一種原代肝細胞體外復(fù)極性的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及肝臟組織工程學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種原代肝細胞體外復(fù)極性的培 養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝組織工程學(xué)在藥物篩選、體外支持治療、以及肝組織生理與疾病模擬模型等領(lǐng) 域中具有重要的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用價值。具有近似生理功能表型的原代成熟肝細胞是肝 組織工程的重要細胞成分。如何獲得具有最近似體內(nèi)功能的工程化肝組織是該領(lǐng)域研究的 核心目標和成功的關(guān)鍵技術(shù)之一。
[0003] 成熟肝細胞在功能和結(jié)構(gòu)上具有與其他上皮細胞不同的復(fù)雜極性特征，該極性是 肝細胞發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)。經(jīng)酶解離開體內(nèi)組織內(nèi)環(huán)境后，成熟肝細胞失去極性，原有功 能表型發(fā)生迅速減退。在一定的體外條件下，肝細胞恢復(fù)并維持其極性，保持較高的功能水 平，并維持較長時間，此現(xiàn)象稱為肝細胞復(fù)極性。肝細胞復(fù)極性包括以下特征：重新出現(xiàn)典 型肝細胞間極性超微結(jié)構(gòu)和功能性膽小管排泌。一般認為，新分離的肝細胞只有恢復(fù)細胞 極性后方具備正常的細胞功能。因此，通過各種技術(shù)和方法處理以恢復(fù)細胞極性，是肝臟組 織工程學(xué)的重要觀察指標和目標。
[0004] 二維和三維培養(yǎng)的原代成熟肝細胞，在適合的技術(shù)細節(jié)條件下，都有可能發(fā)生復(fù) 極性現(xiàn)象。由于更接近生理特征，促進三維肝細胞復(fù)極性是目前肝組織工程技術(shù)研究的著 力點。如肝細胞微球體，作為一種獲得較多研究的三維肝組織體，其形成體現(xiàn)了典型的體外 肝細胞自組織過程：新鮮分離的原代肝細胞有自發(fā)聚集的趨勢，它們會在聚集體的基礎(chǔ)上， 逐漸緊湊并重新建立極性結(jié)構(gòu)。目前大多研究通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分，提高氧氣供應(yīng)，改良培 養(yǎng)基質(zhì)的化學(xué)或物理結(jié)構(gòu)以及改進種植方式等手段，使體外肝細胞復(fù)極性。
[0005]RyoSudo等應(yīng)用鼠尾膠原三明治構(gòu)型培養(yǎng)大鼠原代肝細胞，細胞培養(yǎng)液由基本 培養(yǎng)基（DMEM)，20mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸，25mM碳酸氫鈉，30mg/LL-脯氨酸，10 7M地塞 米松，10mM煙酰胺，ImM的抗壞血酸-2-磷酸，10ng/mL表皮細胞生長因子和青霉素鏈霉素 雙抗組成，在肝細胞種植后第72h第一次檢測到功能性膽小管對熒光素二乙酸（FDA)的 排泌功能（SudoR.，MitakaT.，IkedaM.，andTanishitaK. (2005)Reconstructionof 3Dstacked-upstructuresbyratsmallhepatocytesonmicroporousmembranes. TheFASEBJournal19 (12) : 1695-7.)。MarkA.Talamini等用同法培養(yǎng)大鼠原代肝 細胞，在肝細胞種植后48h檢測到膜抗原蛋白的非對稱性極性分布（Talamini，M. A. ,KappusB. ,andHubbardA. (1997)Repolarizationofhepatocytesinculture. Ifepat〇l〇gy25(l): 167-72.)。這是已有研究報道中肝細胞（結(jié)構(gòu)和功能學(xué)）復(fù)極性的形成 出現(xiàn)最早的時間（48h-72h)。
[0006] 上述現(xiàn)有技術(shù)存在以下主要缺點：
[0007] 1.雖然使原代肝細胞在體外條件下發(fā)生了復(fù)極性的行為，但不是生理性恢復(fù)。例 如，二維單層培養(yǎng)原代肝細胞基本沒有形成肝板樣結(jié)構(gòu)，形成的囊泡樣膽小管片段接種48h 后消失，肝細胞膜區(qū)域蛋白特異性分布在培養(yǎng)后1周后基本消失。
[0008] 2.三明治構(gòu)型培養(yǎng)的原代肝細胞提高了生理性原代肝細胞復(fù)極性的能力，肝細 胞形成肝板樣結(jié)構(gòu)，伴膽小管網(wǎng)絡(luò)形成，肝細胞膜區(qū)域蛋白呈特異性分布，但提高程度不顯 著。例如，三明治培養(yǎng)原代肝細胞在72h時白蛋白合成量為30yg/106細胞/天，尿素合成 量為120yg/106細胞/天。
[0009] 3.復(fù)極性出現(xiàn)的時間晚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種原代肝細胞體外復(fù)極性的培養(yǎng)方法。
[0011] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0012] -種原代肝細胞體外復(fù)極性的培養(yǎng)方法，將原代肝細胞上樣于微孔培養(yǎng)板， 50g-250g離心l-10min，去除微孔培養(yǎng)板表面多余液體，加入肝細胞表型無血清培養(yǎng)液進 行培養(yǎng)。
[0013] 優(yōu)選地，原代肝細胞上樣于微孔培養(yǎng)板后，靜置5-10min，50g-250g離心l-10min， 去除微孔培養(yǎng)板表面多余的細胞懸液，加入肝細胞表型無血清培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。
[0014] 更優(yōu)選地，離心條件為100g_250g離心2_5min。
[0015] 更進一步優(yōu)選地，離心條件為100g離心2min。
[0016] 優(yōu)選地，原代肝細胞的密度為4-6X106個/mL，按照300yL/孔的上樣量上樣于微 孔培養(yǎng)板。
[0017] 優(yōu)選地，原代肝細胞的培養(yǎng)條件為37°C、5%C02，每48h換液一次。
[0018] 優(yōu)選地，肝細胞的培養(yǎng)時間為12h以上。
[0019] 更優(yōu)選地，肝細胞的培養(yǎng)時間為12h至120h。
[0020] 更進一步優(yōu)選地，肝細胞的培養(yǎng)時間為12h至48h。
[0021] 更進一步優(yōu)選地，肝細胞的培養(yǎng)時間為12h至24h。
[0022] 優(yōu)選地，肝細胞表型無血清培養(yǎng)液包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基IfepatoZYMESFM(Invitrogen， LifeTechnologies，USA)、2mML_ 谷氛醜胺、60iiMHEPES(4_ 輕乙基哌嘆乙橫酸）、50iiM 地塞米松和1X青霉素/鏈霉素雙抗。
[0023] 發(fā)明人通過對現(xiàn)有技術(shù)的分析，認為現(xiàn)有技術(shù)之所以存在多種缺點的原因可能 有：肝細胞不能快速形成高密度培養(yǎng)；肝細胞間排列松散，沒有形成緊密接觸。因此，發(fā)明 人對此進行了改進，形成了本發(fā)明。本發(fā)明原代肝細胞體外復(fù)極性的培養(yǎng)方法利用力學(xué)緊 湊種植方式將原代肝細胞種植于微孔培養(yǎng)板中后進行復(fù)極性培養(yǎng)。力學(xué)緊湊種植是指利用 機械力種植細胞，使細胞緊密排列，實現(xiàn)細胞的高密度種植的種植方式。所施加的機械力可 以使細胞緊湊，因此該機械力稱為緊湊力。本發(fā)明采用離心力將原代肝細胞種植于微孔培 養(yǎng)板中靜態(tài)培養(yǎng)，稱為微孔尚心靜態(tài)培養(yǎng)法。
[0024] 本發(fā)明微孔離心靜態(tài)培養(yǎng)法以力學(xué)緊湊種植方式種植原代肝細胞，加快了體外肝 細胞在三維環(huán)境下的復(fù)極性速度，可為肝組織工程提供具有近似生理功能表型的原代成熟 肝細胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明微孔離心靜態(tài)培養(yǎng)法具有如下有益效果：
[0025] (1)本發(fā)明中利用力學(xué)緊湊種植原代肝細胞，可以使肝細胞間排列緊湊，形成緊密 接觸，肝細胞可以快速形成高密度培養(yǎng)。
[0026] (2)本發(fā)明中利用力學(xué)緊湊種植原代肝細胞，顯著提高了肝細胞群的體外細 胞功能，原代肝細胞在培養(yǎng)72h，白蛋白合成量為150yg/106細胞/天，尿素合成量為 750yg/106細胞/天，遠遠高于現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)原代肝細胞的合成水平。
[0027] (3)本發(fā)明對原代肝細胞進行模擬體內(nèi)肝組織力學(xué)特點的力學(xué)緊湊方式進行種植 和三維培養(yǎng)，本發(fā)明中肝細胞在結(jié)構(gòu)和功能學(xué)上的復(fù)極性均提前至種植后第12h形成。
【附圖說明】
[0028] 圖1為效果實施例1中普通顯微鏡觀察圖和激光共聚焦熒光顯微圖。圖lA(i)和 圖1B⑴分別為對照組和處理組的普通顯微鏡觀察圖，圖lA(ii)和圖lB(ii)分別為對照 組和緊湊力組的熒光標記后的激光共聚焦熒光顯微圖。
[0029] 圖2為效果實施例1中肝細胞種植密度柱狀圖。
[0030] 圖3為效果實施例2中肝細胞形狀圖。圖3A為對照組細胞形狀圖，圖3B為處理 組細胞形狀圖，圖3C為種植在具有典型肝細胞正弦曲線的肝細胞切片上的肝細胞形狀圖。
[0031] 圖4為效果實施例2中肝細胞接觸距離圖。圖4A為對照組接觸距離圖，圖4B為 處理組接觸距離圖。
[0032] 圖5為效果實施例2中肝細胞接觸面積柱狀圖。
[0033] 圖6為效果實施例3中膽小管排泌FDA情況圖。圖中箭頭指示的是FDA集中分泌 的區(qū)域，即形成膽小管的區(qū)域。
[0034] 圖7為效果實施例4中肝細胞在掃描電鏡下的超微結(jié)構(gòu)圖。
[0035] 圖8為效果實施例5中白蛋白合成量柱狀圖。
[0036] 圖9為效果實施例5中尿素合成量柱狀圖。
[0037] 圖10為效果實施例6中肝細胞蛋白的極性排布圖。
[0038] 圖11為效果實施例6中肝細胞pan-cadherin/F