體外培養(yǎng)肝樣細(xì)胞的方法及采用該方法培養(yǎng)的優(yōu)化后肝樣細(xì)胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種體外培養(yǎng)肝樣細(xì)胞的方法以及采用該方 法培養(yǎng)的優(yōu)化后肝樣細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝臟是決定藥物代謝和毒性作用的主要器官，也是多種病毒性肝炎、肝臟腫瘤疾 病的靶器官。目前，在制藥工業(yè)界，原代肝細(xì)胞（包括人和動物原代肝細(xì)胞）因其藥物代謝 酶和藥物轉(zhuǎn)運體的表達(dá)和新藥研發(fā)以及臨床現(xiàn)象有比較好的相關(guān)性，被稱為藥物動力學(xué)研 究的黃金標(biāo)準(zhǔn)，同時也是肝移植和生物反應(yīng)器的寶貴資源（Sinz,Wallaceetal. 2008)。目 前原代肝細(xì)胞的國際市場保守估計在20億美元。但是，原代肝細(xì)胞不能傳代，多種蛋白質(zhì) 表達(dá)下降，加上價格昂貴和供體依賴性，限制了它在科研和臨床上的進(jìn)一步使用。因此，無 論是科研還是制藥工業(yè)實踐中迫切需要一種功能與肝細(xì)胞類似、可穩(wěn)定傳代、可靠且易得 的功能性肝細(xì)胞。
[0003] 2010年的FDA白皮書首次指出，藥物轉(zhuǎn)運體在新藥研發(fā)中具有和藥物代謝酶同等 重要的地位，并且規(guī)定了 7種必須考察的藥物轉(zhuǎn)運體，其中有5種藥物轉(zhuǎn)運體在肝臟的代 謝、解毒中起到重大作用（InternationalTransporter,Giacominietal. 2010)。這一內(nèi) 容在2012年FDA藥物相互作用指南中被確定了下來。
[0004] 但是，目前可以獲得的類似肝臟細(xì)胞的細(xì)胞株有各種缺點，尤其是沒有具備合適 的藥物轉(zhuǎn)運體表達(dá)，無法用于肝臟相關(guān)的藥物肝膽分布和代謝、毒性研究。例如，最通用的 肝臟來源細(xì)胞株H印G2上面幾乎沒有重要的藥物轉(zhuǎn)運體表達(dá)，更不用說膽管類似結(jié)構(gòu)了。 目前公認(rèn)最接近原代肝細(xì)胞的細(xì)胞株H印aRG，雖然藥物代謝酶CYP3A4表達(dá)較為豐富并且 可以誘導(dǎo)，但是其藥物轉(zhuǎn)運體表達(dá)僅僅有Pgp得到承認(rèn)，而且通過免疫組化試驗顯示，不能 達(dá)到極化表達(dá)（Andersson,Kanebrattetal. 2012)(參見附圖 4)。
[0005] 近年來，許多體外試驗證實可將胚胎干細(xì)胞或者誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞分化為肝樣 細(xì)胞，但是，這些技術(shù)受供體來源（來自于胚胎的ES細(xì)胞）和誘導(dǎo)產(chǎn)生過程高成本和復(fù)雜 性（來源于人類上皮細(xì)胞的iPS細(xì)胞，需要進(jìn)行轉(zhuǎn)分化三部曲）所限，無法提供合適的肝 樣細(xì)胞用于藥物研發(fā)（Jensen，Hyllneretal. 2009)。雖然有多篇文獻(xiàn)報道這些細(xì)胞具備 了一定的藥物代謝酶表達(dá)，但是對于藥物轉(zhuǎn)運體的表達(dá)鮮有報道，而且無法令人滿意。目前 國際上最新的直接轉(zhuǎn)分化技術(shù)，可以將小鼠成纖維細(xì)胞分化成鼠源誘導(dǎo)肝樣細(xì)胞（induced hepatocyte-likecell，iHep)。雖然iHep在形態(tài)、功能和應(yīng)用上和現(xiàn)有細(xì)胞系相比有很多 優(yōu)點，但是，iHep在轉(zhuǎn)運體的表達(dá)方面并沒有顯著提高（圖1)。在藥物轉(zhuǎn)運體和膽酸合成分 泌方面并不成熟，沒有形成藥物轉(zhuǎn)運體的極化表達(dá)和可以檢測的膽酸合成分泌能力。事實 上，膽酸的合成分泌和藥物的解毒能力是成熟肝細(xì)胞的重要標(biāo)志。實驗數(shù)據(jù)顯示，在現(xiàn)有的 iHep細(xì)胞中，藥物轉(zhuǎn)運體及膽酸相關(guān)的合成酶和轉(zhuǎn)運體的表達(dá)量與其在小鼠原代肝細(xì)胞中 的表達(dá)量相比極低，僅為5-10%(圖1)。類似地，采用直接轉(zhuǎn)分化技術(shù)也可以由人源非肝臟 細(xì)胞獲得人源誘導(dǎo)肝樣細(xì)胞（humaninducedhepatocyte-likecell,HiHep)，但該細(xì)胞也 同樣具有上述缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 技術(shù)問題
[0007] 2011年，Nature上發(fā)表論文，在世界上首次提出可以利用表觀遺傳學(xué)手段，直接 將小鼠的鼠尾纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成肝樣細(xì)胞（HuangPY，HeZY，JiSY，SunHW，XiangD，et al. (2011)Inductionoffunctionalhepatocyte-likecellsfrommousefibroblasts bydefinedfactors.Nature475:386_U142.)。相對于原代肝細(xì)胞，通過上述直接轉(zhuǎn)分化技 術(shù)產(chǎn)生的肝樣細(xì)胞的來源不受供體資源的限制，理論上可以在保持遺傳性狀的基礎(chǔ)上無限 傳代。它們不僅具有肝臟細(xì)胞的多項生理特征和功能，而且具有清楚的遺傳背景和一定的 藥物代謝酶表達(dá)。因此具有取代原代肝細(xì)胞，成為用于藥物研發(fā)和臨床實踐的新細(xì)胞模型 的潛力。
[0008] 但是，該細(xì)胞株僅具備初步的藥物轉(zhuǎn)運體和膽酸代謝酶表達(dá)，而各種相關(guān)蛋白質(zhì) 并沒有在細(xì)胞膜上極化分布。FDA2012年發(fā)布的藥物相互作用指南上明確指出，只有藥物轉(zhuǎn) 運體在肝細(xì)胞膜上極化表達(dá)，細(xì)胞才可能具備膽酸鹽極化攝取、分泌能力，這是評價肝樣細(xì) 胞的重要特性。
[0009] 因此，在現(xiàn)有技術(shù)中，例如，無論是將胚胎干細(xì)胞或者誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞分化為肝 樣細(xì)胞還是利用例如直接轉(zhuǎn)分化技術(shù)獲得的肝樣細(xì)胞均沒有形成藥物轉(zhuǎn)運體的極化表達(dá) 和/或可以檢測的膽酸合成分泌能力。在本申請中，將采用現(xiàn)有技術(shù)（包括直接轉(zhuǎn)分化技 術(shù)和胚胎干細(xì)胞或多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)）將動物源非肝臟細(xì)胞或人源非肝臟細(xì)胞 獲得的肝樣細(xì)胞定義為傳統(tǒng)肝樣細(xì)胞，其沒有形成藥物轉(zhuǎn)運體的極化表達(dá)和/或可以檢測 的膽酸合成分泌能力，在功能和形態(tài)上與原代肝細(xì)胞具有顯著的差別。
[0010] 為提高現(xiàn)有技術(shù)(包括直接轉(zhuǎn)分化技術(shù)和胚胎干細(xì)胞或多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化技 術(shù)）產(chǎn)生的傳統(tǒng)肝樣細(xì)胞中膽酸合成酶、膽酸轉(zhuǎn)運體和藥物轉(zhuǎn)運體的表達(dá)和功能，本申請的 發(fā)明人通過多次試驗，產(chǎn)生了適用于現(xiàn)有技術(shù)(包括直接轉(zhuǎn)分化技術(shù)和胚胎干細(xì)胞或多功 能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)）產(chǎn)生的傳統(tǒng)肝樣細(xì)胞的特殊體外培養(yǎng)方法。該方法有效刺激由現(xiàn) 有技術(shù)(包括直接轉(zhuǎn)分化技術(shù)和胚胎干細(xì)胞或多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)）產(chǎn)生的傳統(tǒng)肝 樣細(xì)胞的進(jìn)一步分化、膽酸合成酶表達(dá)和相關(guān)藥物轉(zhuǎn)運體極化分布，從而使傳統(tǒng)肝樣細(xì)胞 具備和原代肝細(xì)胞類似的膽汁攝取、分泌能力，藥物轉(zhuǎn)運體極化表達(dá)，從而可以用于相關(guān)科 研工作。
[0011] 因此，本發(fā)明的一個目的為提供一種對采用現(xiàn)有技術(shù)獲得的傳統(tǒng)肝樣細(xì)胞進(jìn)行體 外培養(yǎng)的方法。具體地，所述方法能夠進(jìn)一步促進(jìn)傳統(tǒng)肝樣細(xì)胞的生長和分化并提高藥物 轉(zhuǎn)運體、膽酸轉(zhuǎn)運體和/或膽酸合成酶的表達(dá)水平和極化表達(dá)。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的為提供一種優(yōu)化后肝樣細(xì)胞，所述優(yōu)化后肝樣細(xì)胞內(nèi)膽酸合 成酶、膽酸轉(zhuǎn)運體和藥物轉(zhuǎn)運體的表達(dá)大幅度提高，并且功能接近原代肝細(xì)胞。
[0013] 技術(shù)方案
[0014] 本發(fā)明提供一種傳統(tǒng)肝樣細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，其包括：
[0015] 步驟1、采用三明治（sandwich)細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)傳統(tǒng)肝樣細(xì)胞，S卩：將傳統(tǒng)肝樣細(xì) 胞接種在含鼠尾膠原I的24孔板上，加上普通培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞24-48小時后，鋪上基質(zhì) 膠，形成三明治培養(yǎng)結(jié)構(gòu)，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時；
[0016] 步驟2、撤除原有普通培養(yǎng)基，換用誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，獲得優(yōu)化后肝樣 細(xì)胞；
[0017] 其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上補加誘導(dǎo)劑，即普通培養(yǎng)基撤除 1%的胎牛血清，并且補加cAMP(環(huán)腺苷酸）、3MC(3-甲基膽蒽）、PB(苯巴比妥）、TCA(牛黃膽 酸）和VPA(丙戊酸)中的至少一種核受體激動劑，上述各核受體激動劑在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中 的濃度范圍分別為cAMPl-10iiM、3MC1-10iiM、PB10-200iiM、TCA5-50iiM和VPA0. 2-4iiM;
[0018] 優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有選自cAMP、3MC、PB和TCA中的兩種或三種，進(jìn)一步 優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有濃度為2yM的cAMP和濃度為50yM的PB，或者含有濃度為 2iiM的cAMP、濃度為2iiM的3MC和濃度為50iiM的PB，或者含有濃度為2iiM的cAMP、濃 度為2iiM的3MC、濃度為5