專利名稱：一種肝細胞的體外組織化培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種動物細胞的體外培養(yǎng)方法，特別地，涉及一種肝細胞的體外組織化培養(yǎng)方法。
背景技術：
肝臟是人體中的重要器官，具有合成、代謝、解毒等功能。用體外培養(yǎng)的原代動物肝細胞模型來模擬肝臟在體內的生物學功能是目前的重要研究方向之一。現(xiàn)有的肝細胞體外培養(yǎng)方式大都采用二維的單層培養(yǎng)，肝細胞需要在培養(yǎng)容器的表面上才能貼壁生長，細胞呈島狀，而且蛋白尿素以及各種藥物代謝功能往往在數(shù)天內顯著下降甚至完全喪失，存活期通常在一周左右。因此單層培養(yǎng)的細胞表型、功能與體內肝細胞有很大差異，還無法代替體內肝細胞完成肝功能。為了更好地研究實現(xiàn)肝細胞在體內的重要功能，目前已發(fā)展出若干三維培養(yǎng)技術，如通過膠原凝膠包埋或者形成肝細胞聚球體，使肝細胞在體外培養(yǎng)過程中采用與體內生理狀態(tài)更接近的方式進行培養(yǎng)。其中肝細胞聚球體培養(yǎng)是目前研究最受關注的培養(yǎng)方法。
目前常見的形成肝細胞聚球體方式有轉瓶培養(yǎng)、培養(yǎng)基中添加高分子物質、培養(yǎng)容器表面高分子涂層等。其中大多聚球體形成緩慢，形成率也較低。若將形成的聚球體應用到生物人工肝反應器上還需經(jīng)過聚球體收集、包埋、固定等步驟，實際應用過程比較復雜。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種能使肝細胞在體外快速、高效地形成聚球體，且無需經(jīng)過聚球體的收集步驟就能直接應用于生物人工肝反應器的組織化培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)一種肝細胞的體外組織化培養(yǎng)方法，其特征在于，包括(1)培養(yǎng)基添加膠原，把I型膠原溶液加入含胎牛血清的Williams’E培養(yǎng)基，混勻。
(2)調節(jié)溶液pH值及滲透壓。
(3)與原代肝細胞混勻，將肝細胞接種于混合溶液，混勻。
(4)注入聚砜中空纖維絲內腔培養(yǎng)。
本發(fā)明具有以下技術效果通過簡單的操作，使肝細胞在體外迅速高效地形成聚球體，可以長期保持其生物學活性及特異性功能；同時通過控制培養(yǎng)基中的膠原濃度，可以得到不同的組織化形態(tài)聚球體；并且此種形成聚球體方法可以直接在中空纖維式生物人工肝反應器內原位進行，無需額外的聚球體轉移等操作步驟，大大簡化了該反應器的操作步驟，方便了聚球體在生物人工肝反應器中的應用。


圖1是實施例1的大鼠肝細胞聚球體的掃描電鏡圖，其中，a為400倍掃描電鏡圖片，b為10000倍掃描電鏡圖片；圖2是不同培養(yǎng)時間大鼠肝細胞聚球體光學顯微鏡照片，其中，a為肝細胞在0小時的形態(tài)，b、c、d分別代表實施例1中24小時，48小時以及144小時大鼠肝細胞的形態(tài)；e、f分別代表實施例2、3中144小時大鼠肝細胞的形態(tài)；g、h、i分別代表實施例4中24小時、48小時以及144小時大鼠肝細胞的形態(tài)。j為不添加膠原的對照組肝細胞在144小時的形態(tài)。
圖3、圖4、圖5、圖6分別是實施例1、2、3、4的尿素合成隨時間變化曲線，其中，“□”代表聚球體組，“◇”代表平板單層培養(yǎng)組，“△”代表不添加膠原的對照組，每組均重復三次，圖中誤差線代表三組之間的標準誤差。
具體實施例方式
下面結合附圖詳細說明本發(fā)明具體實施例。
實施例1取0.07mg/mL的I型鼠尾膠原溶液(鼠尾膠原制備方法參考文獻G.Michalopoulos，H.C.Pitot.，Primary Culture of Parenchymal Liver Cells on CollagenMembranes，Exp Cell Res，1975，94，p.70)60μL加入4mL預冷至4℃的含5％胎牛血清的Williams’E培養(yǎng)基，混勻后調節(jié)溶液pH值至7.4±0.2，滲透壓至260-320mOsm/kg，溶液中膠原濃度為1μg/mL。將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞按106cells/mL密度接種于此混合溶液，輕輕混勻，使細胞均勻分布在溶液中后，注入截留分子量為100kDa的聚砜中空纖維絲內，封閉中空絲兩端后將16根長度為4cm的中空絲放入直徑為5cm的塑料培養(yǎng)皿內，加入5ml含5％胎牛血清的Williams’E培養(yǎng)基，放入37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每48小時更換培養(yǎng)基。
作為空白對照組，用同樣的方法將同批大鼠肝細胞包埋入中空纖維絲內，但內腔培養(yǎng)基中不添加任何膠原。培養(yǎng)方法同上。
同時，再將同批大鼠肝細胞按0.16×106cells/mL接入5mL含5％胎牛血清的Williams’E培養(yǎng)基，在鋪有鼠尾膠原的平皿上貼壁培養(yǎng)，每48小時更換培養(yǎng)基。
各重復三組，測定肝功能指標尿素合成量，觀察細胞形態(tài)。
結果如附圖1、2(b，c，d，j)及附圖3所示；圖中，箭頭所指為正在形成或已經(jīng)形成的大鼠肝細胞聚球體；另外，各圖放大倍數(shù)均相同。
由附圖1(a)可見，由大鼠肝細胞所形成的聚球體結構完整，細胞間結合緊密，由附圖1(b)可見，在較高放大倍數(shù)下可見聚球體表面密布微膽管結構，并有一些直徑2μm左右的小孔；由附圖2(b，c，d)可見，肝細胞在24小時內就開始聚集，48小時已基本形成聚球體，聚球體表面黏附較多單個死細胞，144小時后聚球體形態(tài)良好，顯微鏡下觀察表面光滑，鮮有單個死細胞吸附；由附圖2(j)可見，不添加膠原的對照組肝細胞在144小時后未形成任何聚球體，肝細胞有一定程度的聚集，但細胞間結合不緊密，可以明顯分辨出單個細胞，細胞活率也較低，死細胞大多已開始胞裂，樣品中可見大量細胞碎片；由附圖3可見聚球體形式培養(yǎng)的肝細胞尿素合成功能要優(yōu)于單層貼壁培養(yǎng)，不添加膠原的對照組尿素合成量最低，說明以此種聚球體形式培養(yǎng)的肝細胞保持了較高的生物學功能。
實施例2取7mg/mL的I型鼠尾膠原溶液60μL加入4mL預冷至4℃的含5％胎牛血清的Williams’E培養(yǎng)基，混勻后調節(jié)溶液pH值及滲透壓，溶液中膠原濃度為0.1mg/mL。將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞按106cells/mL密度接種于此混合溶液，輕輕混勻，使細胞均勻分布在溶液中后，注入截留分子量為1000kDa的聚砜中空纖維絲內，封閉中空絲兩端后將16×4cm中空絲放入5cm塑料培養(yǎng)皿內，培養(yǎng)條件及對照組同具體實例1。
各重復三組，測定尿素合成量，觀察細胞形態(tài)。
聚球體144小時時的形態(tài)見附圖2-h，其形成過程及聚球體形態(tài)與具體實施例1基本相同。尿素合成量隨培養(yǎng)時間變化曲線如附圖4所示，同樣優(yōu)于單層貼壁培養(yǎng)以及空白對照組。
實施例3取7mg/L的I型牛跟腱膠原(購自Worthington Biochemical Co.)60μL加入4mL預冷至4℃的含5％胎牛血清的Williams’E培養(yǎng)基，混勻后調節(jié)溶液pH值及滲透壓，溶液中膠原濃度為0.1mg/mL。將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞按106cells/mL密度接種于此混合溶液，輕輕混勻，使細胞均勻分布在溶液中后，注入截留分子量為600kDa的聚砜中空纖維絲內，封閉中空絲兩端后將16×4cm中空絲放入5cm塑料培養(yǎng)皿內，培養(yǎng)條件及對照組同具體實例1。
各重復三組，測定尿素合成量，觀察細胞形態(tài)。
聚球體144小時時的形態(tài)見附圖2-f，雖然使用了不同來源的膠原，但是聚球體的形成過程及最終形態(tài)與具體實施例1非常類似?？梢娔z原的來源對于聚球體的形成并無重要影響。其尿素合成量隨培養(yǎng)時間變化曲線如附圖5所示，亦同樣優(yōu)于單層貼壁培養(yǎng)以及空白對照組。
實施例4取7mg/mL的I型鼠尾膠原溶液650μL加入4mL預冷至4℃的含5％胎牛血清的Williams’E培養(yǎng)基，混勻后調節(jié)溶液pH值及滲透壓，溶液中膠原濃度為0.98mg/mL。將收獲活率高于90％的大鼠肝細胞按106cells/mL密度接種于此混合溶液，輕輕混勻，使細胞均勻分布在溶液中后，注入截留分子量為100kDa的聚砜中空纖維絲內，封閉中空絲兩端后將16×4cm中空絲放入5cm塑料培養(yǎng)皿內，培養(yǎng)條件及對照組同具體實例1。
各重復三組，測定尿素合成量，觀察細胞形態(tài)。
肝細胞聚集過程及形態(tài)變化如附圖2-g、h、i所示，由于膠原濃度較大，對肝細胞的移動產(chǎn)生較大的阻力，使得肝細胞在144小時左右才形成聚集程度較高的柱狀聚球體。此種形式聚球體的尿素合成量隨培養(yǎng)時間變化曲線如附圖6所示，并優(yōu)于單層貼壁培養(yǎng)以及空白對照組。
上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權利要求的保護范圍內，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種肝細胞的體外組織化培養(yǎng)方法，其特征在于，包括(1)培養(yǎng)基添加膠原，把I型膠原溶液加入含胎牛血清的Williams’E培養(yǎng)基，混勻。(2)調節(jié)溶液pH值及滲透壓。(3)與原代肝細胞混勻，將肝細胞接種于混合溶液，混勻。(4)注入聚砜中空纖維絲內腔培養(yǎng)。
2.根據(jù)權利要求1所述的肝細胞體外組織化培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基添加的膠原為I型鼠尾膠原溶液或I型牛跟腱膠原溶液，培養(yǎng)基中的膠原濃度為1ug/mL～1mg/mL。
3.根據(jù)權利要求1所述的肝細胞體外組織化培養(yǎng)方法，其特征在于，肝細胞聚球體的具體形態(tài)與膠原濃度密切相關。
4.根據(jù)權利要求1所述的肝細胞體外組織化培養(yǎng)方法，其特征在于，所述聚砜中空纖維絲的截留分子量為100Kda～1000KDa。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種原代肝細胞的體外組織化培養(yǎng)方法，它是將肝細胞與添加了膠原的培養(yǎng)基混合后，注入中空纖維內腔進行培養(yǎng)，使懸浮肝細胞在內腔中自動形成肝細胞聚球體。通過調節(jié)培養(yǎng)基中的膠原濃度，可以得到組織化肝細胞聚球體。該方法簡化了肝細胞聚球體的形成途徑，方便了其在生物人工肝反應器中的應用，同時也適用于肝細胞培養(yǎng)的其它應用研究如藥物肝毒性研究，是一種更有效的肝細胞體外培養(yǎng)方法。
文檔編號C12N5/08GK1587392SQ200410054309
公開日2005年3月2日 申請日期2004年9月2日 優(yōu)先權日2004年9月2日
發(fā)明者孟琴, 吳丹青 申請人:浙江大學