專利名稱：：一種高得率的靈芝多糖的制備方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明提供了一種高得率的靈芝多糖的制備方法。
背景技術(shù)：
：靈芝是擔子菌綱多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬(Ganoderma)真菌赤芝(G.lucidum)和紫芝(G.japonicum)的總稱，又稱“靈芝草”、“仙草”、“瑞草”，始載于“神農(nóng)本草經(jīng)”，具有補中益氣、滋陰強壯、扶正固本、延年益壽等功效。靈芝多糖是靈芝的主要功效成分之一，藥理試驗表明靈芝多糖具有多種藥理作用，如抗腫瘤、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒等。熱水浸提法是提取靈芝多糖常用的方法。但是，傳統(tǒng)熱水浸提法存在提取時間長、溫度高、得率低等問題，為克服傳統(tǒng)熱水提取法的不足，近年來，出現(xiàn)了超聲或微波輔助提取、超高壓、酶法等新的提取技術(shù)與方法。靳丹紅等比較了索氏、超聲波、微波三種提取方法對靈芝多糖得率的影響，結(jié)果表明微波提取法多糖得率最高，為0.868%。(不同提取方法對靈芝多糖提取率的影響，中國藥師，2008，11(5):551-552)。杜冰等進行了超高壓提取靈芝孢子粉多糖的工藝研究，在最優(yōu)提取條件下多糖得率為2.763%，而常規(guī)水提取法多糖得率僅為2.014%(超高壓提取靈芝孢子粉多糖的工藝研究，現(xiàn)代食品科技，2009，25(5)=420-422,430)吳映明等研究表明超聲波處理法和超低溫凍融法結(jié)合提取靈芝孢子粉多糖具有實用價值，其得率可達1.786%(超聲波-超低溫凍融處理對靈芝孢子粉多糖提取的影響，中國食用菌，2008，27(3):34-35)。周明等采用超聲波-微波協(xié)同萃取靈芝多糖，其得率可達1.49%(超聲波-微波協(xié)同萃取對靈芝多糖提取率的影響，湖北農(nóng)業(yè)科學，2009，48(7):1727-1729.)。中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院蔡永峰等發(fā)明“酶解制備靈芝多糖的方法”(200410019093.9)，利用菌絲體自身酶系和外加的混合酶系在適宜的條件下對靈芝真菌發(fā)酵液進行酶解，酶解后靈芝粗多糖產(chǎn)品中靈芝多糖含量為35-60%。天津市林業(yè)果樹研究所張志軍等發(fā)明“靈芝多糖的制備方法”(200510014592.3)，主要采用將靈芝子實體經(jīng)前處理、微濾、冷凍分離、膜分離、膜濃縮、減壓濃縮、減壓干燥等方法而得到的靈芝多糖產(chǎn)品。南京農(nóng)業(yè)大學胡秋輝等發(fā)明“一種靈芝多糖的高效制備方法”(200810156039.7)，采用超聲波提取技術(shù)，多糖得率為20.79士0.llmg/g，純度達到了47.88%，與傳統(tǒng)的熱水浸提相比，時間縮短了96%，得率提高了28%。湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所周明等發(fā)明“一種超聲波微波協(xié)同萃取靈芝多糖的方法”(200810048683.2)，具有可供選擇的萃取溶劑種類多、目標萃取物范圍廣泛、降低目標物與樣品基體的結(jié)合力，加速目標物從固相進入溶劑相的過程，且樣品處理量大等特點。武梅等進行了堿提堿溶性靈芝菌絲體多糖的研究，其中采用0.5mol/LNaOH溶解醇析，糖得率為1.3%(堿提堿溶性靈芝菌絲體多糖方法研究，云南大學學報，1999，21(2)160-161)。從目前的研究結(jié)果可以看出，單純進行水溶性靈芝多糖的提取，其提取率只有3%左右，提取后的靈芝殘渣中還含有部分其他多糖，如堿溶性蛋白多糖，氨基多糖，如果直接丟棄，既造成資源浪費，又對環(huán)境造成污染。單純進行堿溶性靈芝多糖的提取，由于沒有考慮對水溶性靈芝多糖的回收，其提取率也非常有限。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種高得率的靈芝多糖的制備方法，該方法利用微波加熱作用和超聲波的空化作用相互結(jié)合提取靈芝多糖，再利用堿法提取法提取靈芝中的堿溶性多糖，減少靈芝多糖的損失，而且制備得到的靈芝多糖具有生產(chǎn)得率高以及免疫活性強等特點。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種高得率靈芝多糖的制備方法，其特征在于，先將靈芝子實體粉碎成靈芝粉，然后依次采用微波輔助熱水提取法、超聲波輔助熱水提取法進行提取，所得的提取液經(jīng)濃縮、去雜、醇沉和干燥后得到水溶性靈芝多糖；再采用堿提取法對靈芝殘渣進行提取，所得的提取液經(jīng)中和、透析、濃縮、去雜、醇沉和干燥處理后得到堿溶性靈芝多糖。本發(fā)明的具體步驟如下(1)以靈芝子實體為原料進行粉碎處理，得到靈芝粉；(2)靈芝粉與水按料液比為115-125(g/ml)混合后，先進行微波輔助熱水提取，然后進行超聲波輔助熱水提取，離心分離得上清液和靈芝殘渣，上清液經(jīng)濃縮、去雜、醇沉和干燥后得到水溶性靈芝多糖；(3)按料液比110-120(g/ml)在步驟(2)中的靈芝殘渣中加入堿液進行堿法提取，提取液離心分離得上清液和靈芝殘渣，上清液經(jīng)中和、透析、濃縮、去雜、醇沉和干燥后得到堿溶性靈芝多糖。本發(fā)明所述的步驟(1)中采用超微粉碎法對靈芝子實體進行粉碎，所得的靈芝粉的粒度100-200目，靈芝粉水分含量為13-15%。采用超微粉碎法粉碎靈芝子實體，可以使靈芝纖維變短，更利于多糖溶出。本發(fā)明步驟(2)中所述的微波輔助提取的條件是微波功率為300-500W，提取時間為3-5min。所述的超聲波輔助提取的條件是超聲溫度40_60°C，功率為500-600W，超聲時間為30-50min，超聲5秒停5秒(即占空比5S/5S)，超聲總時間為60_100min。本發(fā)明的步驟(3)中堿法提取的條件是提取溫度50-70°C，時間60-100min。所述步驟(3)中堿液為NaOH溶液或KOH溶液，其質(zhì)量百分比濃度為4%6%。所述步驟(3)中的中和、透析、去雜、濃縮和干燥處理的具體操作是上清液用濃鹽酸調(diào)PH至7左右，減壓濃縮到小體積，置可截留分子量>7000的透析袋內(nèi)，用去離子水透析3-4天，直到電導率不發(fā)生變化為止，取出透析液，于50-55°C減壓濃縮，加乙醇調(diào)至含醇量為80%，靜置過夜，離心后沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌，冷凍干燥，稱重，即得堿溶性靈芝多糖。本發(fā)明可做以下改進在進行步驟(2)的微波輔助提取和超聲波輔助提取前對靈芝粉進行去雜處理，其具體操作是在靈芝粉中加入乙醇，靈芝粉與乙醇的料液比為115-120(g/ml)，在70-80°C回流2次，每次23h，離心去除上清液，沉淀經(jīng)干燥得到去除掉醇溶性成分、部分單糖、低聚糖和脂類物質(zhì)的靈芝粉。經(jīng)過去雜處理可以鈍化靈芝的內(nèi)源性酶并去掉靈芝粉中的醇溶性成分、部分單糖、低聚糖和脂類物質(zhì)，以提高所得的靈芝多糖的純度。本發(fā)明中步驟(2)和步驟(3)中的所述的離心條件是3500-4500r/min條件下離心10-12分鐘。所述的乙醇的質(zhì)量百分比濃度為9095%。本發(fā)明所述的靈芝子實體采用赤靈芝子實體或紫靈芝子實體。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果(1)本發(fā)明采用超微粉碎法粉碎靈芝子實體，使靈芝纖維變短，利于多糖溶出，再利用微波加熱作用和超聲波的空化作用相互結(jié)合提取靈芝多糖，解決現(xiàn)有熱水提取靈芝多糖和單一提取方法存在的產(chǎn)品得率低、提取時間長、溫度高等問題，以及解決單純堿法提取沒有考慮對其水溶性靈芝多糖進行回收或提取而造成的損失等問題。而且所得的水溶性靈芝多糖和堿溶性靈芝多糖均保持較高的增強小鼠免疫功能的活性(參見表1和表2)。表1多糖對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應、血清溶血素生成以及NK細胞殺傷活性的影響組別耳腫脹度(mg)540nmOD值NK細胞殺傷活性(％)(1)正常對照14.42±2.841.5022±0.268220.78±1.46(2)模型對照6.75±2.960.5262±0.190516.45±2.07微波和超聲提収多糖10.73士4.48②0.9555±0.4071①②20.04士1.85②堿法提取多糖_12.12±6.01②1.2594±0.2217②19.03土2.37②_注@、②、表示分別與(1)、(2)組比較，P<0.05表2多糖對溶血素試驗小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響_^JA_胸腺指數(shù)_脾臟指數(shù)_(1)正常對照15.90±4.8248.72±6.69(2)模型對照11.05±4.23①38.71士7.36①微波和超盧提取多糖14.18±2.03②36.84士5.35堿法提取多糖_11.92±4.00φ_40.41士4.00①_注、②、表示分別與(1)、(2)組比較，P<0.05參照中華人民共和國衛(wèi)生部保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003年版)關于增強免疫力功能評價試驗結(jié)果判定的標準，根據(jù)本研究結(jié)果可判定靈芝多糖具有增強免疫力的作用。(2)本發(fā)明與常規(guī)熱水提取(常規(guī)粉碎10目)相比，提取溫度低、時間短且得率可以提高3.43倍，如果與同等目數(shù)的靈芝樣品常規(guī)熱水提取(超微粉碎150目)相比，提取率可提高2.47倍。對比結(jié)果見表3。表3不同工藝對水溶性靈芝多糖的得率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>備注其他提取條件料液比120、提取溫度50°C、Na0H堿液濃度5%—致。(4)本發(fā)明在進行靈芝多糖的提取前進行乙醇去雜處理，鈍化了靈芝的內(nèi)源性酶并去掉靈芝粉中的醇溶性成分、部分單糖、低聚糖和脂類物質(zhì)，以提高所得的靈芝多糖的純度。圖1是本發(fā)明靈芝多糖高效制備方法的工藝流程圖。具體實施例方式實施例1(1)以赤靈芝子實體為原料進行超微粉碎處理，得到粒度約150目赤靈芝粉，赤靈芝粉用90%乙醇在80°C回流處理2次，每次3h，赤靈芝粉與乙醇的料液比115(g/ml)，然后離心，去除上清液，所得的沉淀在60°C烘箱干燥5小時得到去除掉醇溶性成分、部分單糖、低聚糖和脂類物質(zhì)的靈芝粉。(2)精確稱取5g赤靈芝粉，其中赤靈芝粉的水分含量為13.26%,以水作為溶劑，赤靈芝粉與水的料液比為125(g/ml)，先采用微波輔助熱水提取然后超聲波輔助熱水提取水溶性靈芝多糖。其中，微波輔助提取條件為微波功率300W，提取時間3min；超聲波輔助提取條件為超聲功率500W，提取溫度40°C，提取時間為30min，超5秒停5秒，即占空比5S/5S，提取總時間為60min。將提取液于4500r/min條件下離心11分鐘，收集上清液，冷凍干燥得到水溶性靈芝多糖粗品，按硫酸苯酚法測定水溶性多糖含量為5.12%。然后將沉淀用60°C烘箱干燥5小時，得赤靈芝殘渣用于進行堿法提取。(3)對步驟(2)中所得的赤靈芝殘渣進行堿法提取堿溶性靈芝多糖，提取條件為堿提溫度50°C，堿提時間70min，Na0H溶液質(zhì)量百分比濃度為4%，赤靈芝殘渣與NaOH溶液的液料比110(g/ml)，將所得的提取液于4000r/min條件下離心10分鐘，收集上清液，用鹽酸調(diào)PH至7左右，減壓濃縮到小體積，置可截留分子量>7000的透析袋內(nèi)，用去離子水透析3天，直至電導率不發(fā)生變化為止，取出透析液，于50°C減壓濃縮，加質(zhì)量百分比濃度為95%的乙醇調(diào)至溶液中含醇量為80%，靜置過夜，然后離心，棄去上清液，所得的沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌，冷凍干燥得到堿溶性靈芝多糖粗品，按硫酸苯酚法測定堿溶性多糖含量為9.83%。實施例2:(1)以赤靈芝子實體為原料進行超微粉碎處理，得到粒度約200目赤靈芝粉，赤靈芝粉用95%乙醇在70°C回流處理2次，每次3h，赤靈芝粉與乙醇的料液比120(g/ml)，然后離心，去除上清液，所得的沉淀在60°C烘箱干燥5小時得到去除掉醇溶性成分、部分單糖、低聚糖和脂類物質(zhì)的靈芝粉。(2)精確稱取5g赤靈芝粉，其中赤靈芝粉的水分含量為13.26%,以水作為溶劑，赤靈芝粉與水的料液比為120(g/ml)，先采用微波輔助熱水提取然后超聲輔助熱水提取水溶性靈芝多糖。其中，微波提取條件為微波功率400W，提取時間4min;超聲波輔助提取條件為超聲功率550W，提取溫度55°C，提取時間35min，超5秒停5秒，即占空比5S/5S，提取總時間為70min。將所得的提取液于4000r/min條件下離心10分鐘，收集上清液，冷凍干燥得到水溶性靈芝多糖粗品，按硫酸苯酚法測定水溶性多糖含量為5.46%。然后將沉淀用60°C烘箱干燥5小時，得靈芝殘渣用于進行堿法提取。(3)對步驟(2)中所得的赤靈芝殘渣進行堿法提取堿溶性靈芝多糖，提取條件為堿提溫度60°C，堿提時間60min，NaOH溶液的質(zhì)量百分比濃度為5%，液料比120(g/ml)，將上述提取液于4000r/min條件下離心10分鐘，收集上清液，用鹽酸調(diào)PH至7左右，減壓濃縮到小體積，置可以截留分子量>7000的透析袋內(nèi)，用去離子水透析4天，直至電導率不發(fā)生變化為止，取出透析液，于53°C減壓濃縮，加質(zhì)量百分比濃度為95%的乙醇調(diào)至含醇量為80%，靜置過夜，離心后沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌，冷凍干燥得到堿溶性靈芝多糖粗品，按硫酸苯酚法測定堿溶性多糖含量為10.74%。實施例3(1)以赤靈芝子實體為原料進行超微粉碎處理，得到粒度約100目赤靈芝粉，赤靈芝粉用95%乙醇在75°C回流處理2次，每次3h，赤靈芝粉與乙醇的料液比118(g/ml)，然后離心，去除上清液，所得的沉淀在60°C烘箱干燥5小時得到去除掉醇溶性成分、部分單糖、低聚糖和脂類物質(zhì)的靈芝粉。(2)精確稱取5g赤靈芝粉，其中赤靈芝粉的水分含量為13.26%,以水作為溶劑，赤靈芝粉與水的料液比為115(g/ml)，先采用微波輔助熱水提取然后超聲輔助熱水提取水溶性靈芝多糖。其中，微波提取條件為微波功率500W，提取時間5min；超聲波輔助提取條件為超聲功率600W，提取溫度60°C，提取時間40min，超5秒停5秒，即占空比5S/5S，提取總時間為80min。將所得的提取液于3000r/min條件下離心12分鐘，收集上清液，冷凍干燥得到水溶性靈芝多糖粗品，按硫酸苯酚法測定水溶性多糖含量為5.31%。然后將沉淀用60°C烘箱干燥5小時，得靈芝殘渣用于進行堿法提取。(3)對步驟(2)中所得的赤靈芝殘渣進行堿法提取堿溶性靈芝多糖，提取條件為堿提溫度70°C，堿提時間80min，NaOH溶液的質(zhì)量百分比濃度為5.5%，液料比115(g/ml)，將上述提取液于4000r/min條件下離心15分鐘，收集上清液，用鹽酸調(diào)PH至7左右，減壓濃縮到小體積，置可以截留分子量>7000的透析袋內(nèi)，用去離子水透析4天，直至電導率不發(fā)生變化為止，取出透析液，于55°C減壓濃縮，加質(zhì)量百分比濃度為95%的乙醇調(diào)至含醇量為80%，靜置過夜，離心后沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌，冷凍干燥得到堿溶性靈芝多糖粗品，按硫酸苯酚法測定堿溶性多糖含量為10.26%。權(quán)利要求一種高得率的靈芝多糖的制備方法，其特征在于，先將靈芝子實體粉碎成靈芝粉，然后依次采用微波輔助熱水提取法、超聲波輔助熱水提取法進行提取，所得的提取液經(jīng)濃縮、去雜、濃縮、醇沉和干燥后得到水溶性靈芝多糖；再采用堿提取法對靈芝殘渣進行提取，所得的提取液經(jīng)中和、透析、濃縮、去雜、醇沉和干燥處理后得到堿溶性靈芝多糖。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈芝多糖的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟(1)以靈芝子實體為原料進行粉碎處理，得到靈芝粉；(2)靈芝粉與水按料液比為115-125(g/ml)混合后，先進行微波輔助熱水提取，然后進行超聲波輔助熱水提取，離心分離得上清液和靈芝殘渣，上清液經(jīng)濃縮、去雜、醇沉和干燥后得到水溶性靈芝多糖；(3)按料液比110-120(g/ml)在步驟(2)中的靈芝殘渣中加入堿液進行堿法提取，提取液離心分離得上清液和靈芝殘渣，上清液經(jīng)中和、透析、濃縮、去雜、醇沉和干燥后得到堿溶性靈芝多糖。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靈芝多糖的制備方法，其特征在于，所述的步驟(1)中采用超微粉碎法對靈芝子實體進行粉碎，所得的靈芝粉的粒度100-200目，靈芝粉水分含量為13-15%。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靈芝多糖的制備方法，其特征在于，所述的步驟(2)中所述的微波輔助提取的條件是微波功率為300-500W，提取時間為3-5分鐘；所述的超聲波輔助提取的條件是超聲溫度40-60°C，功率為500-600W，超聲時間為30-50min，超聲5秒停5秒，超聲總時間為60-100min。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靈芝多糖的制備方法，其特征在于，所述的步驟(3)中堿法提取的條件是提取溫度50-70°C，時間60-100min；所述步驟(3)中的堿液為NaOH溶液或KOH溶液，其質(zhì)量百分比濃度為4-6%。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靈芝多糖的制備方法，其特征在于，所述的步驟(3)中的中和、透析、去雜、濃縮和干燥處理的具體操作是上清液用濃鹽酸調(diào)PH至7，減壓濃縮到小體積，置可截留分子量>7000的透析袋內(nèi)，用去離子水透析3-4天，直到電導率不發(fā)生變化為止，取出透析液，于50-55°C減壓濃縮，加乙醇調(diào)至含醇量為80%，靜置過夜，離心后沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌，冷凍干燥，稱重，即得堿溶性靈芝多糖。7.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4或5或6所述的靈芝多糖的制備方法，其特征在于，在進行所述步驟(2)的微波輔助提取和超聲波輔助提取前對靈芝粉進行去雜處理，其具體操作是在靈芝粉中加入乙醇，靈芝粉與乙醇的料液比為115-120&/!111)，在70-801回流2次，每次2-3h，離心去除上清液，沉淀經(jīng)干燥得到去除掉醇溶性成分、部分單糖、低聚糖和脂類物質(zhì)的靈芝粉。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的靈芝多糖的制備方法，其特征在于，所述的步驟(2)中的所述的離心條件是離心轉(zhuǎn)速3500-4500r/min，離心時間10-12分鐘。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的靈芝多糖的制備方法，其特征在于，所述的乙醇的質(zhì)量百分比濃度為9095%。10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的靈芝多糖的制備方法，其特征在于，所述的靈芝子實體為赤靈芝子實體或紫靈芝子實體。全文摘要本發(fā)明公開了一種高得率的靈芝多糖的制備方法，其先將靈芝子實體粉碎成靈芝粉，然后依次采用微波輔助熱水提取法、超聲波輔助熱水提取法進行提取，所得的提取液經(jīng)濃縮、去雜、濃縮、醇沉和干燥后得到水溶性靈芝多糖；再采用堿提取法對靈芝殘渣進行提取，所得的提取液經(jīng)中和、透析、濃縮、去雜、醇沉和干燥處理后得到堿溶性靈芝多糖。該方法利用微波加熱作用和超聲波的空化作用相互結(jié)合提取靈芝多糖，再利用堿法提取法提取靈芝中的堿溶性多糖，減少靈芝多糖的損失，而且制備得到的靈芝多糖具有生產(chǎn)得率高以及免疫活性強等特點。文檔編號C08B37/00GK101805414SQ201010145080公開日2010年8月18日申請日期2010年4月6日優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日發(fā)明者寧正祥,敖宏,黃生權(quán)申請人:無限極(中國)有限公司