg Gly Ala Glu Arg Glu Trp Glu Gly Gly20 25 30Trp Gly Gly Ala Gln Glu Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ala Leu Met Leu35 40 45Lys His Leu Gln Glu Ala Leu Gly Leu Pro Ala Gly Arg Gly Asp Glu50 55 60Asn Pro Ala Gly Thr Val Glu Gly Lys Glu Asp Trp Glu Met Glu Glu65 70 75 80Asp Gln Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Thr Pro Thr Pro Ser Ser85 90 95Gly Pro Ser Pro Ser Pro Thr Pro Glu Asp Ile Val Thr Tyr Ile Leu100 105 110Gly Arg Leu Ala Gly Leu Asp Ala Gly Leu His Gln Leu His Val Arg115 120 125Leu His Ala Leu Asp Thr Arg Val Val Glu Leu Thr Gln Gly Leu Arg130 135 140Gln Leu Arg Asn Ala Ala Gly Asp Thr Arg Asp Ala Val Gln Ala Leu145 150 155 160Gln Glu Ala Gln Gly Arg Ala Glu Arg Glu His Gly Arg Leu Glu Gly165 170 175Cys Leu Lys Gly Leu Arg Leu Gly His Lys Cys Phe Leu Leu Ser Arg180 185 190Asp Phe Glu Ala Gln Ala Ala Ala Gln Ala Arg Cys Thr Ala Arg Gly195 200 205Gly Ser Leu Ala Gln Pro Ala Asp Arg Gln Gln Met Glu Ala Leu Thr2l0 215 220Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Leu Ala Pro Tyr Asn Trp Pro Val Trp Leu225 230 235 240Gly Val His Asp Arg Arg Ala Glu Gly Leu Tyr Leu Phe Glu Asn Gly245 250 255Gln Arg Val Ser Phe Phe Ala Trp His Arg Ser Pro Arg Pro Glu Leu260 265 270Gly Ala Gln Pro Ser Ala Ser Pro His Pro Leu Ser Pro Asp Gln Pro275 280 285Asn Gly Gly Thr Leu Glu Asn Cys Val Ala Gln Ala Ser Asp Asp Gly290 295 300Ser Trp Trp Asp His Asp Cys Gln Arg Arg Leu Tyr Tyr Val Cys Glu305 310 315 320Phe Pro Phe<210>2<211>323<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Gln Ala Ala Trp Leu Leu Gly Ala Leu Val Val Pro Gln Leu Leu1 5 10 15Gly Phe Gly His Gly Ala Gly Gly Ala Glu Arg Glu Trp Glu Gly Gly20 25 30Trp Gly Gly Ala Gln Glu Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ala Leu Met Leu35 40 45Lys His Leu Gln Glu Ala Leu Gly Leu Pro Ala Gly Arg Gly Asp Glu50 55 60Asn Pro Ala Gly Thr Val Glu Gly Lys Glu Asp Trp Glu Met Glu Glu65 70 75 80Asp Gln Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Thr Pro Thr Pro Ser Ser85 90 95Gly Pro Ser Pro Ser Pro Thr Pro Glu Asp Ile Val Thr Ser Ile Leu100 105 110Gly Arg Leu Ala Gly Leu Asp Ala Gly Leu His Gln Leu His Val Arg115 120 125Leu His Ala Leu Asp Thr Arg Val Val Glu Leu Thr Gln Gly Leu Arg130 135 140Gln Leu Arg Asn Ala Ala Gly Asp Thr Arg Asp Ala Val Gln Ala Leu145 150 155 160Gln Glu Ala Gln Gly Arg Ala Glu Arg Glu His Gly Arg Leu Glu Gly165 170 175Cys Leu Lys Gly Leu Arg Leu Gly His Lys Cys Phe Leu Leu Ser Arg180 185 190Asp Phe Glu Ala Gln Ala Ala Ala Gln Ala Arg Cys Thr Ala Arg Gly195 200 205Gly Ser Leu Ala Gln Pro Ala Asp Arg Gln Gln Met Glu Ala Leu Thr210 215 220Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Leu Ala Pro Tyr Asn Trp Pro Val Trp Leu225 230 235 240Gly Val His Asp Arg Arg Ala Glu Gly Leu Tyr Leu Phe Glu Asn Gly245 250 255Gln Arg Val Ser Phe Phe Ala Trp His Arg Ser Pro Arg Pro Glu Leu260 265 270Gly Ala Gln Pro Ser Ala Ser Pro His Pro Leu Ser Pro Asp Gln Ala275 280 285Asn Gly Gly Thr Leu Glu Asn Cys Val Ala Gln Ala Ser Asp Asp Gly290 295 300Ser Trp Trp Asp His Asp Cys Gln Arg Arg Leu Tyr Tyr Val Cys Glu305 310 315 320Phe Pro Phe<210>3<211>969<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3atgcaggcag cctggctttt gggggctttg gtggtccccc agctcttggg ctttggccat 60ggggctcggg gagcagagag ggagtgggag ggaggctggg gaggtgccca ggaggaggag 120cgggagaggg aggccctgat gctgaagcat ctgcaggaag ccctaggact gcctgctggg 180aggggggatg agaatcctgc cggaactgtt gagggaaaag aggactggga gatggaggag 240gaccaggggg aggaagagga ggaggaagca acgccaaccc catcctccgg ccccagcccc 300tctcccaccc ctgaggacat cgtcacttac atcctgggcc gcctggccgg cctggacgca 360ggcctgcacc agctgcacgt ccgtctgcac gcgttggaca cccgcgtggt cgagctgacc 420caggggctgc ggcagctgcg gaacgcggca ggcgacaccc gcgatgccgt gcaagccctg 480caggaggcgc agggtcgcgc cgagcgcgag cacggccgct tggagggctg cctgaagggg 540ctgcgcctgg gccacaagtg cttcctgctc tcgcgcgact tcgaagctca ggcggcggcg 600caggcgcggt gcacggcgcg gggcgggagc ctggcgcagc cggcagaccg ccagcagatg 660gaggcgctca ctcggtacct gcgcgcggcg ctcgctccct acaactggcc cgtgtggctg 720ggcgtgcacg atcggcgcgc cgagggcctc tacctcttcg aaaacggcca gcgcgtgtcc 780ttcttcgcct ggcatcgctc accccgcccc gagctcggcg cccagcccag cgcctcgccg 840catccgctca gcccggacca gcccaacggt ggcacgctcg agaactgcgt ggcgcaggcc 900tctgacgacg gctcctggtg ggaccacgac tgccagcggc gtctctacta cgtctgcgag 960ttccccttc 969<210>4<211>1026<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>帶信號肽編碼序列<400>4aaaaaaaccg ctatcgctat cgctgttgct ctggctggtt tcgctaccgt tgctcaggct 60caggctgctt ggctgctggg tgctctggtt gttccgcagc tgctgggttt cggtcacggt 120gctggtggtg ctgaacgtga atgggaaggt ggttggggtg gtgctcagga agaagaacgt 180gaacgtgaag ctctgatgct gaaacacctg caggaagctc tgggtctgcc ggctggtcgt 240ggtgacgaaa acccggctgg taccgttgaa ggtaaagaag actgggaaat ggaagaagac 300cagggtgaag aagaagaaga agaagctacc ccgaccccgt cttctggtcc gtctccgtct 360ccgaccccgg aagacatcgt tacctctatc ctgggtcgtc tggctggtct ggacgctggt 420ctgcaccagc tgcacgttcg tctgcacgct ctggacaccc gtgttgttga actgacccag 480ggtctgcgtc agctgcgtaa cgctgctggt gacacccgtg acgctgttca ggctctgcag 540gaagctcagg gtcgtgctga acgtgaacac ggtcgtctgg aaggttgcct gaaaggtctg 600cgtctgggtc acaaatgctt cctgctgtct cgtgacttcg aagctcaggc tgctgctcag 660gctcgttgca ccgctcgtgg tggttctctg gctcagccgg ctgaccgtca gcagatggaa 720gctctgaccc gttacctgcg tgctgctctg gctccgtaca actggccggt ttggctgggt 780gttcacgacc gtcgtgctga aggtctgtac ctgttcgaaa acggtcagcg tgtttctttc 840ttcgcttggc accgttctcc gcgtccggaa ctgggtgctc agccgtctgc ttctccgcac 900ccgctgtctc cggaccaggc taacggtggt accctggaaa actgcgttgc tcaggcttct 960gacgacggtt cttggtggga ccacgactgc cagcgtcgtc tgtactacgt ttgcgaattc 1020ccgttc1026<210>5<211>60<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>5aaaaagacag ctatcgcgat tgcagtggca ctggctggtt tcgctaccgt agcgcaggcc 60<210>6<211>20<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>6Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr1 5 10 15Val Ala Gln Ala20
權(quán)利要求
1.一種分離的人干細(xì)胞生長因子突變蛋白，其特征在于，它含有Arg23Gly、Tyr110Ser和Pro288Ala突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變蛋白，其特征在于，所述突變蛋白具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列。
3.一種分離的DNA序列，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的人干細(xì)胞生長因子突變蛋白的編碼序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的DNA序列，其特征在于，它具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
5.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有編碼權(quán)利要求1所述的人干細(xì)胞生長因子突變蛋白的DNA序列以及與該DNA序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
6.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它被權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
8.一種藥物組合物，其特征在于，它含有藥學(xué)上有效量的權(quán)利要求1所述的人干細(xì)胞生長因子突變蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
9.一種制備權(quán)利要求1所述的人干細(xì)胞生長因子突變蛋白的方法，其特征在于，該方法包括a)提供一表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有編碼權(quán)利要求1所述的人干細(xì)胞生長因子突變蛋白的DNA序列以及與該DNA序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列；b)用步驟a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；c)在適合表達(dá)所述突變蛋白的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細(xì)胞；和d)分離純化獲得所表達(dá)出的突變蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離的人干細(xì)胞生長因子突變蛋白，該突變蛋白含有Arg23Gly、Tyr110Ser和Pro288Ala突變。該突變蛋白的生物活性和在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量有顯著提高。本發(fā)明還提供了編碼該突變蛋白的DNA分子、該突變蛋白的制備方法和含有該突變蛋白的藥物組合物。
文檔編號C12P21/02GK1445239SQ0211109
公開日2003年10月1日 申請日期2002年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月20日
發(fā)明者劉慶法, 李晶, 胡華榮, 胡輝 申請人:上海中信國健藥業(yè)有限公司