專利名稱：包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及ー種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法。
背景技術(shù)：
SiRNA是一段21 — 25個堿基對的RNA分子，發(fā)現(xiàn)于單細胞生物抵御病毒侵襲的機制。單細胞生物針對入侵病毒的mRNA序列合成出一段與之互補的siRNA，主動結(jié)合mRNA，從而阻斷病毒的復(fù)制。siRNA因其獨特的靶點特異性、結(jié)構(gòu)可設(shè)計性和代謝安全性，成為科研界普遍看好的新的治療藥物。然而，在過去的20年里 ，研究人員設(shè)計了一系列的載體用于siRNA的體內(nèi)輸送，但僅有極少數(shù)進入臨床階段，迄今，仍未有ー個載體得到FDA認證，一個有效載體的缺位，導致核酸物質(zhì)體內(nèi)輸送仍然處于臨床瓶頸期。將核酸物質(zhì)輸送到靶細胞的胞漿或細胞核內(nèi)，需要克服一系列的體內(nèi)輸送屏障，因此，核酸載體是否高效，是其能否用于臨床治療的關(guān)鍵所在。核酸物質(zhì)輸送的載體ー般為以下兩類(1)病毒載體病毒載體(如慢病毒載體、腺病毒載體)作為基因的輸送載體，雖然有較高的體外轉(zhuǎn)染活性，然而，其免疫原性與易導致突變的缺點為臨床試驗帶來了巨大的安全問題，使得其應(yīng)用受限。(2)非病毒載體非病毒載體的優(yōu)勢主要在于，在保證預(yù)期的轉(zhuǎn)染活性的條件下，可以大大降低病毒載體所帯來的免疫原性與諸多炎癥反應(yīng)，其一般為以下兩種載體設(shè)計(a)陽離子脂質(zhì)體；(b)聚陽離子基因載體。而目前研究更多的主要集中于聚陽離子基因載體與陽離子脂質(zhì)體的修飾，使之適用于基因物質(zhì)的靶向輸送。陽離子脂質(zhì)體具有較高的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染活性，然而，由于表面的正電荷影響其體內(nèi)的正常分布，同時，由于選用陽離子脂質(zhì)，免疫原性與炎癥反應(yīng)在動物試驗中也成為不可避免的缺點之一(Gao, K. &Huang, L. Nonviral methods for siRNA delivery. Molecularpharmaceutics6, 651-658(2008).)。魚精蛋白，是ー種天然的富含多精氨酸結(jié)構(gòu)的多肽，表面帶有正電荷，可通過靜電作用カ壓縮核酸物質(zhì)至納米尺度。目前，魚精蛋白已經(jīng)用于高效的體內(nèi)、體外的基因輸送載體。其優(yōu)勢在干，血漿敏感度低，在低質(zhì)量比時，無免疫原性，低毒，成為基因輸送的優(yōu)良載體。然而，存在的ー個問題是，沒有經(jīng)過修飾的魚精蛋白基因顆粒，會產(chǎn)生一定的非靶組織粘附，同時，其血液半衰期也較低，易被血漿清除。鑒于此，諸多文獻中報道，可選用魚精蛋白與陽離子脂質(zhì)體對DNA或者siRNA進行壓縮包封，即LPD- I (Iipopolyplexes),并在表面接枝PEG以及靶向基團，以延長體內(nèi)循環(huán)時間，并提高靶向效率。但由于選用非天然的陽離子脂質(zhì)，存在體內(nèi)毒性與體內(nèi)免疫原性等問題，同時，未能中和的陽離子表面的正電荷會引起體內(nèi)非靶組織的粘附，并與血漿成分發(fā)生聚集，從而降低靶向效果，并直接影響體內(nèi)病變細胞的內(nèi)呑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供ー種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，以解決現(xiàn)有的以魚精蛋白與陽離子脂質(zhì)體對DNA或者siRNA進行壓縮包封得到的納米顆粒，由于選用非天然的陽離子脂質(zhì)，存在體內(nèi)毒性和體內(nèi)免疫原性的問題，并且，未能中和的陽離子表面的正電荷從而引起體內(nèi)非靶組織的粘附，并與血漿成分發(fā)生聚集，從而降低靶向效果，并直接影響體內(nèi)病變細胞的內(nèi)吞的技術(shù)性問題。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)—種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟I)以PEG為連續(xù)相制備親水相系統(tǒng)；2)將嵌段高分子、魚精蛋白和基因物質(zhì)加入步 驟I)所制備的親水相系統(tǒng)中，攪拌或搖動，形成納米顆粒；3)用透析袋透析除去所述納米顆粒水相中留存的PEG，即可制得包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒。優(yōu)選地，所述親水相系統(tǒng)中PEG的濃度為0. I 20wt%。優(yōu)選地，所述基因物質(zhì)與所述魚精蛋白的質(zhì)量之和與所述嵌段高分子質(zhì)量之比為I :0. f 1000，所述基因物質(zhì)與所述魚精蛋白的質(zhì)量比為0. rioo :1。優(yōu)選地，所述透析袋的截留分子量為500(T20000Da，透析時間為6 72h。優(yōu)選地，所述嵌段高分子包括依次連接的第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段，所述第一嵌段和所述第三嵌段為親水嵌段，所述第二嵌段為疏水嵌段。優(yōu)選地，所述第一嵌段可選自PEG或PE0。優(yōu)選地，所述第二嵌段可選自聚乳酸、聚こ交酷、聚こ交酷-丙交酯共聚物或聚己內(nèi)酯中的ー種。優(yōu)選地，所述第三嵌段包括蛋白親和作用力強的高分子，所述蛋白親和作用力強的高分子選自葡聚糖、麥芽糖或殼聚糖中的ー種。優(yōu)選地，所述嵌段高分子還包括靶向基團或熒光分子，所述靶向基團或所述熒光分子與所述第一嵌段連接。優(yōu)選地，所述靶向基團可選自蛋白、多肽、抗體或小分子靶向基團的ー種或幾種；所述蛋白可選自轉(zhuǎn)鐵蛋白或去唾液酸糖蛋白；所述多肽可選自RGD或胰島素；所述小分子靶向基團可選自葉酸、生物素或半乳糖的ー種。優(yōu)選地，所述熒光分子可選自羅丹明、FITC、NBD、cy5. 5或FAM的ー種。優(yōu)選地，在步驟2)中，可將所述魚精蛋白與所述基因物質(zhì)形成復(fù)合物后再加入步驟I)所制備的親水相系統(tǒng)中。優(yōu)選地,所述基因物質(zhì)包括DNA或RNA。優(yōu)選地，在步驟2)中，攪拌或搖動的時間為0. 5 72h。優(yōu)選地，所述嵌段高分子的合成方法包括以下步驟I)以mPEG-COOH為引發(fā)劑，在Sn(Oct)2的催化下，在8(Tl40°C條件下于無水甲苯中引發(fā)開環(huán)聚合，加入己內(nèi)酷，反應(yīng)進行10 72h，合成PEG45-PCL3tl嵌段；2)將葡聚糖與こニ胺按照I: (T50)的摩爾比投料，即稱取葡聚糖，こニ胺，溶解于2 50mL的DMSO中，混合物在0 80で油浴中反應(yīng)2 10天，每天加入(T50mg氰基硼氫化鈉；反應(yīng)結(jié)束后，加入大量甲醇沉淀，過濾，再加水溶解，甲醇沉淀，反復(fù)三次，最后將產(chǎn)物于室溫下真空干燥，得到淡黃色還原氨化的DEX-EDA;3)將DEX-EDA的氨基與mPEG45-PCL3Q-C00H的羧基進行反應(yīng)，稱取DEX-EDA，加入1"10倍摩爾量的PEG-PCL，溶解于I 50mL的DMSO中，加入0 50倍摩爾量的三こ胺，攪拌I 60min后，加入(T50倍摩爾量的2- (7-偶氮苯并三氮唑)-N, N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酷，在(T90°C下反應(yīng)2 48h;反應(yīng)結(jié)束后，加入こ醚沉淀，減壓抽濾，產(chǎn)物加入超純水，溶解后，用截留分子量為100(T20000的透析袋透析除去雜質(zhì)與未反應(yīng)的反應(yīng)物，于-2(T-200°C預(yù)凍，低溫凍干，得到白色粉末產(chǎn)物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用本發(fā)明的制備方法制成的納米顆粒，可實現(xiàn)基因物質(zhì)的輸送，并且，不存在體內(nèi)毒性和體內(nèi)免疫原性的問題，由于納米顆粒不帶電荷，還可避免體內(nèi)非靶組織的粘附，并可接枝靶向基團，實現(xiàn) 體內(nèi)病變細胞靶向，從而有效提高靶向效果，且不影響體內(nèi)病變細胞的內(nèi)吞。


圖I為本發(fā)明的嵌段高分子結(jié)構(gòu)及合成方法示意圖；圖2為本發(fā)明的嵌段高分子的核磁譜圖；圖3為本發(fā)明的嵌段高分子的核磁譜圖；圖4為本發(fā)明的納米顆粒的制備示意圖；圖5為本發(fā)明的納米顆粒熒光共定位結(jié)構(gòu)驗證的示意圖；圖6為本發(fā)明的嵌段高分子的細胞毒性檢測示意圖；圖7為本發(fā)明的細胞內(nèi)吞攝取結(jié)果示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例詳細說明本發(fā)明。實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程。但所舉實施例并非用于限定本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明對嵌段高分子與protamine/DNA所形成的納米顆粒的理化性質(zhì)表征方法包括動態(tài)光散射和zeta電位測試。按本方案制備的納米顆粒的細胞攝取、基因轉(zhuǎn)染和小動物活體成像觀察選用的DNA為小牛胸腺DNA，細胞毒性選用的細胞為Hela、H印G2、SMMC-7721細胞，內(nèi)吞試驗選用SMMC-7721細胞。實施例I嵌段高分子PEG45-PCL3ci-DEX的合成方法嵌段高分子PEG-PCL-DEX的合成路線如圖I所示。整個反應(yīng)在無水無氧的環(huán)境中進行，將PEG、聚己內(nèi)酷、辛酸亞錫加至三頸瓶中，加入無水甲苯，于120°C下攪拌反應(yīng)24小吋，反應(yīng)完成后加入こ醚沉淀，濾餅加入少量ニ氯甲烷溶解，再用こ醚沉淀，反復(fù)三次，洗除小分子雜質(zhì)，得到PEG45-PCL3tl嵌段高分子產(chǎn)物，真空干燥，備用。將葡聚糖與こニ胺溶解于DMSO中，在60°C的油浴中反應(yīng)8天，同吋，每天補加IOmg氰基硼氫化鈉。反應(yīng)結(jié)束后，加入大量甲醇沉淀，過濾，再加水溶解、甲醇沉淀，反復(fù)三次，最后將產(chǎn)物于室溫下真空干燥，得到淡黃色還原氨化的DEX-EDA。取 DEX-EDA 與 mPEG45-PCL3Q-C00H，溶解于 20mL 的 DMSO 中，加入適量三こ胺(TEA)，攪拌，而后加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，在室溫下反應(yīng)24h。加入こ醚沉淀，產(chǎn)物加入超純水溶解，用截留分子量為10000的透析袋透析除去雜質(zhì)，_80°C預(yù)凍，凍干，得到白色粉末產(chǎn)物。其1H-NMR 圖譜如圖 2、3 所示在 1H-NMR 圖譜 1H-NMR(DMS0-d6，400MHz):其峰歸屬見圖2、圖3。在圖2中，化學位移為2. 82ppm處出現(xiàn)的峰為DEX還原氨化后的こニ胺上亞甲基的峰，而圖3中，在化學位移為4. 79ppm,4. 63ppm, 4. 87飛.12ppm處，為DEX的特征化學位移，3. 98ppm, 2. 36ppm, I. 58ppm, I. 27ppm 為 PEG-PCL-DEX 中 PCL 嵌段的化學位移，而在3. 5Ippm處，為PEG嵌段中亞甲基的化學位移。實施例2 PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA ニ元復(fù)合物的制備配制PEG (MW8000)外水相溶液，PEG的濃度為10wt%，于外水相溶液中加入基因物質(zhì)、魚精蛋白和嵌段高分子，其中，基因物質(zhì)與魚精 蛋白的質(zhì)量之和與嵌段高分子質(zhì)量之比為7 :30，基因物質(zhì)與魚精蛋白的質(zhì)量比為1:1.5。在50°C油浴下磁力攪拌24h，即可得到內(nèi)水相為protamine-DNA或siRNA復(fù)合物的載體結(jié)構(gòu)，最后，采用截留分子量為10000的透析袋透析，除去水相中留存的PEG。具體制備方法，見圖4。實施例3 PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA ニ元復(fù)合物的制備配制PEG (MW8000)外水相溶液，PEG的濃度為0. lwt%，于外水相溶液中加入基因物質(zhì)、魚精蛋白和嵌段高分子，其中，基因物質(zhì)與魚精蛋白的質(zhì)量之和與嵌段高分子質(zhì)量之比為I :0. 1，基因物質(zhì)與魚精蛋白的質(zhì)量比為0. I :1。在50°C油浴下磁力攪拌24h，即可得到內(nèi)水相為protamine-DNA或siRNA復(fù)合物的載體結(jié)構(gòu)，最后，采用截留分子量為10000的透析袋透析，除去水相中留存的PEG。具體制備方法，見圖4。實施例4 PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA ニ元復(fù)合物的制備配制PEG (MW8000)外水相溶液，PEG的濃度為20wt%，于外水相溶液中加入基因物質(zhì)、魚精蛋白和嵌段高分子，其中，基因物質(zhì)與魚精蛋白的質(zhì)量之和與嵌段高分子質(zhì)量之比為I :1000，基因物質(zhì)與魚精蛋白的質(zhì)量比為100: I。在50°C油浴下磁力攪拌24h，即可得到內(nèi)水相為protamine-DNA或siRNA復(fù)合物的載體結(jié)構(gòu)，最后，采用截留分子量為10000的透析袋透析，除去水相中留存的PEG。具體制備方法，見圖4。實施例5 PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA ニ元復(fù)合物納米顆粒的突光共定位表征按照上述方法制備PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA ニ元復(fù)合物的納米顆粒，通熒光共定位對其進行表征，具體做法如下，將小牛胸腺DNA用H0echst22258 (藍色)熒光染料標記，并同時用nile red標記嵌段高分子的疏水PCL嵌段，觀察結(jié)果見圖5，紅色(nilered)和緑色(FITC)在相同位置出現(xiàn)并重合，驗證了納米顆粒的形成。實施例6PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA ニ元復(fù)合物納米顆粒的粒徑與電位的表征通過粒徑與電位的測定對納米顆粒結(jié)果進行表征，電位的變化，經(jīng)過PEG-PCL-DEX包裹后納米顆粒的電位在OmV左右，而未經(jīng)過包裹的protamine-DNA復(fù)合物顆粒明顯帶過量正電荷，由此可以直觀證明本發(fā)明的嵌段高分子材料可以屏蔽電荷。由測定結(jié)果可得，其粒徑分布比較均勻，結(jié)果見表I。表I不同復(fù)合物的粒徑與電位變化結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)以PEG為連續(xù)相制備親水相系統(tǒng)； 2)將嵌段高分子、魚精蛋白和基因物質(zhì)加入步驟I)所制備的親水相系統(tǒng)中，攪拌或搖動，形成納米顆粒； 3)用透析袋透析除去所述納米顆粒水相中留存的PEG，即可制得包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒。
2.如權(quán)利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述親水相系統(tǒng)中PEG的濃度為O. I 20wt%。
3.如權(quán)利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述基因物質(zhì)與所述魚精蛋白的質(zhì)量之和與所述嵌段高分子質(zhì)量之比為I :O.f 1000，所述基因物質(zhì)與所述魚精蛋白的質(zhì)量比為O. Γ100 :1。
4.如權(quán)利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述透析袋的截留分子量為500(T20000Da，透析時間為6 72h。
5.如權(quán)利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述嵌段高分子包括依次連接的第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段，所述第一嵌段和所述第三嵌段為親水嵌段，所述第二嵌段為疏水嵌段。
6.如權(quán)利要求5所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述第一嵌段可選自PEG或PEO。
7.如權(quán)利要求5所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述第二嵌段可選自聚乳酸、聚乙交酯、聚乙交酯-丙交酯共聚物或聚己內(nèi)酯中的一種。
8.如權(quán)利要求5所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述第三嵌段包括蛋白親和作用力強的高分子，所述蛋白親和作用力強的高分子選自葡聚糖、麥芽糖或殼聚糖中的一種。
9.如權(quán)利要求5所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述嵌段高分子還包括靶向基團或熒光分子，所述靶向基團或所述熒光分子與所述第一嵌段連接。
10.如權(quán)利要求9所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述靶向基團可選自蛋白、多肽、抗體或小分子靶向基團的一種或幾種；所述蛋白可選自轉(zhuǎn)鐵蛋白或去唾液酸糖蛋白；所述多肽可選自RGD或胰島素；所述小分子靶向基團可選自葉酸、生物素或半乳糖的一種。
11.如權(quán)利要求9所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述熒光分子可選自羅丹明、FITC、NBD、cy5. 5或FAM的一種。
12.如權(quán)利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，在步驟2)中，可將所述魚精蛋白與所述基因物質(zhì)形成復(fù)合物后再加入步驟I)所制備的親水相系統(tǒng)中。
13.如權(quán)利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述基因物質(zhì)包括DNA或RNA。
14.如權(quán)利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，在步驟2)中，攪拌或搖動的時間為O. 5 72h。
15.如權(quán)利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述嵌段高分子的合成方法包括以下步驟 1)以mPEG-COOH為引發(fā)劑，在Sn(Oct)2的催化下，在8(Tl40°C條件下于無水甲苯中引發(fā)開環(huán)聚合，加入己內(nèi)酯，反應(yīng)進行10 72h，合成PEG45-PCL3tl嵌段； 2)將葡聚糖與乙二胺按照I:(1飛0)的摩爾比投料，即稱取葡聚糖，乙二胺，溶解于2 50mL的DMSO中，混合物在(T80°C油浴中反應(yīng)2 10天，每天加入(T50mg氰基硼氫化鈉；反應(yīng)結(jié)束后，加入大量甲醇沉淀，過濾，再加水溶解，甲醇沉淀，反復(fù)三次，最后將產(chǎn)物于室溫下真空干燥，得到淡黃色還原氨化的DEX-EDA; 3)將DEX-EDA的氨基與mPEG45-PCL3Q-C00H的羧基進行反應(yīng)，稱取DEX-EDA，加入I 10倍摩爾量的PEG-PCL，溶解于I 50mL的DMSO中，加入0 50倍摩爾量的三乙胺，攪拌I 60min后，加入(Γ50倍摩爾量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯，在(T90°C下反應(yīng)2 48h ;反應(yīng)結(jié)束后，加入乙醚沉淀，減壓抽濾，產(chǎn)物加入超純水，溶解后，用截留分子量為100(Γ20000的透析袋透析除去雜質(zhì)與未反應(yīng)的反應(yīng)物，于-2(T-200°C預(yù)凍，低溫凍干，得到白色粉末產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種包括魚精蛋白和基因物質(zhì)的納米顆粒的制備方法。本發(fā)明的制備方法，包括以下步驟1)以PEG為連續(xù)相制備親水相系統(tǒng)；2)將嵌段高分子、魚精蛋白和基因物質(zhì)加入步驟1)所制備的親水相系統(tǒng)中，攪拌或搖動，形成納米顆粒；3)用透析袋透析除去所述納米顆粒水相中留存的PEG，即可制得納米顆粒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用本發(fā)明的制備方法制成的納米顆粒，可實現(xiàn)基因物質(zhì)的輸送，并且，不存在體內(nèi)毒性和體內(nèi)免疫原性的問題，由于納米顆粒不帶電荷，還可避免體內(nèi)非靶組織的粘附，并可接枝靶向基團，實現(xiàn)體內(nèi)病變細胞靶向，從而有效提高靶向效果，且不影響體內(nèi)病變細胞的內(nèi)吞。
文檔編號C08G63/08GK102764442SQ201210248240
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者吳飛, 張奇昕, 段詩悅, 葛雪梅, 蔡云鵬, 袁偉恩, 金拓 申請人:上海交通大學