專利名稱：一種規(guī)?；囵B(yǎng)肝細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種規(guī)?；囵B(yǎng)肝細(xì)胞的方法，具體涉及利用一種新型的肝 細(xì)胞特異性大孔微載體進(jìn)行肝細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
生物人工肝于80年代后期開始逐漸發(fā)展起來，雖已經(jīng)歷20余年發(fā)展， 取得一定的進(jìn)展，但仍未能廣泛而有效地運用于臨床，成為完全替代肝臟移 植手術(shù)以治療各種急慢性肝功能衰竭的最佳方法，其中如何實現(xiàn)體外肝細(xì)胞 數(shù)量多、功能強的規(guī)模化培養(yǎng)是目前強烈限制生物人工肝發(fā)展的瓶頸問題。
肝細(xì)胞是錨定依賴性細(xì)胞，其功能的有效發(fā)揮必須依賴于對支架材料等 支持物的貼附。理想的肝組織工程支架除了應(yīng)具有無毒、良好的組織細(xì)胞相 容性與細(xì)胞粘附性能等基本要求外，具有足夠的細(xì)胞粘附表面積和利于氣體 和物質(zhì)交換的孔隙率亦尤為重要。支架材料的選擇是肝臟組織工程中的熱點 問題，目前常見的肝組織工程支架材料有殼聚糖、海藻酸鈉、聚乙烯樹酯、 聚氨酯泡沫等天然或合成的材料。而在眾多的體外肝細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)方法中， 而目前研究表明，多孔微載體作為支架的三維培養(yǎng)正是實現(xiàn)肝細(xì)胞規(guī)?；?養(yǎng)的一種有效方法，這種培養(yǎng)模式具有單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方法的 優(yōu)點。但在肝細(xì)胞培養(yǎng)中，現(xiàn)存的多孔微載體均不夠理想，因而尋求一種理 想的具有肝細(xì)胞特異性的多孔微載體對目前實現(xiàn)肝細(xì)胞體外規(guī)模化培養(yǎng)具有 重要意義。謂崎
本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種新型微載體， 具有與常規(guī)的實心支架材料相比具有更大的表面積/體積，且竇隙結(jié)構(gòu)與體內(nèi) 肝竇結(jié)構(gòu)高度相似，因而更有利于肝細(xì)胞在支架材料上的黏附、更有利于細(xì) 胞間的相互接觸及氧氣、營養(yǎng)成分的傳送和代謝產(chǎn)物的排出，從而進(jìn)一步提 高體外肝細(xì)胞的培養(yǎng)密度和肝細(xì)胞功能。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種體外規(guī)?；囵B(yǎng)肝細(xì)胞的方法，該方法 結(jié)合使用所述新型微載體和微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，以實現(xiàn)肝細(xì)胞功能強、密 度高的規(guī)?；囵B(yǎng)。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一個方面提供一種大孔微載體，其對肝細(xì)胞
具有高度的親和性，該大孔微載體的粒度為200-500|Lim，其是由絲素蛋白和 半乳糖基化殼聚糖在交聯(lián)劑的作用下制得的。
在本發(fā)明的實施反式中，可通過下述方法制備所述大孔微載體，該方法
包括
(a) 將絲素蛋白溶液與半乳糖基化殼聚糖溶液按比例混合，使得產(chǎn)生終 濃度為4-7 w/W的絲素-半乳糖基化殼聚糖混合溶液；
(b) 將乳化劑分散進(jìn)入所述絲素-半乳糖基化殼聚糖混合溶液中，得到 白色乳液，并向該白色乳液中緩慢加入交聯(lián)劑，充分?jǐn)嚢枋顾嘟宦?lián)固化；
(c) 將步驟(b)中的白色乳液加入攪拌狀態(tài)的PH為9-10的極性溶劑 中，并繼續(xù)攪拌40-60分鐘，過濾得到互不粘連的微球；
(d) 固化所述微球并除去表面的油相，篩濾得到200-500^im的微球；
(e) 除去微球中的殘留的交聯(lián)劑，并冷凍干燥，得到所述大孔微載體。 優(yōu)選地，所述乳化劑為石蠟和/或司班80。所述交聯(lián)劑優(yōu)選為戊二醛。所述極性溶劑優(yōu)選為異丙醇和/或丙酮。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，在所述步驟(e)中的冷凍干燥之前還包 括用高濃度蔗糖溶液浸泡所述微球的步驟。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，在所述步驟(e)之后還包括消毒步驟。 所述消毒步驟優(yōu)選為以鈷60-Y射線輻照。
本發(fā)明的另一方面提供一種體外大規(guī)模培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法，該方法包括:
(c) 提供所述大孔微載體；
(d) 將所述大孔微載體用于微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)中。 在本發(fā)明的一個實施方式中，在步驟(b)之前還包括用0. lmol/L、 pH
為7. 0的無鈣鎂磷酸鎂緩沖液(PBS)浸泡大孔微載體過夜并用含血清培養(yǎng)基 浸泡至少10個小時的步驟。
在本發(fā)明的實施方式中，所述微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)使用濃縮靜止接種法 接種細(xì)胞。優(yōu)選地，所述濃縮靜止接種法中的細(xì)胞接種量為2X10Vml lX 107ml。優(yōu)選地，所述濃縮靜止接種法中起始培養(yǎng)基量為培養(yǎng)瓶容積的40% 90%。優(yōu)選地，所述濃縮靜止接種法中使用的靜止時間為12h 24h。優(yōu)選地， 所述濃縮靜止接種法使用的初始旋轉(zhuǎn)速度為7. 6 9rpm。
在優(yōu)選的實施方式中，所述濃縮靜止接種法中使用的培養(yǎng)基的血清濃度 為10% 15%。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為DMEN或PRMI 1640;優(yōu)選地，所述培養(yǎng) 基含有濃度為20 mmol/L 50 ramol/L的HEPES。
本發(fā)明的優(yōu)點在于利用一種新型的具有肝細(xì)胞特異性的絲素-半乳糖基 化殼聚糖大孔微載體在模擬微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)條件下進(jìn)行肝細(xì)胞培養(yǎng)，建立了 一種簡單的、可靠的體外肝細(xì)胞高密度、高分化規(guī)模化培養(yǎng)方法，采用該方 法1)可高密度培養(yǎng)肝細(xì)胞，絲素-半乳糖基化殼聚糖大孔微載體具有高度類似于體內(nèi)肝血竇樣的竇隙結(jié)構(gòu)，不僅具有特異性肝細(xì)胞吸附的作用，為肝細(xì) 胞生長提供廣大的生長空間，還可實現(xiàn)有效的肝細(xì)胞與培養(yǎng)基間營養(yǎng)、氧氣
和代謝產(chǎn)物的有效流通，實現(xiàn)體外高密度培養(yǎng)， 一般可達(dá)107ml; 2)培養(yǎng)肝 細(xì)胞功能強，在微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)下持續(xù)的模擬微重力環(huán)境有利于肝細(xì)胞增值 分化，有利于細(xì)胞與細(xì)胞間接觸，形成三維結(jié)構(gòu)樣組織，進(jìn)一步增強體外培 養(yǎng)肝細(xì)胞功能；3)對肝細(xì)胞損傷小，微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)采用膜式氧和氣體交換， 無氣泡與渦流產(chǎn)生，產(chǎn)生的剪切力較小；4)細(xì)胞接種效率高，肝細(xì)胞是高耗 氧量細(xì)胞，特別是在培養(yǎng)起始貼壁期，需氧量最大，且對的剪切力都非常地 敏感；5)通過濃縮接種期細(xì)胞與微載體懸液，不僅提高了細(xì)胞與微載體的相 對濃度，增加了細(xì)胞與微載體間的接觸機會，還在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶內(nèi)產(chǎn)生了氣液 平面，縮短了細(xì)胞與氣液平面的距離，并通過扭開閥門和瓶蓋，可與外界(即 孵箱)進(jìn)行有效的氣體交換。因而，該方法更有利于肝細(xì)胞在支架材料上的 黏附、更有利于細(xì)胞間的相互接觸及氧氣、營養(yǎng)成分的傳送和代謝產(chǎn)物的排 出，從而進(jìn)一步提高體外肝細(xì)胞的培養(yǎng)密度和肝細(xì)胞功能。


圖1是本發(fā)明的大孔微載體在倒置顯微鏡下的圖片；
圖2是本發(fā)明的大孔微載體在電子顯微鏡下的圖片；
圖3a是利用本發(fā)明的絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體靜止培養(yǎng)的 CL-1細(xì)胞(第六天)在電子顯微鏡下的圖片；
圖3b是利用本發(fā)明的絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體微重力培養(yǎng)的 CL-1細(xì)胞(第六天)在電子顯微鏡下的圖片；
圖4是在靜止和微重力下絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體培養(yǎng)CL-1細(xì)胞的上清尿素濃度；
圖5a是利用實心微載體(cytodex)微重力培養(yǎng)的CL-1細(xì)胞(第六天) 在電子顯微鏡下的圖片；
圖5b是利用本發(fā)明的大孔微載體(絲素/半乳糖基化殼聚糖)微重力培 養(yǎng)的CL-l細(xì)胞(第六天)在電子顯微鏡下的圖片；
圖6是在利用圖5a和圖5b中的載體進(jìn)行微重力培養(yǎng)的CL-1細(xì)胞上清尿 素濃度的比較；
圖7a是利用多孔微載體(cytodpore)微重力培養(yǎng)的CL-1細(xì)胞(第六天) 在電子顯微鏡下的圖片；
圖7b是利用本發(fā)明的大孔微載體(絲素/半乳糖基化殼聚糖)微重力培 養(yǎng)的CL-1細(xì)胞(第六天)在電子顯微鏡下的圖片；
圖8是利用圖7a和圖7b中的載體進(jìn)行微重力培養(yǎng)的CL-1細(xì)胞上清尿素 濃度的比較。
具體實施例方式
為了更好地理解本發(fā)明的方法，下面將通過實施例和實驗證據(jù)進(jìn)一步闡
述本發(fā)明及其優(yōu)勢。在詳細(xì)描述以下實施例和實驗之前，首先需要定義和澄 清一些術(shù)語。
絲素蛋白是一種無生理活性的天然結(jié)構(gòu)性蛋白，主要由三種簡單的氨基 酸甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，它們在蛋白總量中大概占85%。目前研 究表明絲素蛋白不僅具有良好的生物相容性、無毒、無刺激性，還具有促進(jìn) 細(xì)胞吸附和增殖的特性，因而在生物醫(yī)用領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。而將 其用于細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)，或?qū)σ恍┥锔叻肿舆M(jìn)行修飾，改善它們的生物性能，使其適用于組織工程，更是近年來絲素蛋白研究的熱點。
殼聚糖是近年來在生物醫(yī)藥、組織工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用的一種天然生 物高分子，不僅具有生物功能性、生物相容性、低毒性及幾乎無過敏性等特 性而且還具有高化學(xué)反應(yīng)活性，易于被一些化學(xué)試劑修飾，可通過各種方法 對其進(jìn)行性質(zhì)改良，而半乳糖基是肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體的特異性
配體，具有誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架材料上的黏附性能。在EDC 和NHS的活化作用下，將半乳糖基引入到殼聚糖的結(jié)構(gòu)中制備半乳糖基化殼 聚糖，對其材料表面進(jìn)行改性，并將其與絲素蛋白進(jìn)行復(fù)合制備形成絲素/半 乳糖基化殼聚糖大孔微載體，不僅可為體外肝細(xì)胞培養(yǎng)提供較大三維生長空 間還可顯著增強肝細(xì)胞的功能和提高細(xì)胞活力，是一種理想的具有肝細(xì)胞特 異性新型多孔微載體。
生物反應(yīng)器是生物人工肝裝置及對肝功能衰竭治療效果最有影響的關(guān)鍵 部分。理論上，生物反應(yīng)器應(yīng)最大限度地模仿正常肝臟的組織結(jié)構(gòu)，為培養(yǎng)肝 細(xì)胞提供類似于體內(nèi)的生存及代謝環(huán)境。因此，理想的生物反應(yīng)器應(yīng)具備以下 功能細(xì)胞密度達(dá)l Xl(^個細(xì)胞/ml水平；反應(yīng)裝置能根據(jù)需要任意增容， 細(xì)胞培養(yǎng)量可達(dá)數(shù)升；連續(xù)灌注培養(yǎng)實現(xiàn)有效的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及代謝產(chǎn)物 雙向物質(zhì)傳輸；可進(jìn)行自動化在線細(xì)胞狀態(tài)、培養(yǎng)液PH值、氧濃度等方面檢 測和調(diào)節(jié)功能，以便于醫(yī)護(hù)人員的監(jiān)督和操作；肝細(xì)胞代謝功能至少達(dá)單層 培養(yǎng)的水平，并至少保持2周以上；便于運輸和裝配?，F(xiàn)在常用的生物反應(yīng) 器有以下幾類中空纖維生物反應(yīng)器、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)反應(yīng)器、攪拌懸浮培養(yǎng)反應(yīng) 器、空氣升液培養(yǎng)反應(yīng)器和微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)反應(yīng)器等。其中中空纖維生物反 應(yīng)器的應(yīng)用最為廣泛的，其優(yōu)點是異種蛋白可以隔離，同時防止人體內(nèi)針對 異種細(xì)胞抗原的預(yù)存抗體對裝載細(xì)胞的殺傷作用，因而比較適合異種細(xì)胞類(如豬肝細(xì)胞)生物反應(yīng)器。但這類生物反應(yīng)器存在以下問題(1)容積有 限，細(xì)胞裝載量小；(2)培養(yǎng)液與肝細(xì)胞交換面積有限，不利于肝細(xì)胞的功 能維持和擴增；(3)半透膜的側(cè)孔易被細(xì)胞團堵塞，影響交換效率；(4)因 為中空纖維不能耐受深低溫，不適合大規(guī)模凍存。其它類型的反應(yīng)器如轉(zhuǎn)瓶 培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)等由于剪切力較大等缺點目前亦無法實現(xiàn)高效均一的細(xì)胞種 植，氧氣營養(yǎng)物質(zhì)及細(xì)胞代謝產(chǎn)物的運輸，達(dá)到高密度、大容量地規(guī)模化培 養(yǎng)細(xì)胞，及細(xì)胞功能的長期維持。而最初由美國航空航天局設(shè)計并應(yīng)用于微 重力生命科學(xué)領(lǐng)域的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)在目前的眾多組織工程生物反應(yīng) 器中，經(jīng)過近二十幾年的相關(guān)研究表明其較其它組織工程反應(yīng)器具有持續(xù)模 擬微重力環(huán)境有利于細(xì)胞增值分化，有利于細(xì)胞與細(xì)胞間接觸，形成三維結(jié) 構(gòu)樣組織；膜式氧和氣體交換，無氣泡與渦流產(chǎn)生，低剪切力等對細(xì)胞機械 損傷小等優(yōu)點，目前已成功廣泛運用于兔角膜細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、 胚胎干細(xì)胞、皮層神經(jīng)元細(xì)胞、脂肪組織等多種組織工程領(lǐng)域中，是一種具 有較廣應(yīng)用前景的生物反應(yīng)器。
本發(fā)明一方面提供一種新型的大孔微載體，其可以用于體外肝細(xì)胞規(guī)模 化培養(yǎng)。本發(fā)明的另一方面提供一種利用該大孔微載體進(jìn)行體外肝細(xì)胞規(guī)模 化培養(yǎng)的方法。實施例中使用的絲素蛋白和半乳糖基化殼聚糖分別可從市場 上購買得到，或者可通過下述方法制備而得。所使用的各種試劑、材料和儀 器都可從市場上購買得到。本文中所使用的縮寫、名稱具有本領(lǐng)域技術(shù)人員 所知的意義。
大孔微載體的制備及其應(yīng)用
1.大孔微載體的制備
1)絲素蛋白的制備將生蠶絲在5g/L的碳酸鈉溶液中煮沸1小時，然后用大量去離子水或蒸餾水清洗以去除絲膠蛋白，60-70'C下烘干，獲得絲素 蛋白。將適量絲素蛋白在80士-2。C下溶解在氯化鈣/水/乙醇(摩爾比1:8:2) 三元溶液中，在室溫條件下去離子水或蒸餾水透析3天，去除溶液中的鹽和乙 醇，過濾去除不溶的雜質(zhì)，制備出絲素蛋白的水溶液。將絲素蛋白水溶液在 50士2'C下低速攪拌，蒸發(fā)部分水分，獲得濃度約7-10w/v呢的絲素蛋白溶液， 備用；
2) 半乳糖基化殼聚糖(GC)的制備稱取2.2g殼聚糖，溶于30-40ml 的1.0%-2.5%的醋酸水溶液中，再加適量TEMED/HC1的緩沖溶液(pH4. 7)將殼 聚糖溶液稀釋至4 w/v %，再分別加入0. 14g NHS、 0. 6 g EDC和2. 2 g乳糖 酸(LA)，在室溫下攪拌反應(yīng)72 h后，蒸餾水透析3-4天，即得到半乳糖基 化殼聚糖(GC)溶液，蒸發(fā)部分水分濃縮備用。
3) 將l)中的絲素蛋白、2)中的半乳糖基化殼聚糖按4: 1、 7: 3、 6:
4、 5: 5、 5.5: 4.5等不同的比例混合均勻，絲素-半乳糖基化殼聚糖混合溶 液終濃度為4-7 w/v%;
4) 取一定量的液體石蠟加入燒杯中，然后加入3-5%的乳化劑(如司班 80)，混合均勻后以一定速度恒速攪拌，按5: 1、 4: l等油水比加入3)中絲 素-半乳糖基化殼聚糖混合溶液，在室溫下繼續(xù)恒速攪拌30-45min，分散均勻 得到白色乳液，向上述乳液中緩慢加入一定量的交聯(lián)劑如戊二醛溶液等，繼 續(xù)攪拌2-3h，使水相交聯(lián)固化；
5) 取一定體積的極性溶劑如異丙醇、丙酮等，再往其中加入適量去離子 水或蒸餾水將其稀釋，再滴加NaOH稀溶液，調(diào)節(jié)PH至9-10;
6) 將5)中溶液以200-400轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢瑁瑢?)中的白色乳液緩慢加入其 中，繼續(xù)攪拌40-60分鐘；過濾得到互不粘連的微球，將微球置于4r冰箱中4-8小時，使微球充分固化；
7) 將微球用5)中稀釋后的極性溶劑、石油醚、去離子水洗滌，去除表 面的油相；然后篩分出200-500pm的微球；
8) 將篩分后的微球，用戊二醛中和劑甘氨酸溶液浸泡2-4小時，除去未 反應(yīng)的戊二醛，再用大量蒸餾水洗滌；
9) 將8)中洗滌干凈后的微球用高濃度蔗糖溶液浸泡數(shù)分鐘，然后倒去 多余的蔗糖溶液；將上述浸泡過蔗糖溶液的微球置于冰箱中冷凍36-72小時， 然后冷凍干燥，得到大孔微載體。
2、大孔微載體的應(yīng)用
微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)下絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體規(guī)模化肝細(xì)胞培 養(yǎng)方法，具體步驟如下
1) 絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體預(yù)處理將所需數(shù)量的絲素/半乳 糖基化殼聚糖大孔微載體置于50ml塑料離心管中，用0. lmol/L、 pH為7. 0 無鈣鎂磷酸鎂緩沖液(PBS)浸泡過夜后，吸去PBS，再用PBS洗漆3次，經(jīng) 12rC高壓滅菌30分鐘后，吸出PBS，用培養(yǎng)基洗滌2次，最后用含血清培養(yǎng) 基浸泡10小時以上，備用；
2) 濃縮靜止接種法接種細(xì)胞消化收集平板培養(yǎng)的肝細(xì)胞懸液，按所需 接種密度將細(xì)胞懸液放入上述微載體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出無菌 高橫截面微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含絲素/半 乳糖基化殼聚糖大孔微載體的肝細(xì)胞懸液經(jīng)注射空緩緩注入微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 瓶中，繼續(xù)添加含血清培養(yǎng)基至60%體積，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋并將其 稍稍扭松，靜止橫放于二氧化碳孵箱中，培養(yǎng)條件為溫度37°C， 二氧化碳 濃度5%。每8小時取出輕輕搖晃1分鐘。24小時后取出微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶置于紫外消毒后的超凈臺中，用75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將 兩支無菌10 ml注射器(其中一支裝有含血清的培養(yǎng)液，另一支不裝培養(yǎng)液) 分別連接在兩個取樣孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養(yǎng)液緩慢注入 容器內(nèi)，容器內(nèi)氣泡從另一支空的注射器中排出(培養(yǎng)過程中始終保持容器內(nèi) 無氣泡，以避免形成渦流)，將整個容器充滿后再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁 3次，最后將其移入二氧化碳培養(yǎng)箱中，安裝在培養(yǎng)裝置上，并根據(jù)所接種微 載體和細(xì)胞的量調(diào)整容器的轉(zhuǎn)速，以微載體在旋轉(zhuǎn)過程中不貼附在容器的內(nèi) 外壁上為宜。本試驗中設(shè)定旋轉(zhuǎn)初速度為7. 6 9rpm，
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并非對本發(fā)明的限制； 實施例一、靜止/微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)下絲素/半乳糖基化殼聚糖培養(yǎng)人肝細(xì) 胞株CL-1細(xì)胞；
一、 完全培養(yǎng)基的配置每100ml DMEN (高糖型)培養(yǎng)基添加15ml胎 牛血清、3. 5mmolHEPES、青霉素10000U、鏈霉素10000U
二、 絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體預(yù)處理將0.1g絲素/半乳糖基 化殼聚糖大孔微載體置于50ml塑料離心管中，用0. lmol/L、 PH為7. 0無鈣 鎂磷酸鎂緩沖液(PBS)浸泡過夜后，吸去PBS，再用PBS洗滌3次，經(jīng)121°C 高壓滅菌30分鐘后，吸出PBS，用培養(yǎng)基洗滌2次，最后用1)配置的完全 培養(yǎng)基浸泡10小時以上，備用；
三、 靜止/微重力旋轉(zhuǎn)條件下絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體培養(yǎng)人 肝細(xì)胞(CL-1)
1、微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組(濃縮靜止接種法接種細(xì)胞)消化收集平板培養(yǎng) 的人肝細(xì)胞株(CL-1)懸液，總量為2X107的CL-1細(xì)胞懸液放入上述微載 體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體的 肝細(xì)胞懸液經(jīng)注射空緩緩注入微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)添加含l)配置的完
全培養(yǎng)基至30ml，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋并將其稍稍扭松，靜止橫放于 二氧化碳孵箱中，培養(yǎng)條件為溫度37°C， 二氧化碳濃度5%。每8小時取 出輕輕搖晃1分鐘。24小時后取出微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶置于紫外消毒后的超凈 臺中，用75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無菌10 ml注射器 (其中一支裝有l(wèi))配置的完全培養(yǎng)基，另一支不裝培養(yǎng)基)分別連接在兩個取 樣孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養(yǎng)液緩慢注入容器內(nèi)，容器內(nèi)氣 泡從另一支空的注射器中排出(培養(yǎng)過程中始終保持容器內(nèi)無氣泡，以避免 形成渦流)，將整個容器充滿后再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后將其 移入二氧化碳培養(yǎng)箱中，安裝在培養(yǎng)裝置上，并根據(jù)所接種微載體和細(xì)胞的 量調(diào)整容器的轉(zhuǎn)速，以微載體在旋轉(zhuǎn)過程中不貼附在容器的內(nèi)外壁上為宜。 本試驗中設(shè)定旋轉(zhuǎn)初速度為7. 6rpm。每天換液量30ml，并調(diào)整轉(zhuǎn)速1次。
2、靜止培養(yǎng)組(濃縮靜止接種法接種細(xì)胞)消化收集平板培養(yǎng)的人肝 細(xì)胞株(CL-1)懸液，總量為2X107的CL-1細(xì)胞懸液放入上述微載體中，輕 輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋 和兩個孔閥門，用注射器將含絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體的肝細(xì)胞懸 液經(jīng)注射空緩緩注入微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)添加含1)配置的完全培養(yǎng)基 至30ml，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋并將其稍稍扭松，靜止橫放于二氧化碳 孵箱中，培養(yǎng)條件為溫度37°C， 二氧化碳濃度5%。每8小時取出輕輕搖 晃1分鐘。24小時后取出微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶置于紫外消毒后的超凈臺中，用 75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無菌10 ml注射器(其中一 支裝有1)配置的完全培養(yǎng)基，另一支不裝培養(yǎng)基)分別連接在兩個取樣孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養(yǎng)液緩慢注入容器內(nèi)，容器內(nèi)氣泡從另一 支空的注射器中排出(培養(yǎng)過程中始終保持容器內(nèi)無氣泡，以避免形成渦
流)，將整個容器充滿后再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后將其移入二 氧化碳培養(yǎng)箱中，每天換液量30ml。
四、 生物功能檢測于每天換液時留取上清作樣品，2 000 r/min離心 10 min，，在Beckman全自動生化系統(tǒng)檢測上清尿素含量；
五、 掃描電鏡留取樣品，PBS清洗三次，加2%戊二醛固定0. 5小時， 1%鋨酸固定0.5小時，接著用酒精梯度脫水，再用乙酸異戊脂置換4小時以 上，臨界干燥器干燥后真空噴濺鉑金離子，日本S450掃描電子顯微鏡觀察細(xì) 胞生長情況并攝影。
實驗結(jié)果本發(fā)明選用微重力絲素/半乳糖苷化殼聚糖大孔微載體為體外 肝細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)模式，較常規(guī)的靜止三維培養(yǎng)更有利于肝細(xì)胞增殖分化及 細(xì)胞-細(xì)胞間接觸，形成致密三維結(jié)構(gòu)樣組織，實現(xiàn)體外肝細(xì)胞大規(guī)模高密度 培養(yǎng)；可進(jìn)一步增強肝細(xì)胞的功能(見圖3a、圖3b和圖4)。
實施例二、微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)下微載體培養(yǎng)人肝細(xì)胞株CL-1細(xì)胞(絲素/ 半乳糖基化殼聚糖大孔微載體SF/GC、實心微載體cytodex 3);
一、 完全培養(yǎng)基的配置每100ml DMEN (高糖型)培養(yǎng)基添加15ml胎 牛血清、3. 5mmolHEPES、青霉素10000U、鏈霉素10000U
二、 微載體預(yù)處理
1、絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體預(yù)處理將0.2g絲素/半乳糖基 化殼聚糖大孔微載體置于50ml塑料離心管中，用o. lmol/L、 PH為7. 0無轉(zhuǎn) 鎂磷酸鎂緩沖液(PBS)浸泡過夜后，吸去PBS，再用PBS洗滌3次，經(jīng)121°C高壓滅菌30分鐘后，吸出PBS，用培養(yǎng)基洗滌2次，最后用1)配置的完全 培養(yǎng)基浸泡10小時以上，備用；
2、實心微載體(cytodex3)預(yù)處理將0. 25g實心微載體(cytodex3) 置于50ml塑料離心管中，用o. lmol/L、 PH為7. 0無鈣鎂磷酸鎂緩沖液(PBS) 浸泡過夜后，吸去PBS，再用PBS洗滌3次，經(jīng)12rC高壓滅菌30分鐘后， 吸出PBS,用培養(yǎng)基洗滌2次，最后用1)配置的完全培養(yǎng)基浸泡10小時以 上，備用；
三、微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)下微載體培養(yǎng)人肝細(xì)胞株CL-1細(xì)胞 1、微重力絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體培養(yǎng)人肝細(xì)胞(CL-1):消 化收集平板培養(yǎng)的人肝細(xì)胞株(CL-1)懸液，總量為2X107的CL-1細(xì)胞懸 液放入上述微載體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重 力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含絲素/半乳糖基化殼聚 糖大孔微載體的肝細(xì)胞懸液經(jīng)注射空緩緩注入微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)添 加含1)配置的完全培養(yǎng)基至30ml，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋并將其稍稍 扭松，靜止橫放于二氧化碳孵箱中，培養(yǎng)條件為溫度37°C， 二氧化碳濃度 5%。每8小時取出輕輕搖晃1分鐘。24小時后取出微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶置于紫 外消毒后的超凈臺中，用75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無 菌10 ml注射器(其中一支裝有1)配置的完全培養(yǎng)基，另一支不裝培養(yǎng)基) 分別連接在兩個取樣孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養(yǎng)液緩慢注入 容器內(nèi)，容器內(nèi)氣泡從另一支空的注射器中排出(培養(yǎng)過程中始終保持容器內(nèi) 無氣泡，以避免形成渦流)，將整個容器充滿后再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁 3次，最后將其移入二氧化碳培養(yǎng)箱中，安裝在培養(yǎng)裝置上，并根據(jù)所接種微 載體和細(xì)胞的量調(diào)整容器的轉(zhuǎn)速，以微載體在旋轉(zhuǎn)過程中不貼附在容器的內(nèi)外壁上為宜。本試驗中設(shè)定旋轉(zhuǎn)初速度為7.6rpm。每天換液量30ml，并調(diào)整 轉(zhuǎn)速1次。
2、微重力實心微載體(cytodex3)培養(yǎng)人肝細(xì)胞(CL-1):消化收集平 板培養(yǎng)的人肝細(xì)胞株(CL-1)懸液，總量為2X107的CL-1細(xì)胞懸液放入上 述微載體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重力旋轉(zhuǎn)培 養(yǎng)瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含cytodex 3微載體的肝細(xì)胞懸 液經(jīng)注射空緩緩注入微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)添加含1)配置的完全培養(yǎng)基 至30ml，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋并將其稍稍扭松，靜止橫放于二氧化碳 孵箱中，培養(yǎng)條件為溫度37°C， 二氧化碳濃度5%。每8小時取出輕輕搖 晃1分鐘。24小時后取出微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶置于紫外消毒后的超凈臺中，用 75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無菌10 ml注射器(其中一 支裝有1)配置的完全培養(yǎng)基，另一支不裝培養(yǎng)基)分別連接在兩個取樣孔上， 打開取樣孔閥門，將注射器中的培養(yǎng)液緩慢注入容器內(nèi)，容器內(nèi)氣泡從另一 支空的注射器中排出(培養(yǎng)過程中始終保持容器內(nèi)無氣泡，以避免形成渦 流)，將整個容器充滿后再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后將其移入二 氧化碳培養(yǎng)箱中，安裝在培養(yǎng)裝置上，并根據(jù)所接種微載體和細(xì)胞的量調(diào)整 容器的轉(zhuǎn)速，以微載體在旋轉(zhuǎn)過程中不貼附在容器的內(nèi)外壁上為宜。本試驗 中設(shè)定旋轉(zhuǎn)初速度為7. 6rpm。每天換液量30ml，并調(diào)整轉(zhuǎn)速1次。
四、 生物功能檢測于每天換液時留取上清作樣品，2 000 r/min離心 10 min，，在Beckman全自動生化系統(tǒng)檢測上清尿素含量；
五、 掃描電鏡留取樣品，PBS清洗三次，加2%戊二醛固定0. 5小時， 1%鋨酸固定0.5小時，接著用酒精梯度脫水，再用乙酸異戊脂置換4小時以 上，臨界干燥器干燥后真空噴濺鉑金離子，日本S450掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況并攝影。
實驗結(jié)果本發(fā)明以絲素/半乳糖苷化殼聚糖大孔微載體為體外肝細(xì)胞規(guī)
?；囵B(yǎng)支架材料，較常規(guī)的實心支架材料(cytodex 3)具有更大的表面積 /體積，高度的竇隙結(jié)構(gòu)與體內(nèi)肝竇結(jié)構(gòu)相似，更有利于細(xì)胞間的相互接觸及 氧氣、營養(yǎng)成分的傳送和代謝產(chǎn)物的排出，從而進(jìn)一步提高體外肝細(xì)胞培養(yǎng) 密度及其功能(見圖5a、圖5b和圖6)。
實施例三、微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)下微載體培養(yǎng)人肝細(xì)胞株CL-1細(xì)胞(絲素/ 半乳糖基化殼聚糖大孔微載體SF/GC、多孔微載體cytopore);
一、 完全培養(yǎng)基的配置每100ml DMEN (高糖型)培養(yǎng)基添加15ml胎 牛血清、3. 5mmolHEPES、青霉素10000U、鏈霉素10000U
二、 微載體預(yù)處理
1、 絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體預(yù)處理將0.2g絲素/半乳糖基
化殼聚糖大孔微載體置于50ml塑料離心管中，用o. lmol/L、 PH為7. 0無鈣 鎂磷酸鎂緩沖液(PBS)浸泡過夜后，吸去PBS，再用PBS洗滌3次，經(jīng)121°C 高壓滅菌30分鐘后，吸出PBS，用培養(yǎng)基洗滌2次，最后用1)配置的完全 培養(yǎng)基浸泡10小時以上，備用；
2、 多孔微載體(cytopore)預(yù)處理將0. 2g多孔微載體(cytopore) 置于50ml塑料離心管中，用o. lmol/L、 PH為7. 0無鈣鎂磷酸鎂緩沖液(PBS) 浸泡過夜后，吸去PBS，再用PBS洗滌3次，經(jīng)12rC高壓滅菌30分鐘后， 吸出PBS,用培養(yǎng)基洗滌2次，最后用1)配置的完全培養(yǎng)基浸泡10小時以 上，備用；
三、 微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)下微載體培養(yǎng)人肝細(xì)胞株CL-1細(xì)胞1、 微重力絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體培養(yǎng)人肝細(xì)胞(CL-1):消 化收集平板培養(yǎng)的人肝細(xì)胞株(CL-1)懸液，總量為2X107的CL-1細(xì)胞懸 液放入上述微載體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重 力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含絲素/半乳糖基化殼聚 糖大孔微載體的肝細(xì)胞懸液經(jīng)注射空緩緩注入微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)添 加含1)配置的完全培養(yǎng)基至30ml，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋并將其稍稍 扭松，靜止橫放于二氧化碳孵箱中，培養(yǎng)條件為溫度37°C， 二氧化碳濃度 5%。每8小時取出輕輕搖晃1分鐘。24小時后取出微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶置于紫 外消毒后的超凈臺中，用75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無 菌10 ml注射器(其中一支裝有1)配置的完全培養(yǎng)基，另一支不裝培養(yǎng)基) 分別連接在兩個取樣孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養(yǎng)液緩慢注入 容器內(nèi)，容器內(nèi)氣泡從另一支空的注射器中排出(培養(yǎng)過程中始終保持容器內(nèi) 無氣泡，以避免形成渦流)，將整個容器充滿后再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁 3次，最后將其移入二氧化碳培養(yǎng)箱中，安裝在培養(yǎng)裝置上，并根據(jù)所接種微 載體和細(xì)胞的量調(diào)整容器的轉(zhuǎn)速，以微載體在旋轉(zhuǎn)過程中不貼附在容器的內(nèi) 外壁上為宜。本試驗中設(shè)定旋轉(zhuǎn)初速度為7.6rpm。每天換液量30ml，并調(diào)整 轉(zhuǎn)速1次。
2、 微重力多孔微載體(cytopore)培養(yǎng)人肝細(xì)胞(CL-1):消化收集平 板培養(yǎng)的人肝細(xì)胞株(CL-1)懸液，總量為2X107的CL-1細(xì)胞懸液放入上 述微載體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重力旋轉(zhuǎn)培 養(yǎng)瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含多孔微載體(cytopore)的肝 細(xì)胞懸液經(jīng)注射空緩緩注入微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)添加含1)配置的完全 培養(yǎng)基至30ml,取出兩個注射器，蓋上瓶蓋并將其稍稍扭松，靜止橫放于二氧化碳孵箱中，培養(yǎng)條件為溫度37°C， 二氧化碳濃度5%。每8小時取出 輕輕搖晃1分鐘。24小時后取出微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶置于紫外消毒后的超凈臺 中，用75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無菌10 ml注射器(其 中一支裝有1)配置的完全培養(yǎng)基，另一支不裝培養(yǎng)基)分別連接在兩個取樣 孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養(yǎng)液緩慢注入容器內(nèi)，容器內(nèi)氣泡 從另一支空的注射器中排出(培養(yǎng)過程中始終保持容器內(nèi)無氣泡，以避免形 成渦流)，將整個容器充滿后再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后將其移 入二氧化碳培養(yǎng)箱中，安裝在培養(yǎng)裝置上，并根據(jù)所接種微載體和細(xì)胞的量 調(diào)整容器的轉(zhuǎn)速，以微載體在旋轉(zhuǎn)過程中不貼附在容器的內(nèi)外壁上為宜。本 試驗中設(shè)定旋轉(zhuǎn)初速度為7. 6rpm。每天換液量30ml，并調(diào)整轉(zhuǎn)速1次。
四、 生物功能檢測于每天換液時留取上清作樣品，2 000 r/min離心 10 min，，在Beckman全自動生化系統(tǒng)檢測上清尿素含量；
五、 掃描電鏡留取樣品，PBS清洗三次，加2%戊二醛固定0.5小時， 1%鋨酸固定0.5小時，接著用酒精梯度脫水，再用乙酸異戊脂置換4小時以 上，臨界干燥器干燥后真空噴濺鉑金離子，日本S450掃描電子顯微鏡觀察細(xì) 胞生長情況并攝影。
實驗結(jié)果半乳糖基是肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體的特異性配體， 本發(fā)明所使用絲素/半乳糖苷化殼聚糖大孔微載體在EDC和NHS的活化作用 下進(jìn)行半乳糖基化改性，較常規(guī)的多孔微載體(cytopore)更有利于肝細(xì)胞 在支架材料上的黏附，可進(jìn)一步促進(jìn)體外肝細(xì)胞的培養(yǎng)密度及其肝細(xì)胞功能 (見圖7a、圖7b和圖8)。
雖然本發(fā)明已經(jīng)參考具體的實施方式進(jìn)行描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員通 過閱讀上述描述后，將可以對本發(fā)明做出顯而易見的修改和修飾，而不違背本發(fā)明的意圖和本質(zhì)。本發(fā)明有意將這些修改和修飾包括在權(quán)利要求的范圍 內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種大孔微載體，其粒度為200-500μm，由絲素蛋白和半乳糖基化殼聚糖在交聯(lián)劑的作用下制得。
2. —種制備權(quán)利要求1的大孔微載體的方法，其包括(a) 將絲素蛋白溶液與半乳糖基化殼聚糖溶液按比例混合，使得產(chǎn)生終 濃度為4-7 w/W的絲素-半乳糖基化殼聚糖混合溶液；(b) 將乳化劑分散進(jìn)入所述絲素-半乳糖基化殼聚糖混合溶液中，得到 白色乳液，并向該白色乳液中緩慢加入交聯(lián)劑，充分?jǐn)嚢枋顾嘟宦?lián)固化；(c) 將步驟(b)中的白色乳液加入攪拌狀態(tài)的pH為9-10的極性溶劑 中，并繼續(xù)攪拌40-60分鐘，過濾得到互不粘連的微球；(d) 固化所述微球并除去表面的油相，篩濾得到200-500jum的微球；(e) 除去微球中的殘留的交聯(lián)劑，并冷凍干燥，得到所述大孔微載體。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述乳化劑為石蠟和/或司 班80。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑為戊二醛。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述極性溶劑為異丙醇和/ 或丙酮。
6. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟(e)中的冷凍 干燥之前還包括用高濃度蔗糖溶液浸泡所述微球的步驟。
7. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟(e)之后還包 括消毒步驟。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述消毒步驟優(yōu)選為以鈷 60-Y射線輻照。
9. 一種體外大規(guī)模培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法，該方法包括(a) 提供所述大孔微載體；(b) 將所述大孔微載體用于微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)中。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，在步驟(b)之前還包括用 0. lmol/L、 pH為7. 0的無鈣鎂磷酸鎂緩沖液(PBS)浸泡大孔微載體過夜并用 含血清培養(yǎng)基浸泡至少10個小時的步驟。
11. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng) 使用濃縮靜止接種法接種細(xì)胞，所述濃縮靜止接種法中的細(xì)胞接種量為2X 105/ml lX106/ml。
12. 如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于，所述濃縮靜止接種法中起 始培養(yǎng)基量為培養(yǎng)瓶容積的40% 90%。
13. 如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于，所述濃縮靜止接種法中使 用的靜止時間為12h 24h。
14. 如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于，所述濃縮靜止接種法使用的初始旋轉(zhuǎn)速度為7. 6 9 rpm。
15. 如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于，所述濃縮靜止接種法中使 用的培養(yǎng)基中含10% 15%的血清。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為DMEN或PRMI 1640。
17. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有濃度為20 ,1/L 50咖ol/L的HEPES。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型的具有肝細(xì)胞特異性的絲素-半乳糖基化殼聚糖大孔微載體及其制備方法，以及利用它在微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)條件下進(jìn)行肝細(xì)胞培養(yǎng)的方法。本發(fā)明提供的新型微載體與常規(guī)的實心支架材料相比具有更大的表面積/體積，且竇隙結(jié)構(gòu)與體內(nèi)肝竇結(jié)構(gòu)高度相似，因而更有利于肝細(xì)胞在支架材料上的黏附、更有利于細(xì)胞間的相互接觸及氧氣、營養(yǎng)成分的傳送和代謝產(chǎn)物的排出，從而進(jìn)一步提高體外肝細(xì)胞的培養(yǎng)密度和肝細(xì)胞功能。
文檔編號C08L89/00GK101624473SQ200910041770
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者勇 劉, 周煥城, 志 張, 蔣澤生, 毅 高, 龔獨輝 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院