專利名稱：3d細胞培養(yǎng)制品及方法
3D細胞培養(yǎng)制品及方法要求在先提交的美國申請的權利的聲明本申請要求2008年11月M日提交的美國臨時申請第61/117366號和2009年11 月12日提交的美國臨時申請第61Λ60456號的權利。所述在先文件的內(nèi)容以及本文提及的任何出版物、專利或?qū)＠募耐暾麅?nèi)容均通過參考并入本文。
背景技術：
本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)制品以及制備所述制品和在細胞培養(yǎng)中使用所述制品的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了具有相互連接成網(wǎng)絡的孔和間隙的高孔性三維(3D)組合物，以及包含所述組合物的制品，如具有高光學透明度的細胞培養(yǎng)制品，例如當存在或不存在培養(yǎng)基或細胞時涂布在基材上的細胞培養(yǎng)制品。本發(fā)明還提供了制備所述高孔性3D組合物及其制品的方法，以及細胞培養(yǎng)方法，包括例如調(diào)節(jié)細胞功能或基因表達，以及用所述制品監(jiān)控細胞的培養(yǎng)。


在本發(fā)明的實施方式中圖1顯示了具有互連孔和間隙結構的示例性多孔聚二甲氧基硅烷(PDMS)制品，所述結構用共焦顯微鏡在反射模式下拍到；圖2A顯示了聚焦于表平面的多孔PDMS顯微圖；圖2B顯示了在圖2A所示多孔PDMS細胞培養(yǎng)制品中培養(yǎng)期間形成的HepG2球狀體；圖3A顯示了具有互連孔結構的多孔PDMS制品的示例性樣品，所述結構用共焦顯微鏡在反射模式下拍到；圖;3B顯示了圖3A所示樣品在530微米深度摻雜Qdot后的雙光子熒光圖像；圖4顯示了密堆積單模大孔成孔劑系綜的示例性簡圖；圖5顯示了密堆積雙模大孔成孔劑和小孔成孔劑系綜的示例性簡圖；圖6顯示了培養(yǎng)肝細胞系H印G2 C3A 24小時后，細胞附著LDH檢驗評價的結果；圖7顯示了在對比制品和本發(fā)明多孔制品(PDMS)中培養(yǎng)H印G2 7天后，細胞附著 LDH檢驗的結果；圖8顯示了在存在和不存在誘導劑的情況下，在對比膠原蛋白制品和本發(fā)明多孔制品(PDMS)中原代培養(yǎng)CYP3A4和CYP1A2人肝細胞后進行的LDH檢驗結果；圖9顯示了用膠原蛋白作歸一化標準，分析本發(fā)明組合物的人原代肝細胞基因表達結果；圖10比較了用各種培養(yǎng)表面培養(yǎng)之后，人肝細胞的存活數(shù)量；
圖IlA和IlB顯示了在具有多種孔徑的多孔PDMS基板中用利福平誘導的人肝細胞的基因表達水平。圖12顯示了在具有多種孔徑和多種硬度(混合比)的多孔PDMS基板中培養(yǎng)的人肝細胞的選擇性基因表達質(zhì)量。圖13顯示了所公開的多種多孔PDMS基板的測量模量(應力對應變)的關系。圖14顯示了圖13所示多孔PDMS基板的測量模量與基板硬度之間的曲線關系，其中基板硬度通過單體或低聚物材料與固化劑的混合比確定。
具體實施例方式下面詳細描述本發(fā)明的各種實施方式，若有附圖則結合附圖描述。所提到的各種實施方式并未限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受所附權利要求的范圍限制。此外，本說明書中的例子不是限制性的，僅僅是從眾多可能的實施方式中為要求專利權的本發(fā)明提供一些實施方式。“孔”是指，例如，在聚合物制品表面具有至少一個外部開口的固體聚合物的表面、 本體或同時在其表面和本體中的空穴或空隙?！伴g隙”是指，例如，固體聚合物本體內(nèi)的空穴或空隙，但這種固體聚合物在聚合物制品表面上沒有直接的外部開口，即不是孔，但可能有間接的外部開口或通道通向聚合物體的外表面，其方式是與相近或相鄰的“孔”、“間隙”或其組合建立一種或多種聯(lián)系或連接。“孔網(wǎng)絡”是指，例如，在根據(jù)本發(fā)明制造的過程中，從組合物中除去微粒材料之后，剩余制品的合并或總空隙空間，由孔和間隙構成。“孔隙率”是指，例如，材料中孔和間隙的總間隙容積與該材料體的體積之比?！斑B續(xù)空隙相”是指具有互連孔網(wǎng)絡的制品，所述互連孔網(wǎng)絡基本上沒有“死端”， 也不存在例如與其他間隙僅有單一連接的“此路不通”的情況，也沒有“孤立空隙”，即無任何相互聯(lián)系的間隙。半連續(xù)空隙相也是指具有互連孔網(wǎng)絡的制品，但它可能有一些上述“死端”或“孤立空隙”，例如約1體積％ -20體積％。若遇到或需要具有上述網(wǎng)絡性質(zhì)的半連續(xù)空隙相，則在選擇成孔劑時，可考慮例如揮發(fā)性成孔劑，如擴散性氣體或升華性固體，或者與聚合物相在光學上匹配或相似的透明空心顆粒。本文所述“可重構粉末”是指這樣一種粉末，當用液體處理時，它會產(chǎn)生具有所述多孔互連網(wǎng)絡性質(zhì)的團聚聚合物。“光學密度”、“0D”或類似術語是指，例如，在存在或不存在培養(yǎng)基的情況下，本發(fā)明制品的多孔聚合物材料在給定波長下，在給定長度上的透光性的量度?！氨３致省笔侵钢糜谂囵B(yǎng)表面上的細胞在一段時間后仍附著或保留在表面上的活細胞數(shù)目所占百分率?！罢T導劑”是指能引起細胞或有機體響應發(fā)育信號，加速酶或酶序列的生物合成的分子或類似試劑?！皺z驗”、“化驗”或類似術語是指一種分析，其目的是確定例如細胞生長特性的存在、不存在、數(shù)量、程度、動力學、動態(tài)學或類型，或者對外源刺激的響應，如候選配體化合物、培養(yǎng)基、基板涂層或類似因素。
“附著”、“附連”、“粘合”、“粘附”、“粘連”、“固定”或類似術語一般是指通過例如物
理吸附、化學鍵合和類似方法或其組合，將例如本發(fā)明的表面改性物質(zhì)、增容劑、誘導劑、細胞、候選配體化合物和類似實體固定或安裝在表面上。具體地，“細胞附著”、“細胞粘附”或類似術語是指使細胞與表面相互作用或者將細胞結合到表面上，例如通過用表面，如生物傳感器表面[如康寧公司(Corning，Inc.)的Epic 儀器或類似設備]或培養(yǎng)表面，培養(yǎng)細胞或與細胞相互作用?！案街毎笔侵概c基板外表面相連、固定在基板外表面上或者與基板外表面在一定程度上接觸的細胞或細胞系或細胞體系，如原核或真核細胞。這類細胞經(jīng)培養(yǎng)之后，能抵抗或經(jīng)受住洗滌和交換基質(zhì)的過程，這樣的過程是許多基于細胞的分析的前提?！叭醺街毎笔侵冈诩毎囵B(yǎng)期間，與基板表面之間存在弱相互作用或弱連接或弱接觸的細胞或細胞系或細胞體系，如原核或真核細胞。然而，這些類型的細胞，例如人胚腎(HEK)細胞，很容易在物理干擾如洗滌或基質(zhì)交換作用下脫離基板表面?！皯腋〖毎笔侵冈诨|(zhì)中培養(yǎng)時， 優(yōu)選不附著或粘附到基板表面上的細胞或細胞系?！凹毎囵B(yǎng)”或“對細胞的培養(yǎng)”是指使原核或真核細胞在受控條件下生長的過程?！凹毎囵B(yǎng)”可包括對源自多細胞真核生物的細胞，特別是動物細胞的培養(yǎng)，但也包括對復雜組織、器官、病原體或類似體系的培養(yǎng)?！凹毎被蝾愃菩g語是指被半透膜從外部包圍的一小團原生質(zhì)，通常是微量的原生質(zhì)，它任選包括一個或多個核以及多個其他細胞器，能夠獨立地或者通過與其他類似物質(zhì)相互作用來執(zhí)行生命的所有基本功能，構成包括合成細胞構造、細胞模型體系和類似的人工細胞體系在內(nèi)的能夠獨立發(fā)揮功能的生命物質(zhì)的最小結構單位。“細胞體系”或類似術語是指一種細胞集合，它可包括一種以上類型的細胞(或者單類細胞的分化形式)，這些細胞相互作用，從而執(zhí)行生物、生理或病理生理功能。這樣的細胞體系可包括例如器官、組織、干細胞、分化肝細胞以及類似的細胞體系。本文可能會采用本領域的普通技術人員熟知的簡寫(例如用“h”或“hr”表示小時，用“g”或“gm”表示克，用“mL”表示毫升，用“rt”表示室溫，用“nm”表示納米，以及其他類似的簡寫)。當用“重量百分數(shù)”、“重量％”、“基于重量的百分數(shù)”或類似術語描述例如一種組分時，除非另有明確說明，它們是指該組分的重量與包含該組分的組合物的總重之比，用百分數(shù)表示?！鞍ā?、“包含”或類似術語是指含有或者具有但不限于，它是開放的而不是封閉的。在描述本發(fā)明的實施方式時，用來修飾例如組合物中某成分的數(shù)量、濃度、體積、 處理溫度、處理時間、產(chǎn)率、流速、壓力和類似數(shù)值及其范圍的“約”字，是指例如數(shù)值可能出現(xiàn)變化，這種變化源自例如制備化合物、組合物、濃縮物或應用制劑所采用的一般測量和處理程序，這些程序中不可避免的誤差，實施相關方法時所用原料或成分的制備、來源或純度上的差異，以及類似因素。術語“約”還包括例如組合物、制劑或細胞培養(yǎng)基因老化而與特定的初始濃度或混合物在量上不同，以及因混合或處理組合物或制劑而與特定的初始濃度或混合物在量上不同。無論是否受“約”字修飾，本文所附權利要求包括這些量的等效量。實施方式中的“基本上由……組成”是指例如組合物、制備或使用組合物的方法、 制劑，或者基板、細胞培養(yǎng)制品以及本發(fā)明中的類似制品、設備或裝置的表面上的組合物，可包括權利要求中列出的組分或步驟，再加上對所述組合物、制品、裝置以及制備和利用本發(fā)明的方法的基本新穎性質(zhì)無實質(zhì)影響的其他組分或步驟，如特定的反應物、特定的組分、 特定的添加劑或成分、特定的試劑、特定的細胞或細胞系、特定的表面改性劑或條件、特定的候選配體或藥物，或者選定的類似結構、材料或工藝變量?？赡軐Ρ景l(fā)明的組分或步驟的基本性質(zhì)造成實質(zhì)性影響，或者可能給本發(fā)明帶來不利特性的項目包括例如細胞培養(yǎng)組合物或制品與液體培養(yǎng)基之間的光學不匹配，光學失配或不透明而又無法從組合物中基本上除去的夾帶成孔劑顆粒，會對細胞培養(yǎng)組合物或制品造成生物、化學或光學污染的成孔劑顆粒，以及類似的因素和特性。本文所用的不定冠詞“一個”或“一種”以及對應的定冠詞“該”是指至少一個或一種，或者一個或多個或者一種或多種，除非另有說明。“任選的”、“任選地”或類似詞語是指后面描述的事項或情況可能發(fā)生，有可能不發(fā)生，該描述包括所述事項或情況發(fā)生的情形和它們不發(fā)生的情形。例如，詞匯“任選組分” 是指該組分可能存在，也可能不存在，該描述包括含有該組分和不含該組分這樣兩個實施方式。為組分、成分、添加劑、細胞類型、病原體和類似方面披露的具體的和優(yōu)選的數(shù)值及其范圍僅用于說明的目的；它們不排除其他限定值或者處于所限定的范圍內(nèi)的其他數(shù)值。本發(fā)明的組合物、裝置和方法包括具有本文所述任何數(shù)值或任何數(shù)值組合、具體數(shù)值、 更具體的數(shù)值以及優(yōu)選數(shù)值的組合物、裝置和方法。本發(fā)明提供了非基于動物的細胞培養(yǎng)組合物、制品，如用于哺乳動物細胞及類似細胞，具有更近似于體內(nèi)行為的細胞功能。例如，肝細胞體外培養(yǎng)在藥物發(fā)現(xiàn)過程中可能是有用的(例如預測ADME Tox)，因為作為解毒過程的一部分，在細胞色素(CY)酶P450作用下，藥物在肝臟里發(fā)生代謝后能轉(zhuǎn)化為毒性更強的中間體并與其他化合物(例如藥物)相互作用。然而，體內(nèi)原代肝細胞會迅速失去功能，包括白蛋白的產(chǎn)生和CY P450的活性，這在很大程度上控制著細胞代謝藥物分子的能力。因此，用這些細胞研究毒性和藥物相互作用通常受到限制，所得信息較少。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了用于3D細胞培養(yǎng)、細胞檢測或在3D培養(yǎng)中監(jiān)控細胞的合成組合物。這種組合物為細胞提供了細胞培養(yǎng)環(huán)境，供其在活體外生長并發(fā)育自然功能；并且，這些細胞培養(yǎng)組合物經(jīng)選擇或設計后，可具有合適的光學性能，例如具有改進的細胞成像穿透深度，因而能幫助檢測基板中細胞的活性。在一些實施方式中，本發(fā)明的多孔聚合物制品適用于3D細胞培養(yǎng)，提供了下面的一種或多種特征，這些特征可單獨或組合出現(xiàn)。培養(yǎng)的細胞可通過所述制品的互連孔結構自由遷移、交流或彼此接觸。培養(yǎng)的細胞可在所述多孔制品的間隙或孔內(nèi)長成具有特定精確尺寸的球狀體。球狀體的尺寸可通過限定基板中間隙或孔的分布來控制，而所述間隙或孔的分布通過審慎選擇成孔劑材料來限定。在一些實施方式中，可制備具有兩個(即雙模) 或多個(例如多模)粒徑分布、包含孔網(wǎng)絡間隙的多孔制品，以促進細胞間的交流，并促進營養(yǎng)物滲入和廢物排出多孔制品內(nèi)部網(wǎng)絡的互連通道?？稍O計具有更大間隙和孔徑的多孔制品，以容納細胞或適應細胞生長；也可設計更小的間隙和孔徑，以促進例如細胞交流、 營養(yǎng)交換和廢物交換。多孔制品是例如多孔固體或多孔凝膠，它們既容易與培養(yǎng)基結合， 也容易從培養(yǎng)基分離，包括方便連續(xù)或半連續(xù)地交換培養(yǎng)基。若需要，可使制品的折射率與培養(yǎng)基的折射率相匹配或相接近，從而在將多孔制品浸入培養(yǎng)基時，使其近似透明。近似透明的制品能夠例如增大穿透深度，便于對居于制品內(nèi)部的細胞進行光學成像。在用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制備的本發(fā)明制品中，雙光子熒光顯微鏡的成像穿透深度可達例如約100-1000微米，比起在基于聚乙烯醇(PVA)的多孔制品中的僅約90微米，要深約500微米。在一些實施方式中，即使對于諸如PVA這樣光學性質(zhì)不利的聚合物，本發(fā)明也提供了解決光學透明性問題的方案。PDMS是具有高穩(wěn)定性和生物相容性、適合細胞生長的材料。最近，康寧公司介紹了用于 3D 細胞培養(yǎng)的 Ultra1Web11^H (參見 www, corning. com/Lifesciences/technical information/techDocs/Ultraffeb References, pdf)。UltraWeb 是由納米纖維結構構成的合成膜。細胞在膜表面頂部分布和增殖。本發(fā)明提供了改進的3D細胞培養(yǎng)制品和方法， 與基于具有UltraWeb 表面的細胞培養(yǎng)體系的體內(nèi)3D細胞培養(yǎng)體系相比，其具有優(yōu)越的性質(zhì)。本發(fā)明還涉及多孔細胞培養(yǎng)制品以及制備和使用所述制品的方法。所述細胞培養(yǎng)制品提供了三維環(huán)境(3D細胞培養(yǎng))，具有有用的培養(yǎng)性質(zhì)和對培養(yǎng)的細胞進行光學檢測的性質(zhì)。在活體中，細胞通常在細胞外基質(zhì)(ECM)支撐結構的幫助下沿三維生長。ECM包含例如蛋白質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白和層粘連蛋白，它們不僅為細胞的3D生長提供機械支撐，而且使細胞在生長和發(fā)育功能的同時能夠相互交流。細胞生物學家，特別是癌癥研究人員，一直懷疑在陪替氏培養(yǎng)皿的平整表面上對細胞進行傳統(tǒng)的單層或二維OD)培養(yǎng)還不夠精細，不能重現(xiàn)細胞充分發(fā)育其自然生物活性和功能所需的生長環(huán)境。對這種能近似地模擬體內(nèi)細胞生長結構的3D細胞培養(yǎng)體系，人們數(shù)十年前就開始產(chǎn)生研究興趣；然而， 直到 Bissell 研究小組闡明[參見 V. W. Weaver 等，Journal of Cell Biology, V137(l), P231-245,1997]乳房癌細胞在3D培養(yǎng)體系中發(fā)生的逆轉(zhuǎn)，3D細胞培養(yǎng)體系才出現(xiàn)轉(zhuǎn)機，因為這種逆轉(zhuǎn)在2D培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的細胞身上從未觀察到。此后，3D細胞培養(yǎng)體系迅速成為傳統(tǒng)單層細胞培養(yǎng)體系的重要替代體系。研究人員常常用來自動物組織的生物材料，如膠原蛋白凝膠(參見H. K. Kleinman 等，Biochemistry 27，p6188_6193，1982)和 Matrigel (參見 Bell，E.，Ivarsson 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，76，p. 1274-1278，1979)，作為3D細胞培養(yǎng)的ECM0雖然實踐證明這些材料可有效用于3D細胞培養(yǎng)，且適合在基質(zhì)內(nèi)數(shù)百微米的深度下給細胞成像，但提取動物組織存在以下缺點，包括例如不同批次的底物的組成不可控、不確定，因而難以比較不同來源的底物的培養(yǎng)結果；基質(zhì)中形成的細胞球狀體的尺寸是隨機的，給結果的定量帶來困難；以及基質(zhì)的凝膠形式給對培養(yǎng)物的物理操作造成困難，例如，在培養(yǎng)過程中，要改變培養(yǎng)基而不干擾細胞培養(yǎng)物是具有挑戰(zhàn)性的。因此，人們開發(fā)出多種基于合成材料的細胞培養(yǎng)底物，用來替代用于3D細胞培養(yǎng)的天然底物，但成功者有限。一些示例性例子包括由合成聚合物構成的微米級或納米級微纖維經(jīng)證實可成功用于細胞培養(yǎng)[參見E. Entcheva 等，Biomaterials, 25 (26), P5753-5762, 2004 ；C. E. Semino 等，Dif ierentiation, 71, P262-270，2003]，但細胞生長的深度有限，類似于二維細胞培養(yǎng)；孔徑小于細胞直徑的多孔聚合物材料支持表面上細胞球狀體的形成，但它們同樣提供有限的生長深度，類似于納米級或微米級纖維基質(zhì)；用合成材料如聚(乳酸)(PLA)和聚(乙醇酸)(PGA)制備的大孔基 M
為細胞生長提供了一種結構，使其比在纖維基底物上長得更深。然而，這些材料是不透明的，即使是最先進的成像技術，如共焦熒光顯微法和雙光子熒光法，在底物中的成像深度也不超過數(shù)百微米。因此，理想的3D細胞培養(yǎng)體系應當提供合適的三維細胞外基質(zhì)(ECM)或支架，支持細胞的三維生長，但同時應使后續(xù)檢測培養(yǎng)基質(zhì)中的細胞成為可能?，F(xiàn)有的3D細胞培養(yǎng)體系大多注重為細胞的3D生長提供支持，而很少考慮后續(xù)在培養(yǎng)過程中對細胞的檢測。本發(fā)明提供了一種3D細胞培養(yǎng)體系，不僅可用于細胞的生長或維持，而且方便在培養(yǎng)過程中檢測、研究或監(jiān)控細胞。通過提供本發(fā)明的具有三維(3D)互連孔網(wǎng)絡和高光學透明性的高孔性細胞培養(yǎng)組合物和制品，細胞培養(yǎng)能力受限的問題和監(jiān)控細胞培養(yǎng)過程的能力受限的問題得到解決。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了制備三維多孔細胞培養(yǎng)制品的方法，所述方法包括使包含至少一種單體或低聚物(如二甲基硅氧烷預聚物或前體和硅氧烷預聚物)、固化劑、交聯(lián)劑或類似催化劑以及至少一種微粒成孔劑的混合物發(fā)生聚合，形成具有微粒相的連續(xù)聚合物基質(zhì)；以及處理所得的固體基質(zhì)，從基質(zhì)中除去微粒相。聚合物基質(zhì)中的微粒相可以是，例如連續(xù)相、半連續(xù)相、不連續(xù)相或其組合。在一些實施方式中，所述至少一種微粒成孔劑可以是，例如以下情形中的至少一種粒徑約為75-1000微米的第一顆?；旌衔?；粒徑約為0. 1-75微米的第二顆?；旌衔?；或者它們的組合。在一些實施方式中，成孔劑可包含例如具有單模粒徑分布的相似或不同顆粒的混合物。根據(jù)尺寸分布性質(zhì)，單模分布可提供具有大間隙、中等間隙或小間隙的顆粒相，或者它們的混合相，并在除去微粒相后提供相應的大表面孔、中等表面孔、小表面孔或其混合孔。圖4顯示了密堆積單模大孔成孔劑系綜的示意圖。在一些實施方式中，成孔劑可包含例如具有例如雙模粒徑分布的顆?；旌衔铩Ｃ糠N模都以合適量存在的雙模粒徑分布可提供大間隙和小間隙相混合、大表面孔和小表面孔相混合或者它們相互組合的顆粒相。圖5顯示了具有大孔成孔劑和小孔成孔劑的密堆積雙模系綜的示意圖。在具有第一顆?；旌衔锖偷诙w?；旌衔锏囊恍嵤┓绞街校骰旌衔锟瑟毩⑦x自例如單模顆粒、雙模顆粒、單分散顆粒、雙分散顆粒、多分散顆粒及其組合。在一些實施方式中，第一顆?；旌衔锖偷诙w?；旌衔锟捎上嗤镔|(zhì)或不同物質(zhì)組成，但它們具有不同的粒徑性質(zhì)、粒徑分布性質(zhì)或其組合。一般地，隨著成孔劑含量增加，孔隙率和孔徑例如線性增加?；旌衔锏木酆峡稍诤线m的基板上完成。作為另外的或替代的情形，混合物的聚合可以例如預成形體的形式完成，它是具有多種有用形狀的模塑形式，并任選附著或連接到例如基板、容器或類似支撐體上，也就是說，使包含至少一種單體或低聚物和至少一種成孔劑微粒材料的混合物在基板上發(fā)生聚合，以在基板上形成連續(xù)的聚合物基質(zhì)和不連續(xù)的微粒相。所述至少一種單體或低聚物的聚合包括例如形成至少一種單體或低聚物的連續(xù)聚合物相，所述至少一種單體或低聚物選自例如，硅氧烷、乙烯基取代的三烷氧基硅烷、 α-烯烴、乙烯基酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、不飽和酮、單亞乙烯基芳烴以及類似的可聚合單體或低聚物，或者它們的組合。可聚合或共聚成本文所述制品的合適單體或低聚物的例子包括單亞乙烯基芳烴(例如苯乙烯、芳烷基苯乙烯，如鄰_、間-和對-甲基苯乙烯，2， 4-二甲基苯乙烯，芳乙基苯乙烯，對-丁基苯乙烯，以及類似的單體或低聚物；還有α-烷基苯乙烯，如α-甲基苯乙烯、α-乙基苯乙烯、α-甲基-對甲基苯乙烯以及類似的單體或低聚物；乙烯基萘，以及類似的單體或低聚物)；芳基-鹵代-單亞乙烯基芳烴(例如鄰-、間-和對-氯苯乙烯，2，4_ 二溴苯乙烯，2-甲基-4-氯苯乙烯，以及類似的單體或低聚物)；丙烯腈、甲基丙烯腈、丙烯酸烷基酯(例如丙烯酸甲酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸乙基己酯，以及類似的單體或低聚物)，相應的甲基丙烯酸酯烷基酯、丙烯酰胺類(例如丙烯酰胺、 甲基丙烯酰胺、N-丁基丙烯酰胺，以及類似的單體或低聚物)；不飽和酮(例如乙烯基甲基酮、甲基異丙烯基酮，以及類似的單體或低聚物)；α-烯烴(例如乙烯、丙烯，以及類似的單體或低聚物)；乙烯基酯(例如乙酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯，以及類似的單體或低聚物)； 乙烯基和亞乙烯基鹵化物(例如乙烯基和亞乙烯基氯化物和溴化物，以及類似的單體或低聚物)；乙烯基取代的硅烷，如乙烯基取代的三烷氧基硅烷，以及類似的單體或低聚物，或者它們的組合。Hosoya 等在 “High-Performance Polymer-Based Monolithic Capillary Column (基于高性能聚合物的整體毛細管柱)”，Anal. Chem.，2006，78 (16)，5729-5735中提到用環(huán)氧化物單體三(2，3_環(huán)氧丙基)異氰脲酸酯(TEPIC)與二胺4-[(4_氨基環(huán)己基)甲基]環(huán)己胺(BACM)和手性反式-1，2-環(huán)己二胺(CHD)制備毛細管柱；Tsujioka等在"A New Preparation Method for Well-Controlled 3D Skeletal Epoxy Resin-Based Polymer Monoliths (—種新的制備良好控制的3D骨架環(huán)氧樹脂基聚合物整體件的方法)”，Macromolecules, 2005, 38 (24), 9901-9903 中提到用雙酚 A 二環(huán)氧甘油醚(BADE)、 (BACM)和致孔溶劑如聚乙二醇(PEG)制備3D整體件。所述至少一種成孔劑可以是例如以下物質(zhì)的顆粒單糖、多糖、聚(亞烷基)二醇、 聚乙烯醇、冰、蠟，升華性物質(zhì)(如固體C02)，熔點低于所形成的聚合物的物質(zhì)，水溶性聚合物、非水溶性聚合物或其共聚物，具有殼芯的微囊(其中例如，殼包含單體或低聚物不溶材料，而芯包含可與水混溶的材料或水溶性材料)，具有可溶性殼和空心或充氣芯的微球囊， 或者它們的組合。為從所得的聚合固體基質(zhì)中除去微粒相而對基質(zhì)進行的處理包括例如與一種物質(zhì)接觸，以溶解微粒相，其中所述物質(zhì)包含以下物質(zhì)中的至少一種水性液體；有機液體；超臨界流體，例如CO2 ；低熔點固體，例如蠟、水及類似低熔點固體；氣體，例如空氣、N2、氬氣以及類似氣體；或者它們的組合；加熱所述基質(zhì)，使所述微粒相液化或溶解；或者上述接觸與加熱組合起來。除去微粒相后所得聚合物相的折射率可以例如等于或小于約1.49，如約 1. 2-1. 49，包括所有中間值和中間范圍，如 1. 2-1. 4，1. 2-1. 35，1. 25-1. 4，1. 3-1. 49， 1. 3-1. 4，1. 35-1. 49，1. 35-1. 4，以及類似的數(shù)值和范圍。在一些實施方式中，所述制備方法還可包括例如基于粒徑系綜(particle size ensemble)選擇成孔劑堆積密度，所述粒徑系綜包括將成為所得細胞培養(yǎng)制品中的連續(xù)聚合物基質(zhì)的空隙容積和將成為所得細胞培養(yǎng)制品中的空隙容積的微粒成孔劑所占體積部分，所述空隙容積就是間隙容積與孔容積之和。所述包含至少一種供聚合用的單體或低聚物和至少一種微粒成孔劑可通過例如以下至少一種方法制備高速液-固混合、液-固摻混、液-固離心或其組合。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了三維細胞培養(yǎng)制品，其包括例如具有互連孔網(wǎng)絡的聚合物體，所述互連孔網(wǎng)絡包含由具有單孔徑分布的孔或者具有雙模分布的大孔和小孔及對應的間隙組成的孔。在一些實施方式中，所述制品的聚合物體可以是例如以下至少一種珠子；可重構粉末；涂布制劑，例如多孔聚合物體的液體懸浮顆粒；厚20-500微米的薄膜、厚10000-100000微米的厚膜或者具有500-10000微米中間厚度的膜；或者它們的組合。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了通過上述方法制備的三維細胞培養(yǎng)制品，所述方法包括使包含至少一種單體或低聚物和至少一種微粒成孔劑的混合物發(fā)生聚合反應，形成具有獨立微粒相的連續(xù)聚合物基質(zhì)；以及處理所得的固體基質(zhì)，除去基質(zhì)中的微粒相。所述三維細胞培養(yǎng)制品可包含例如基板；以及支撐在基板上的具有互連孔網(wǎng)絡的聚合物層，所述多孔聚合物層包含具有連續(xù)或半連續(xù)空隙相的連續(xù)聚合物基質(zhì)。在一些實施方式中，所述細胞培養(yǎng)制品可以雙連續(xù)材料為特征，即聚合物形成連續(xù)基質(zhì)，而微空隙形成第二個連續(xù)相，雖然它是空的或開放的相。在一些實施方式中，所述多孔聚合物制品的表面積可以是例如約0. 1-20米7克。在一些實施方式中，所述多孔聚合物制品經(jīng)汞或氮孔隙率測定法測得的孔隙率可以是，例如約50% -95%，包括中間值和中間范圍；所述多孔聚合物制品在空氣中的折射率可以是例如約1.觀-1.49，包括中間值和中間范圍；所述多孔聚合物制品的密度可以是例如約1-1000千克/米3，包括中間值和中間范圍。在一些實施方式中，聚二甲基硅氧烷多孔聚合物的折射率可以是例如約 1. 28-1. 49，一般的水性細胞培養(yǎng)基的折射率可以是例如約1. 33-1. 36。在一些實施方式中， 多孔聚合物的折射率和一般的水性細胞培養(yǎng)基的折射率可經(jīng)適當選擇，使它們的折射率相匹配或近似匹配，例如，其折射率之差小于約士0.2個單位，優(yōu)選小于約士0. 15，更優(yōu)選小于約士0. 12，甚至更優(yōu)選小于約士0. 10。所述多孔聚合物制品的光學密度可以是例如約 0-1，光學穿透深度可以是例如約100-1000微米或更深。所述多孔聚合物制品可包含聚合物、共聚物或類似材料，其分子量約為500-500000道爾頓。
在一些實施方式中，所述制品還可包含至少一種選自下組的添加劑營養(yǎng)劑、抗生素、生長刺激劑、生長抑制劑、表面改性劑、表面增容劑，以及類似的細胞培養(yǎng)組分，如一種或多種促進劑、抑制劑、調(diào)節(jié)劑、緩和劑、誘導劑，或者它們的組合。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種細胞培養(yǎng)方法，其包括例如使上述細胞培養(yǎng)物接觸一種制品以及合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，所述制品包含基板和支撐在基板上、具有互連孔網(wǎng)絡的聚合物層，所述多孔聚合物層包含具有連續(xù)或半連續(xù)空隙相的連續(xù)聚合物基質(zhì)，所述培養(yǎng)條件是例如溫度控制、培養(yǎng)基交換和活細胞。與工業(yè)標準膠原蛋白表面提供的保留率相比，所述細胞培養(yǎng)提供的保留率約為 70% -100%。在一些實施方式中，合適的細胞系的一個例子是人原代細胞。在一些實施方式中， 所述培養(yǎng)制品提供了優(yōu)異的細胞系性能、細胞功能、細胞活力、細胞基因表達和類似性質(zhì)， 或者它們的組合。為開發(fā)有助于細胞培養(yǎng)和細胞檢測的3D細胞培養(yǎng)基板，基礎材料的光學性質(zhì)宜與后續(xù)用來監(jiān)控培養(yǎng)物中的細胞所需的檢測或成像技術相匹配。在本發(fā)明的一些實施方式中，可用熒光顯微鏡監(jiān)控培養(yǎng)物中的細胞。為配制所述細胞培養(yǎng)物，應當考慮基礎材料的以下光學性質(zhì)在工作波長范圍內(nèi)具有良好的光學透明性，以避免光學檢測過程中來自培養(yǎng)物的光學干擾；其折射率與細胞培養(yǎng)基的折射率高度匹配，以減少檢測過程中來自材料的光學散射。除制品所用多孔材料的光學性質(zhì)外，所選多孔材料的化學性質(zhì)在培養(yǎng)條件下應非常穩(wěn)定，使得細胞在培養(yǎng)過程中的生長不會受到制品變化的影響。在一些實施方式中，多孔材料優(yōu)選具有良好的透氣性和滲水性，以利于細胞的生長。在一些實施方式中，可通過例如強制填充和浸提法將基礎聚合物材料形成為具有互連孔或間隙的高孔性結構。在強制填充法中，將具有所需尺寸的填充劑或成孔劑與基礎聚合物材料均勻混合，然后利用重力或壓力強制填充劑彼此緊密接觸，并與單體或低聚物、 預聚物或類似前體緊密堆積在一起，得到聚合或固化的基礎聚合物材料?？赏ㄟ^例如在超聲浴中用合適的選擇性溶劑浸出或溶解，對所得到的與填充劑堆積在一起的基礎聚合物材料進行處理，以除去填充劑。多孔基板的孔徑分布可通過填充劑的尺寸來控制，該孔徑分布可以是單尺寸分布或一種以上的尺寸分布，具體取決于所需的培養(yǎng)應用。除考慮尺寸外，所用填充劑還應具有最小的毒性或者對細胞培養(yǎng)的生理條件干擾最少，使得未浸出而殘留在多孔基板中的任何殘余填充劑不會對細胞生長帶來負面影響。具有所需粒徑和尺寸分布的成孔劑顆?？赏ㄟ^任何合適的方法獲得，包括例如粒徑縮減法、粒徑增大法或其組合。粒徑縮減裝置可用于干固體顆?；蛘邞腋∮谳d液中的顆粒。一種基于液體、使用高壓液流的粒徑縮減裝置是例如Microfluidizer_ ，或者如題為 “粒徑縮減裝置及其使用”的專利申請W0/2006/064203所述的改進過增強器的類似裝置，或者可以使用類似的分級裝置通過尺寸縮減制得所需的顆粒。粒徑增大方法可包括例如乳化或懸浮聚合法，或者類似的粒徑增大方法?？衫美绶旨壠鳌⑦^濾器、網(wǎng)篩或類似裝置，根據(jù)顆粒的尺寸或直徑范圍分離尺寸減小的顆?；虺叽缭黾拥念w粒。所需粒徑和尺寸分布可通過任何合適的顆粒分析裝置和方法進行測量和表征，如霍力巴公司(Horiba) (www. horiba. com)提供的裝置和方法，包括例如激光衍射法、動態(tài)光
12散射法、圖像分析法，或者類似的分級裝置和方法?；袅Π蚅B-550可測量約1納米至約6 微米的粒徑，可測濃度范圍為PPm級至約40%的固體。霍力巴LA-300激光衍射粒徑分布分析儀可用來測量懸浮體或干粉的粒徑。培養(yǎng)制品的制造以及附屬組分如基板和包裝材料的獲取優(yōu)選在無菌條件下完成。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了非動物來源的細胞培養(yǎng)涂料及相應的涂布基板，所述涂布基板提供了類似于體內(nèi)的細胞培養(yǎng)環(huán)境。在一些實施方式中，所述多孔涂料和制品很容易制備，且較為廉價。所述涂料提供了非動物來源的基板涂層，所得涂布產(chǎn)品例如很少有或者沒有不同批次之間的差異，并具有優(yōu)異的可貯存性以及貯存穩(wěn)定性或生物穩(wěn)定性。在一些實施方式中，所述多孔聚合物涂料可提供基板表面涂層，其具有很容易通過例如選擇聚合物涂料中所用單體或低聚物來調(diào)節(jié)的折射率。所述涂料組合物可提供無毒且生物相容的基板表面涂層。所述涂料組合物可提供很好處理的基板表面涂料，如容易沉積到各種表面上，并且提高了涂料和細胞附著到各種基板上的能力，所述基板有例如塑料、玻璃和類似的細胞培養(yǎng)基板或載體。若需要，可選用粘結層或轉(zhuǎn)化涂層，如氨基硅烷，以促進多孔聚合物附著到基板如玻璃上。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)細胞的方法，其包括提供涂布了上述多孔組合物或類似組合物的基板；使所述涂布基板與細胞培養(yǎng)物接觸足夠長的時間，建立功能細胞；通過光學方法監(jiān)控細胞；以及任選從基板回收細胞。在一些實施方式中，所述基板可以是例如選自金屬氧化物、混合金屬氧化物、合成聚合物、天然聚合物、類似材料或其組合。在一些實施方式中，本發(fā)明的多孔細胞培養(yǎng)制品可進一步通過例如表面處理或調(diào)理進行加工，獲得具有更好的生物相容性的制品，參見例如共同擁有的美國專利第6617152號和同時待決的美國專利申請第11/973832號。細胞培養(yǎng)物中的細胞可以是例如任何類型細胞如肝細胞的任何合適的原代細胞或者相關永生細胞系。所述細胞培養(yǎng)物可包括例如可活躍地產(chǎn)生白蛋白、抗體或類似實體及其組合的細胞。從基板中回收細胞可通過任何合適的方法完成，例如離心、攪拌、洗滌和類似方法，或者它們的組合。在一些實施方式中，可選用各種生物相容性聚合物材料制備多孔組合物。作為另外的或替代的情形，生物相容性聚合物材料可單獨使用、組合使用，或者與其他細胞培養(yǎng)材料或載體材料混合使用。聚合物材料可包括，例如聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烴、聚(亞烷基)二醇、聚(亞烷基)氧化物、聚對苯二甲酸亞烷基酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯基鹵化物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物，硝基纖維素，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、纖維素醋酸酯、纖維素丙酸酯、纖維素醋酸酯丁酸酯、纖維素醋酸酯鄰苯二甲酸酯、羧乙基纖維素、纖維素三醋酸酯、纖維素硫酸鈉鹽、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、 聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯基酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(異丙基丙烯酸酯)[polyGsopropacrylate)]、聚(異丁基丙烯酸酯) [poly (isobutacrylate)]、聚(十八烷基丙烯酸酯)[poly (octadecacrylate)]、聚乙烯、聚丙烯聚(乙二醇)、聚(氧化乙烯)、聚(對苯二甲酸乙二酯)、聚(乙烯基醇)、聚(醋酸乙烯酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚透明質(zhì)酸、酪蛋白、明膠、谷蛋白、聚酸酐、聚丙烯酸、藻酸鹽、 脫乙酰殼多糖，以及它們的任何共聚物或其任何組合。細胞的生理功能會受細胞培養(yǎng)環(huán)境的極大影響。在能最好地維持細胞的具體功能的環(huán)境里培養(yǎng)細胞是有益的。相比于平整表面上的傳統(tǒng)二維OD)細胞培養(yǎng)，在各種基質(zhì)如Matrigel 中進行的三維(3D)細胞培養(yǎng)，在維持細胞功能方面明確顯示出其實用性，因為它與體內(nèi)細胞環(huán)境非常相似。人們已經(jīng)認識到，孔徑和基質(zhì)硬度是3D細胞培養(yǎng)體系中調(diào)節(jié)細胞形貌和功能的兩個關鍵因素[參見例如，C. S. Ranucci等，Biomaterials 210000)783-793 ;Μ· H. Zaman等，Proc Nati Acad Sci USA 103 (29) 2006,10889-94 ；T. Sun 等，“Investigation of fibroblast and keratinocyte cell-scaffold interactions using a novel 3D cell culture system(使用新的3D細胞培養(yǎng)體系研究纖維原細胞和角化細胞-支架相互作用)”，Journal of Materials Science =Materials in Medicine, 18 (2)，2007，pp. 321-328]。然而，在這些培養(yǎng)體系中精確控制和調(diào)整孔徑并非易事。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了控制和調(diào)整3D細胞培養(yǎng)基板的孔徑和硬度，以調(diào)節(jié)特定細胞的細胞功能的組合物和方法。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了制備多孔合成材料基板的設計和方法，所述多孔合成材料基板能調(diào)節(jié)3D細胞培養(yǎng)物中的細胞功能。除了為細胞在活體外形成和發(fā)育其生物功能提供類似于體內(nèi)的環(huán)境外，對這些多孔基板的孔徑和硬度的控制和調(diào)整也可用于調(diào)節(jié)細胞功能，這可滿足基于細胞的豐富應用的各種需要。例如，對某些藥物試劑的誘導測試要求目標基因的基礎表達水平較低，而對藥物試劑的抑制測試要求目標基因的基礎表達水平較高。通過調(diào)節(jié)基板的孔徑和硬度性質(zhì)來調(diào)整基因表達水平的能力提供了有用的平臺，可用于比較這些結果，同時對其他培養(yǎng)條件干擾最少。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了具有諸如多孔支架的孔徑和硬度這樣的性質(zhì)的材料，所述性質(zhì)可調(diào)節(jié)，以便為不同細胞系提供優(yōu)化的培養(yǎng)性能；本發(fā)明還提供了控制所述多孔支架的孔徑和硬度的方法，可用以調(diào)節(jié)細胞生長和形貌；所述支架可在基因表達水平上選擇性調(diào)節(jié)細胞功能。所述多孔聚合物基板可為3D細胞培養(yǎng)提供以下特征孔徑控制孔徑很容易控制和調(diào)整，這為細胞-細胞相互作用和組織提供了受到良好控制的物理調(diào)節(jié)。細胞有序化在細胞培養(yǎng)期間，細胞的組織和相互作用影響著細胞生長和細胞功能發(fā)育，因此，細胞功能可通過調(diào)整孔徑來調(diào)節(jié)。細胞調(diào)節(jié)通過控制孔徑來調(diào)節(jié)細胞功能對細胞生理環(huán)境帶來的干擾最少。具有相同來源的細胞可通過不同基板孔徑性質(zhì)調(diào)節(jié)功能，可提供用于比較的樣板。例如，在孔較小的所述多孔PDMS基板中培養(yǎng)人肝細胞時，人肝細胞表現(xiàn)出中等水平的CYP (細胞色素 P450)基因，如CYP 1A2、CYP 2B6和CYP 3A4，但對利福平(USAN)或利福霉素(INN)誘導的藥物響應較強，這非常適合通過候選藥物對細胞功能進行誘導研究。在孔較大的多孔PDMS 中培養(yǎng)人肝細胞時，人肝細胞表現(xiàn)出較高水平的CYP基因，這種情況對于通過候選藥物對細胞功能進行抑制研究是很理想的?；逭{(diào)整和基因調(diào)節(jié)硬度可用例如楊氏模量度量，對于本文所述多孔基板來說可精確控制和調(diào)整。通過調(diào)整基板硬度，可在基因表達水平上選擇性調(diào)節(jié)細胞功能。細胞功能的調(diào)節(jié)可以是細胞特異性的。由于孔徑和硬度易于調(diào)整，所述基板提供了具有高度適應性的多功能3D細胞培養(yǎng)平臺。楊氏模量是度量聚合物材料硬度的一種物理量。模量越高， 材料越硬。這可通過實驗確定，即對材料樣品進行拉伸測試，產(chǎn)生應力-應變曲線，從曲線斜率即可得到。應力-應變曲線描述了材料伸長率(應變)與施加在材料上的力(應力) 之間的變化關系，直至材料失效(例如斷裂)；參見圖13。若斜率大，則表明樣品具有高拉伸模量，也就是說材料抗變形，具有高硬度。若斜率不大，則表明材料具有低拉伸模量，也就是說材料容易變形，具有低硬度。模量可用強度單位表達，如帕或牛/厘米2。研究表明，活細胞的基因表達水平隨多孔聚合物層的楊氏模量硬度升高。在一些實施方式中，多孔聚合物層的楊氏模量可用是例如約0. 1-15兆帕，包括中間值和中間范圍。細胞功能可受細胞培養(yǎng)環(huán)境的極大影響。在設計良好的細胞培養(yǎng)體系中，細胞可保持其特異性細胞功能。此外，通過調(diào)整細胞與培養(yǎng)環(huán)境的物理相互作用，可調(diào)節(jié)細胞功能。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了通過調(diào)整多孔培養(yǎng)基板的孔徑和模量(硬度) 來調(diào)節(jié)3D細胞培養(yǎng)物中的細胞功能的方法。在一些實施方式中，大部分孔的孔徑可比單個細胞大。因此，細胞主要在孔內(nèi)接種 (seed)、遷移、增殖和組織化?；蹇讖椒植紝毎?細胞和細胞-基質(zhì)相互作用構成物理約束，可顯著影響細胞功能。所述多孔PDMS具有微孔結構，使細胞可進入孔內(nèi)生長，并加強細胞-細胞相互作用。得到了原代人肝細胞在不同孔徑的基板上形成球狀體的光學圖像 (未示出彩色圖像)。該圖像顯示，當多孔PDMS的孔徑范圍從180-212微米增大到300-355 微米時，通常在單個孔內(nèi)形成單個球狀體，且球狀體尺寸隨孔徑增大而增大；而從500-600 微米、850-1000微米和1000-1400微米時，不是在單個孔內(nèi)形成更大的球狀體，而是形成多個更小的球狀體。在孔徑超過1000微米的基板中，觀察到的球狀體更少，細胞傾向于形成細胞-細胞附著較松的團聚體。在具有多種孔徑(柱形圖未示出)的所述多孔PDMS中培養(yǎng)人肝細胞，并以膠原蛋白和Matrigel 作為對照，對基因ABCBl [ATP-結合盒(binding cassette)，亞家族B (MDR/ TAP)，成員 1]、ABCC2[ATP-結合盒(binding cassette)，亞家族 C (CFTR/MRP)，成員 2]、 ALB(白蛋白)、CEBPAtCCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP)，α ]、GJBl (間隙連接蛋白，β 1)、 HNF4A(肝細胞核因子4，α )和UGTl (UDP葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1)做基礎基因表達實驗，結果總是表明，所有10種基因標記都通過實時定量聚合酶鏈反應(RQ-PCR)得到陽性表達。這些基因是一組標記基因，用來測量與作為工業(yè)標準的膠原蛋白表面和Matrigel 相比，肝細胞的功能在上述基板中保持得如何。所有10種標記基因的表達水平比在膠原蛋白表面上高，說明多孔PDMS比膠原蛋白能更好地保持肝細胞的功能。更重要的是，這些基因的表達水平與在Matrigel 上相當，Matrigel 是一種用于保持肝細胞功能的領先的商業(yè)基板。在附圖中，y軸上的“RQ”表示“相對定量結果”，用具體基因標記的基因表達水平除以管家基因次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶I(HPRTl)的表達水平。實施例以下實施例用于更充分地描述利用本發(fā)明的方式，并進一步闡述為實施本發(fā)明的各個方面所設想的最佳實施方式的具體例子。這些例子不限制本發(fā)明的范圍，是為說明的目的而提供的。制備多井板形式的細胞培養(yǎng)基板的方法。在標準孔板式多井玻璃插入組件上，可如下所述直接形成具有本發(fā)明的多孔PDMS 的多個單元。a.在支撐基板如多井孔板上直接形成多孔聚合物單元。將選定的單體或低聚物、任選的交聯(lián)劑以及具有例如單粒徑分布、雙粒徑分布或多粒徑分布的成孔劑顆?；旌铣删鶆蚧旌衔铩Ｍㄟ^離心、搖晃、加壓或類似方法恰當堆積成孔劑。在支撐基板，如厚度小于約500微米的玻璃板頂部放置所需多單元形式的模具， 如多井孔板。將與成孔劑堆積在一起的單體或低聚物的均勻混合物倒入空模具里。在規(guī)定的固化條件下固化模具里的均勻混合物。用物理方法從模具中移出固化的混合物。從固化的混合物中除去成孔劑。將支撐基板附著到多孔板上，例如用合適的粘合劑或者物理固持件。b.在多井板底部直接形成多孔聚合物。將選定單體或低聚物和交聯(lián)劑的混合物分配到多井板的每個井中。將成孔劑分配到每個井中，將多井板搖晃約30分鐘。繼續(xù)將成孔劑分配到每個井中并搖晃，直到單體或低聚物混合物中的成孔劑達到飽和，如再搖晃30分鐘后，單體或低聚物與成孔劑混合物的表面上留有一層成孔劑。在規(guī)定的固化條件下使聚合物和成孔劑的混合物固化。固化之后，利用恰當?shù)慕釛l件除去成孔劑。c.預形成多孔聚合物，然后將其分布到多井板的每個井中。在容器中混合選定的單體或低聚物、交聯(lián)劑和具有一個或兩個粒徑分布(即單?；螂p模)的成孔劑。堆積成孔劑和聚合物前體。固化混合物，使聚合物交聯(lián)。從固化的聚合物中浸出成孔劑。將所得多孔聚合物切成所需形狀和尺寸，將該片聚合物放到井板底部。施加緊固劑，如一種插入粘合劑，將多孔聚合物樣品固定在板的底部。對多孔聚合物(PDMS)中肝細胞培養(yǎng)的評價肝細胞系C3A在多孔聚合物中的附著或活力研究。通過細胞溶解釋放乳酸脫氫酶 (LDH)，它是一種穩(wěn)定的胞質(zhì)酶。LDH的釋放量與溶解的細胞數(shù)量成正比。利用CytoTox 96 細胞毒性分析盒[普洛麥格公司(Promega)]對活細胞數(shù)量進行定量測定，由此評價C3A細胞在多孔聚合物基板中的附著情況。用膠原蛋白細胞培養(yǎng)板和MatriGel 3D培養(yǎng)材料作
為對照標準。圖6顯示了肝細胞系C3A在多孔PDMS聚合物基板上培養(yǎng)M小時后，用LDH分析法評價細胞附著情況的結果。培養(yǎng)7天后進行LDH分析，觀察到類似的結果，如圖7所示。 根據(jù)LDH分析結果不難得出，肝細胞3A4細胞系可在所述多孔聚合物基板中培養(yǎng)，這些細胞的附著情況與膠原蛋白標準相當。人原代肝細胞的附著或活力研究圖8顯示了在作比較的膠原蛋白和本發(fā)明的多孔聚合物(PDMS)中，在含誘導劑和不含誘導劑的情況下，對人原代肝細胞培養(yǎng)物進行LDH分析的結果。所述誘導劑是最終濃度為10微摩爾的利福平。用膠原蛋白作歸一化標準，在多孔PDMS中培養(yǎng)的人原代肝細胞的基因表達分析維持對功能穩(wěn)定的原代人肝細胞的長期培養(yǎng)，是開發(fā)新藥的藥物代謝研究中的主要目標。各種基因標記的基因表達是評價相應細胞功能的可靠途徑。在所述分析中，用定量實時PCR識別mRNA水平的基因表達。表1列出的10種基因標記是根據(jù)它們在肝細胞特異性功能中的作用選擇的。表 權利要求
1.一種制備三維多孔細胞培養(yǎng)制品的方法，所述方法包括使包含至少一種單體、低聚物或其混合物以及至少一種微粒成孔劑的混合物發(fā)生聚合，形成具有密堆積微粒相的連續(xù)聚合物基質(zhì)；以及處理所得的固體基質(zhì)，從基質(zhì)中除去密堆積微粒相。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一種微粒成孔劑包括以下物質(zhì)中的至少一種粒徑約為75-1000微米的第一顆?；旌衔?；粒徑約為0. 1-75微米的第二顆?；旌衔铮换蛘咚鼈兊慕M合。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一微粒混合物和所述第二微?；旌衔锔髯元毩⒌剡x自單模顆粒、雙模顆粒、單分散顆粒、雙分散顆粒、多分散顆?；蚱浣M合。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物的聚合在基板上完成，所得的三維多孔細胞培養(yǎng)制品基本上是光學透明的。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一種單體或低聚物的聚合包括由選自下組的至少一種單體或低聚物形成連續(xù)聚合物相硅氧烷、乙烯基取代的三烷氧基硅烷、α -烯烴、乙烯基酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、不飽和酮、單亞乙烯基芳烴或其組合。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一種成孔劑選自以下物質(zhì)的顆粒 糖、多糖、聚亞烷基二醇、聚乙烯醇、冰、蠟，熔點低于所形成的聚合物的物質(zhì)、水溶性聚合物、非水溶性聚合物、非水溶性單體或低聚物與水溶性單體或低聚物的共聚物、具有殼和芯的微囊、具有殼和空芯的微球囊或者它們的組合。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，為從所得的聚合固體基質(zhì)中除去微粒相而對基質(zhì)進行的處理包括以下至少一種操作與一種物質(zhì)接觸，以溶解微粒相，其中所述物質(zhì)包含以下物質(zhì)中的至少一種水性液體、有機液體、超臨界流體、低熔點固體、氣體或者它們的組合；加熱所述基質(zhì)，使所述微粒相液化；聲波處理；或者它們的組合。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，除去微粒相后所得的聚合物相的折射率約為 1. 2-1. 45。
9.如權利要求1所述的方法，所述方法還包括基于粒徑系綜選擇成孔劑堆積密度，所述粒徑系綜包括被可聚合單體、低聚物或其混合物填充，將成為所得的細胞培養(yǎng)制品中的連續(xù)聚合物基質(zhì)的空隙容積，還包括被微粒成孔劑占據(jù)、將成為空隙容積的體積部分。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述包含用于聚合的至少一種單體或低聚物和至少一種微粒成孔劑的混合物通過以下至少一種方法制備高速液體混合、摻混、離心或其組合。
11.一種三維細胞培養(yǎng)制品，其包含具有互連孔網(wǎng)絡的聚合物體，所述互連孔網(wǎng)絡包含由下述孔或間隙組成的孔具有單?？讖椒植嫉目准捌鋵g隙、具有雙模孔徑分布的大孔和小孔及對應的間隙、或者它們的組合；所述制品基本上是光學透明的。
12.如權利要求11所述的制品，其特征在于，所述聚合物體包含以下至少一種珠子； 可重構的粉末；涂布制劑；厚約20-500微米的薄膜；多孔整體件；或者它們的組合。
13.一種用權利要求1所述方法制備的三維細胞培養(yǎng)制品，其包含 基板；以及支撐在基板上的具有互連孔網(wǎng)絡的聚合物層，所述多孔聚合物層包含具有連續(xù)或半連續(xù)空隙相的連續(xù)聚合物基質(zhì)。
14.如權利要求13所述的制品，其特征在于，所述多孔聚合物的表面積約為1-20米7克。
15.如權利要求13所述的制品，其特征在于，所述多孔聚合物經(jīng)汞孔隙率測定法測得的孔隙率約為50% -95%，在空氣中的折射率約為1. 28-1. 45，密度約為0. 5-1. 5千克/米 3，分子量約為500-500000道爾頓。
16.如權利要求13所述的制品，其特征在于，所述多孔聚合物的光學密度約為0-1，光學穿透深度約為10-1000微米。
17.如權利要求13所述的制品，它還包含選自下組的至少一種添加劑營養(yǎng)劑、抗生素、生長刺激劑、生長抑制劑、表面改性劑、表面增容劑或其組合。
18.一種細胞培養(yǎng)方法，其包括使權利要求13所述的細胞培養(yǎng)制品接觸培養(yǎng)基，然后接觸活細胞。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所得的細胞培養(yǎng)物提供了約90%-100%的保持率。
20.如權利要求18所述的方法，其特征在于，活細胞的基因表達水平隨多孔聚合物層的楊氏模量硬度提高，所述多孔聚合物層的楊氏模量約為0. 1-15兆帕。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種光學透明的多孔聚合物組合物，包含該組合物的制品，以及制備該組合物和將該組合物用于細胞培養(yǎng)的方法，所述使用方法包括例如調(diào)節(jié)或提高如本發(fā)明中所限定的細胞功能或基因表達。
文檔編號C08J5/00GK102292384SQ200980155367
公開日2011年12月21日 申請日期2009年11月20日 優(yōu)先權日2008年11月24日
發(fā)明者O·賽多倫克, 蘇慧 申請人:康寧股份有限公司