本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及結(jié)核分枝桿菌融合蛋白EAMMH、其構(gòu)建、表達(dá)和純化方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原體，是人類病原體中最能適應(yīng)人體環(huán)境的一種，它可以以潛伏狀態(tài)在人體巨噬細(xì)胞內(nèi)存在很長(zhǎng)時(shí)間。據(jù)估計(jì)，全球有20億人口被結(jié)核分枝桿菌潛伏感染，其中這一人群中有10％的人口在免疫功能低下時(shí)由潛伏期結(jié)核進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核。對(duì)于結(jié)核病的控制策略很大程度上依賴于至少三種不同抗癆藥物長(zhǎng)期的治療。其結(jié)果是，多重耐藥的不斷發(fā)展造成控制結(jié)核病的巨大障礙。在結(jié)核病發(fā)病率最高的國(guó)家，人們最為需要的并不是去獲得治療，而且許多患者對(duì)抗癆治療是無(wú)效的，顯而易見(jiàn)，研制一種新的抗結(jié)核疫苗是目前最為迫切的需要。目前所使用的結(jié)核疫苗卡介苗(BCG)，自1921年開(kāi)始應(yīng)用于臨床，是一種減毒牛結(jié)核分枝桿菌活疫苗。研究證實(shí)，它能夠有效預(yù)防新生兒和兒童患上嚴(yán)重的腦膜結(jié)核及全身粟粒性結(jié)核病，但是不能有效的防止成人肺結(jié)核的發(fā)生。繼BCG疫苗應(yīng)用80多年以來(lái)，全球尚未研制出有效的新型抗結(jié)核疫苗。因此，為了在全球范圍內(nèi)徹底消滅結(jié)核病，我們迫切需要研制更為有效的結(jié)核病新型疫苗。相關(guān)研究證實(shí)，切實(shí)有效的結(jié)核病疫苗不但要對(duì)活動(dòng)期結(jié)核病具有保護(hù)作用，而且要能夠針對(duì)潛伏期結(jié)核菌起作用。因此，理想的結(jié)核亞單位疫苗必須融合結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)期及潛伏期的多個(gè)抗原。本發(fā)明涉及結(jié)核桿菌的五個(gè)抗原：ESAT6、Ag85B、MPT64、Mtb8.4和HspX，其中ESAT6、Ag85B、MPT64和Mtb8.4四個(gè)抗原是由生長(zhǎng)期結(jié)核菌分泌，申請(qǐng)人前期以這四種生長(zhǎng)期抗原構(gòu)建了EAMM疫苗(《一種結(jié)核桿菌融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用》；公開(kāi)號(hào)：CN102180974A)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，EAMM疫苗(由結(jié)核菌生長(zhǎng)期抗原融合構(gòu)成)和含有結(jié)核菌潛伏期抗原HspX的Mtb10.4-HspX(MH)疫苗進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用時(shí)(即EAMM+MH疫苗)，MH疫苗由于含有潛伏期抗原,在一定程度上明顯增強(qiáng)了EAMM疫苗的保護(hù)效果(XinQ,NiuH,LiZ,etal.(2013)SubunitVaccineConsistingofMulti-StageAntigensHasHighProtectiveEfficacyagainstMycobacteriumtuberculosisInfectioninMice.PLoSONE8(8):e72745.doi:10.1371/journal.pone.0072745)。ESAT6、Ag85B、MPT64和Mtb8.4抗原均具有較強(qiáng)的免疫原性，且對(duì)結(jié)核分枝桿菌均據(jù)有一定的保護(hù)效果，是構(gòu)建結(jié)核疫苗的經(jīng)典抗原，其各自特性在上述所提到的EAMM專利中已有陳述。結(jié)核分枝桿菌HspX抗原屬于熱休克蛋白家族，是休眠期結(jié)核菌所分泌的主要抗原，對(duì)結(jié)核菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存起到關(guān)鍵性地作用。此外，該抗原所誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ水平在與結(jié)核病人密切接觸的醫(yī)務(wù)人員及家屬中明顯高于健康人群，提示該抗原是結(jié)核菌潛伏期的抗原且可以誘導(dǎo)Th1型的免疫應(yīng)答。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種利用基因工程的方法將HspX抗原串聯(lián)在EAMM融合蛋白的后面，構(gòu)建的新的融合蛋白EAMMH。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種結(jié)核分枝桿菌融合蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了編碼上述結(jié)核分枝桿菌融合蛋白的核苷酸。進(jìn)一步的，上述的核苷酸，其序列如序列1所示。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了包含有上述核苷酸的載體。進(jìn)一步的，上述的載體，為重組基因載體pET30a(+)-EAMMH；所述EAMMH即為核苷酸ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供了包含有上述載體的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供了上述結(jié)核分枝桿菌融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)和純化方法，是將融合抗原EAMM和單個(gè)抗原HspX進(jìn)行基因水平的融合，構(gòu)建重組載體pET30a(+)-EAMMH，再將pET30a(+)-EAMMH質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli中進(jìn)行融合蛋白EAMMH的表達(dá)，通過(guò)鹽析和柱層析的相結(jié)合的方法純化結(jié)核分枝桿菌融合蛋白。進(jìn)一步的，上述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)和純化方法，包括以下步驟：1)融合蛋白EAMMH表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-EAMMH的構(gòu)建：①構(gòu)建重組基因載體pET30a(+)-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)：以現(xiàn)有構(gòu)建成功的pET30a(+)-Mtb8.4-HspX(MH)重組基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)基因片段；引物分別為：上游引物5’-3’如序列3所示；下游引物5’-3’如序列4所示；上游5’-3’為GAAGATCTTTCGCAGTCACGAACGACGGGGTGATTAGGCTGTCGTTGACCGCA；其中斜體為BglII限制性酶切位點(diǎn)，劃線部分為MPT64第190-198為氨基酸所對(duì)應(yīng)的基因序列；下游5’-3’為T(mén)AGGCAAGCTTTCAGTTGGTGGACCGGAT，其中斜體為HindIII限制性酶切位點(diǎn)；pET30a(+)-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)載體構(gòu)建如圖9所示。以pET30a(+)-Mtb8.4-HspX(MH)質(zhì)粒為模板，以上述兩條引物，PCR擴(kuò)增出MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)融合基因產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用BglII和HindIII進(jìn)行雙酶切，克隆構(gòu)建在質(zhì)粒pET30a(+)上，構(gòu)建成pET30a(+)-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)載體；②構(gòu)建重組基因載體pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)：以現(xiàn)有構(gòu)建成功的pET30a(+)-ESAT6-Ag85B(EA)重組基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ESAT6-Ag85B(EA)基因片段；引物分別為：上游引物5’-3’如序列5所示；下游引物5’-3’如序列6所示；上游5’-3’為CGGCATATGACAGAGCAGCAGTGGAAT，其中斜體為NdeI限制性酶切位點(diǎn)；下游5’-3’為GAAGATCTGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG，其中斜體為BglII限制性酶切位點(diǎn)；pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)載體構(gòu)建圖如圖10所示。以pET30a(+)-ESAT6-Ag85B(EA)質(zhì)粒為模板，用上述兩條引物，PCR擴(kuò)增出ESAT6-Ag85B(EA)融合基因產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用NdeI和BglII進(jìn)行雙酶切，克隆構(gòu)建在質(zhì)粒pET30a(+)-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)上，構(gòu)建成pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)載體；2)融合蛋白EAMMH的表達(dá)與純化：a)融合蛋白EAMMH的表達(dá)：將上述構(gòu)建成功的pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體大腸桿菌BL21(DE3)中，活化表達(dá)EAMMH蛋白的大腸桿菌BL-21(DE3)菌體，取1ml活化后菌體加入200mlLB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)3小時(shí)10分鐘；加入1.0mmol/L的蛋白誘導(dǎo)劑IPTG100μl，25℃誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)12h；4℃10000rpm/min離心10min收集菌體；菌體重懸于PB緩沖液(Na2HPO4·12H2O20mmol/L，Na2HPO4·12H2O20mmol/L，pH7.4)10ml/g濕菌，冰浴下超聲破碎細(xì)菌1h，超聲功率為180～200W，超聲4s后停5s；10000rpm/min離心20min后分別收集上清和沉淀，將上清和沉淀分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；b)融合蛋白EAMMH上清的純化：大量表達(dá)融合蛋白EAMMH，收集的菌體重懸于20mMPB緩沖液中，冰浴下超聲破碎1h，4℃10000rpm/min離心10min，離心后收集含EAMMH蛋白的上清；上清用0.45μm濾器過(guò)濾除菌；將該融合蛋白分別以飽和度8％，6％，4％的2％的硫酸銨溶液進(jìn)行梯度鹽析；鹽析出的蛋白以含有助溶劑的20mMpH7.4的PB緩沖液進(jìn)行重懸，所述助溶劑中含有0.4％精氨酸和1M的尿素；將所收取的融合蛋白進(jìn)行分子篩層析；以凝膠過(guò)濾介質(zhì)Superdex75pregrade收集各梯度洗脫液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析得最終純化物；c)融合蛋白EAMMH沉淀的純化：先用洗滌緩沖液洗滌包涵體三次，去除包涵體以外的雜蛋白，洗滌緩沖液包含有20mMTris－HCl、0.5mol/LNaCl、2mol/L尿素和1％triton-X-100，其pH值為8.0；再用溶解緩沖液溶解包涵體30分鐘，溶解緩沖液中含有20mMTris-HCl和8M尿素，之后用0.45μm的濾器過(guò)濾去除未溶解的包涵體，將溶解完全的包涵體在透析緩沖液中進(jìn)行梯度透析復(fù)性；將透析復(fù)性之后的包涵體進(jìn)行離子交換層析和疏水層析，進(jìn)行進(jìn)一步的純化；在柱層析過(guò)程中，采用離子交換介質(zhì)DEAE和疏水介質(zhì)phneuylFF；最后，將最終的純化產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析純度。本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供了上述結(jié)核分枝桿菌融合蛋白在制備融合蛋白EAMMH亞單位疫苗中的應(yīng)用。進(jìn)一步的，上述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白在制備融合蛋白EAMMH亞單位疫苗(又名LT69)中的應(yīng)用，其特征在于，是將融合蛋白EAMMH用磷酸鹽緩沖液PBS稀釋到0.2mg/ml或0.04mg/ml；作用于Toll樣受體3的激動(dòng)劑PolyI:C用磷酸鹽緩沖液PBS溶解至0.5mg/ml；陽(yáng)離子脂質(zhì)體二甲基三十六烷基銨(DDA)用無(wú)菌蒸餾水配制成2.5mg/ml，80℃水浴10min，冷卻至室溫；取PolyI:C溶液50μl與等量EAMMH蛋白溶液充分混勻，室溫放置1min；再向混合溶液中逐滴加入100μLDDA溶液，充分乳化使疫苗呈均一的乳油狀即得到亞單位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C(LT69)，其用于免疫時(shí)的用量為200μL/只小鼠本發(fā)明的具體操作過(guò)程為：1、利用基因工程的方法將申請(qǐng)人前期所構(gòu)建的結(jié)核菌EAMM融合蛋白與結(jié)核菌潛伏期抗原HspX在基因水平進(jìn)行整合，構(gòu)建了重組基因載體pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX[pET30a(+)-EAMMH]。該重組質(zhì)粒載體融合了四個(gè)結(jié)核菌生長(zhǎng)期抗原ESAT6、Ag85B、Mtb8.4和MPT64，一個(gè)結(jié)核菌休眠期抗原HspX。2、將步驟1所述的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中表達(dá)融合蛋白EAMMH。前期所構(gòu)建的融合蛋白EAMM在表達(dá)菌株中以包涵體的形式表達(dá)，本發(fā)明將HspX抗原連接在EAMM融合蛋白之后所構(gòu)建的EAMMH融合蛋白可以在表達(dá)菌株中可溶性表達(dá)，如圖1a所示。EAMMH融合蛋白以可溶形式表達(dá)，和EAMM相比，具有性質(zhì)穩(wěn)定、易于純化、便于純化體系的放大、易于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。EAMMH可溶性表達(dá)條件為：在30℃用誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)6小時(shí)。若誘導(dǎo)溫度過(guò)高或誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)EAMMH會(huì)以包涵體形式表達(dá)，使得可溶性的EAMMH蛋白減少。3、將步驟2所述的融合蛋白EAMMH表達(dá)成功之后，運(yùn)用層析技術(shù)分別對(duì)可溶性的EAMMH和包涵體形式的EAMMH成功進(jìn)行純化：3.1可溶性EAMMH的純化方法：根據(jù)該蛋白的性質(zhì)，本發(fā)明首先將該融合蛋白用不同飽和度(8％，6％，4％，2％)的硫酸銨溶液進(jìn)行梯度鹽析；然后，鹽析出的蛋白用含有助溶劑(0.4％精氨酸，1M尿素)的20mMPB緩沖液(Na2HPO4·12H2O20mmol/L，Na2HPO4·12H2O20mmol/L，pH7.4)進(jìn)行重懸；最后，將所收取的融合蛋白進(jìn)行分子篩層析。在分子篩層析過(guò)程中選用凝膠過(guò)濾介質(zhì)Superdex75pregrade(superdex為交聯(lián)瓊脂糖和葡萄糖的符合填料；分離范圍為：3000～70000)。收集分子篩層析中不同梯度洗脫液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析最終純化產(chǎn)物，該融合蛋白經(jīng)純化后純度大于90％，如圖1b所示。3.2包涵體EAMMH的純化方法：首先，用洗滌緩沖液(20mMTris-HCl，0.5mol/LNaCl，2mol/L尿素，1％triton-X-100；pH8.0)洗滌包涵體三次，去掉包涵體以外的雜蛋白。然后，用溶解緩沖液(20mMTris-Hcl；8M尿素)溶解包涵體30分鐘，之后用0.45μm的濾器過(guò)濾去除沒(méi)有溶解的包涵體，將溶解完全的包涵體在透析緩沖液中進(jìn)行梯度透析復(fù)性。最后，將透析復(fù)性之后的包涵體進(jìn)行離子交換層析和疏水層析，進(jìn)行進(jìn)一步的純化。在柱層析過(guò)程中，選用離子交換介質(zhì)DEAE和疏水介質(zhì)phneuylFF。將最終的純化產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析純度，純化后的包涵體純度大于90％，如圖1c所示。4、將步驟3所述的純化后的融合蛋白EAMMH和佐劑按照一定比例混合構(gòu)建結(jié)核亞單位疫苗LT69。佐劑為陽(yáng)離子脂質(zhì)體二甲基三十六烷基銨(dimo-thylidioctylammoniumbromide，DDA)和PolyI:C(作用于Toll樣受體3的激動(dòng)劑)的混合物。首先，用PBS(磷酸鹽緩沖液)將純化后的EAMMH蛋白稀釋到1mg/ml，0.2mg/ml或0.04mg/ml；PolyI:C(作用于Toll樣受體3的激動(dòng)劑)用PBS溶解至0.5mg/ml；陽(yáng)離子脂質(zhì)體二甲基三十六烷基銨用無(wú)菌蒸餾水配制成2.5mg/ml，80℃水浴10min，冷卻至室溫備用。然后，分別取PolyI:C溶液50μl與等量的上述不同濃度的EAMMH蛋白溶液充分混勻，室溫放置1min。在混合溶液中逐滴加入100μLDDA溶液，然后充分乳化，使疫苗呈均一的乳油狀即得到三個(gè)不同濃度的結(jié)核亞單位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C。5、將步驟4所述的三種不同濃度的結(jié)核亞單位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C免疫小鼠，評(píng)價(jià)該疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)效果，免疫劑量為200μL/只小鼠(三個(gè)不同濃度免疫蛋白劑量分別為50μg/200μl、10μg/200μl及2μg/200μl)。小鼠分別在第0、2、4周接受疫苗免疫，分別在末次免疫后6周和24周，檢測(cè)小鼠對(duì)該疫苗的免疫反應(yīng)性。結(jié)果如圖2所示，在該疫苗末次免疫后6周，在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到高水平的抗原特異性的IFN-γ和IL-2的產(chǎn)生，說(shuō)明該疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。如圖3所示，在該疫苗末次免疫后6周，小鼠針對(duì)不同的疫苗劑量所產(chǎn)生的IFN-γ的水平?jīng)]有差異；末次后24周，接受低劑量疫苗(2μgEAMMH)免疫的小鼠所產(chǎn)生的IFN-γ的水平明顯高于10μg和50μg組的小鼠，說(shuō)明本發(fā)明的蛋白疫苗在劑量比較低時(shí)所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)持續(xù)的時(shí)間較高劑量更長(zhǎng)。此外，如圖4所示，該疫苗在免疫小鼠后6周，可在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到針對(duì)單個(gè)抗原Ag85B、ESAT6及HspX的抗體，說(shuō)明本發(fā)明的蛋白疫苗可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)結(jié)果。在疫苗末次免疫后30周，對(duì)免疫小鼠進(jìn)行經(jīng)呼吸道結(jié)核菌毒株H37Rv株的攻擊，毒株攻擊后10周檢測(cè)小鼠體內(nèi)肺臟的結(jié)核菌載量。如圖7所示，EAMMH疫苗免疫小鼠的肺臟結(jié)核菌數(shù)量明顯少于PBS對(duì)照組和BCG疫苗對(duì)照組；EAMMH疫苗所具有的對(duì)結(jié)核菌毒株的清除能力和EAMM+MH疫苗相當(dāng)。6、將步驟5所述的在小鼠體內(nèi)據(jù)有一定保護(hù)效果的結(jié)核亞單位疫苗EAMMH進(jìn)行強(qiáng)化BCG效應(yīng)的評(píng)價(jià)。在0周對(duì)小鼠免疫BCG，分別在第18和21周用EAMMH疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫兩次，在末次面以后6周進(jìn)行細(xì)胞因子和抗體水平的檢測(cè)。如圖5、圖6結(jié)果顯示，BCG初免EAMMH疫苗加強(qiáng)免疫組所產(chǎn)生的IFN-γ和抗體水平明顯優(yōu)于PBS和BCG對(duì)照組。末次加強(qiáng)免疫后13周，對(duì)小鼠進(jìn)行結(jié)核菌毒株攻擊，攻擊后10周檢測(cè)小鼠肺臟結(jié)核菌載量。如圖8結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)EAMMH加強(qiáng)免疫后可在一定程度上增強(qiáng)BCG免疫的保護(hù)效果。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明將EAMM蛋白和抗原HspX在基因水平進(jìn)行融合，構(gòu)建了新的融合蛋白EAMMH，并將該不帶標(biāo)簽的融合蛋白成功進(jìn)行表達(dá)和純化。EAMMH融合蛋白以可溶形式表達(dá)，明顯改善了EAMM以包涵體進(jìn)行表達(dá)的缺點(diǎn)。此外，EAMMH蛋白融合了結(jié)核分枝桿菌主要的生長(zhǎng)期抗原和休眠期抗原，并可誘導(dǎo)較強(qiáng)的針對(duì)各期抗原的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。小鼠結(jié)核分枝桿菌氣霧攻擊模型證明，該新的融合蛋白疫苗具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)力，優(yōu)于BCG疫苗，和EAMM+MH聯(lián)合疫苗據(jù)有相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)力；該疫苗在免疫后30周仍具有較強(qiáng)的保護(hù)效果，說(shuō)明該疫苗保護(hù)效果維持時(shí)間長(zhǎng)。本發(fā)明構(gòu)建的結(jié)核病疫苗在性質(zhì)上比較穩(wěn)定，具有易于純化、中試體系放大及后期生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)；該亞單位疫苗包含了結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)期和潛伏期的多種抗原，對(duì)不同代謝狀態(tài)的結(jié)核菌均據(jù)有防護(hù)作用，且保護(hù)效果好、保護(hù)時(shí)間長(zhǎng)，有望成為臨床結(jié)核病預(yù)防的有效疫苗。附圖說(shuō)明圖1為融合蛋白EAMMH在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中的表達(dá)純化結(jié)果。圖1a顯示為融合蛋白EAMMH的表達(dá)結(jié)果，其中，泳道M，marker；泳道1，菌體破碎后全菌夜；泳道2，菌體破碎后上清；泳道3，菌體破碎后沉淀。圖1b顯示為可溶性EAMMH的表達(dá)結(jié)果，其中，泳道M，marker；泳道1，融合蛋白EAMMH經(jīng)不同飽和度硫酸銨梯度鹽析后；泳道2、3，融合蛋白EAMMH經(jīng)鹽析后樣品再次進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析結(jié)果。圖1c顯示為包涵體EAMMH的表達(dá)結(jié)果，其中，泳道M，marker；泳道1，融合蛋白EAMMH包涵體；泳道2，離子交換層析純化后；泳道3，離子交換和疏水層析兩步純化后的EAMMH。圖2為結(jié)核亞單位疫苗EAMMH的細(xì)胞免疫原性檢測(cè)結(jié)果。將EAMMH疫苗分別在第0、2、4周免疫小鼠三次，末次免疫后6周檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞在結(jié)核特異性抗原刺激下細(xì)胞因子IFN-γ及IL-2的分泌水平。圖2a為IFN-γ的分泌水平。圖2b為IL-2的分泌水平。其中，*p<0.05vsPBS，BCG，EAMM+MH。圖3為不同劑量的結(jié)核亞單位疫苗EAMMH在不同時(shí)間點(diǎn)的免疫反應(yīng)結(jié)果。將三個(gè)劑量(低劑量、中間劑量及高劑量)的EAMMH疫苗分別在第0、2、4周免疫小鼠三次，分別在末次免疫后6周和24周進(jìn)行IFN-γ分泌水平的檢測(cè)。圖4為結(jié)核亞單位疫苗EAMMH的體液免疫原性檢測(cè)結(jié)果。將EAMMH疫苗分別在第0、2、4周免疫小鼠三次，末次免疫后6周檢測(cè)小鼠結(jié)核抗原特異性抗體水平。圖4a為抗體IgG1水平。圖4b為抗體IgG2c水平。其中，*p<0.05vsPBS，BCG。圖5為結(jié)核亞單位疫苗EAMMH強(qiáng)化BCG的細(xì)胞免疫反應(yīng)結(jié)果。小鼠在第0周進(jìn)行BCG初免，分別在第18周和21周進(jìn)行EAMMH蛋白的加強(qiáng)免疫，末次免疫后6周進(jìn)行IFN-γ分泌水平的檢測(cè)。其中，*p<0.05vsPBS，BCG。圖6為結(jié)核亞單位疫苗EAMMH強(qiáng)化BCG的體液免疫反應(yīng)結(jié)果。小鼠在第0周進(jìn)行BCG初免，分別在第18周和21周進(jìn)行EAMMH蛋白的加強(qiáng)免疫，末次免疫后6周進(jìn)行抗體分泌水平的檢測(cè)。圖6a為抗體IgG1分泌水平。圖6b為抗體IgG2c分泌水平。其中，*p<0.05vsPBS，BCG。圖7為結(jié)核亞單位疫苗的保護(hù)效果評(píng)價(jià)。將EAMMH疫苗分別在第0、2、4周免疫小鼠三次，末次免疫后30周進(jìn)行呼吸道氣霧攻擊結(jié)核菌毒株H37Rv株，攻擊后10周進(jìn)行臟器CFU計(jì)數(shù)。圖7a為疫苗清除結(jié)核菌的結(jié)果。圖7b為疫苗減輕結(jié)核菌攻擊小鼠肺臟病理?yè)p傷結(jié)果。其中，*p<0.05vsPBS,BCG；**p<0.05vsPBS,BCG，EAMM+MH。圖8為結(jié)核亞單位疫苗強(qiáng)化BCG的保護(hù)效果評(píng)價(jià)。小鼠在第0周進(jìn)行BCG初免，分別在第18周和21周進(jìn)行EAMMH蛋白的加強(qiáng)免疫，末次免疫后13周進(jìn)行結(jié)核菌毒株攻擊，攻擊后10W進(jìn)行臟器CFU計(jì)數(shù)。圖8a為疫苗清除結(jié)核菌的結(jié)果。圖8b為疫苗減輕結(jié)核菌攻擊小鼠肺臟病理?yè)p傷結(jié)果。其中，*p<0.01vsPBS。圖9為pET30a(+)-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)載體構(gòu)建圖。圖10為pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)載體構(gòu)建圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：結(jié)核分枝桿菌融合蛋白EAMMH的構(gòu)建、表達(dá)和純化：將融合抗原EAMM和單個(gè)抗原HspX進(jìn)行基因水平的融合，構(gòu)建重組載體pET30a(+)-EAMMH。由于現(xiàn)有的pET30a(+)-EAMM質(zhì)粒載體中所融合的末端抗原M基因(即Mtb8.4)存在終止密碼子UAA所對(duì)應(yīng)的堿基序列，所以不能直接的將HspX融合在EAMM后面。首先構(gòu)建pET30a(+)-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)載體，然后PCR擴(kuò)增ESAT6-Ag85B(EA)基因片段，將EA片段通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接的方法插入到pET30a(+)-MMH載體中MMH片段的前端，成功構(gòu)建成了pET30a(+)-EAMMH質(zhì)粒載體。然后，將pET30a(+)-EAMMH質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli中進(jìn)行融合蛋白EAMMH的表達(dá)。最后，根據(jù)該蛋白的蛋白特性，通過(guò)鹽析和柱層析的相結(jié)合的方法成功純化該融合蛋白。具體步驟如下：1、融合蛋白EAMMH表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-EAMMH的構(gòu)建：(1)構(gòu)建重組基因載體pET30a(+)-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)：以現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)構(gòu)建成功的pET30a(+)-Mtb8.4-HspX(MH)重組基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)基因片段。引物分別為：上游(5’-3’GAAGATCTTTCGCAGTCACGAACGACGGGGTGATTAGGCTGTCGTTGACCGCA，其中斜體為BglII限制性酶切位點(diǎn)，劃線部分為MPT64第190-198為氨基酸所對(duì)應(yīng)的基因序列)；下游(5’-3’TAGGCAAGCTTTCAGTTGGTGGACCGGAT，其中斜體為HindIII限制性酶切位點(diǎn))。以pET30a(+)-Mtb8.4-HspX(MH)質(zhì)粒為模板，用上述兩條引物，PCR擴(kuò)增出MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)融合基因產(chǎn)物。該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用BglII和HindIII進(jìn)行雙酶切，克隆構(gòu)建在質(zhì)粒pET30a(+)上，構(gòu)建成pET30a(+)-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(MMH)載體。(2)構(gòu)建重組基因載體pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)。以現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)構(gòu)建成功的pET30a(+)-ESAT6-Ag85B(EA)重組基因序列為模板,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ESAT6-Ag85B(EA)基因片段。引物分別為：上游(5’-3’CGGCATATGACAGAGCAGCAGTGGAAT，其中斜體為NdeI限制性酶切位點(diǎn))；下游(5’-3’GAAGATCTGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG，其中斜體為BglII限制性酶切位點(diǎn))。以pET30a(+)-ESAT6-Ag85B(EA)質(zhì)粒為模板，用上述兩條引物，PCR擴(kuò)增出ESAT6-Ag85B(EA)融合基因產(chǎn)物。該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用NdeI和BglII進(jìn)行雙酶切，克隆構(gòu)建在質(zhì)粒pET30a(+)-MMH上，構(gòu)建成pET30a(+)-EAMMH(ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX)載體。2、融合蛋白EAMMH的表達(dá)與純化：(1)融合蛋白EAMMH的表達(dá)：將上述構(gòu)建成功的pET30a(+)-ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-HspX(EAMMH)載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中。活化表達(dá)EAMMH蛋白的E.coliBL-21(DE3)菌體，取1ml活化后菌體加入200mlLB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)3h10mim；加入蛋白誘導(dǎo)劑IPTG(1.0mmol/L)100μl，25℃誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)12h；4℃10000rpm/min離心10min收集菌體；菌體重懸于PB緩沖液(Na2HPO4·12H2O20mmol/L，Na2HPO4·12H2O20mmol/L，pH7.4)10ml/g濕菌，冰浴下超聲破碎細(xì)菌1h(180～200W，超聲4s停5s)；10000rpm/min離心20min后分別收集上清和沉淀，將上清和沉淀分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，與BL21空菌相比，分子量在63KD左右有明顯的特異蛋白表達(dá)條帶，以上清形式表達(dá)為主，沉淀中蛋白相對(duì)較少。(2)融合蛋白EAMMH上清的純化：大量表達(dá)融合蛋白EAMMH，收集的菌體重懸于20mMPB緩沖液中，冰浴下超聲破碎1h左右，4℃/10,000rpm離心10min,離心后收集含EAMMH蛋白的上清；上清用0.45μm濾器過(guò)濾除菌。首先，將該融合蛋白用不同飽和度(8％，6％，4％，2％)的硫酸銨溶液進(jìn)行梯度鹽析；然后，鹽析出的蛋白用含有助溶劑(0.4％精氨酸，1M尿素)的20mMPB(pH7.4)進(jìn)行重懸；最后，將所收取的融合蛋白進(jìn)行分子篩層析。選用凝膠過(guò)濾介質(zhì)Superdex75pregrade(superdex為交聯(lián)瓊脂糖和葡萄糖的符合填料；分離范圍為：3000～70000)進(jìn)行純化，收集不同梯度洗脫液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析得最終純化物。(3)融合蛋白EAMMH沉淀的純化：首先，用洗滌緩沖液(20mMTris-HCl，0.5mol/LNaCl，2mol/L尿素，1％triton-X-100；pH8.0)洗滌包涵體三次，去掉包涵體以外的雜蛋白。然后，用溶解緩沖液(20mMTris-Hcl；8M尿素)溶解包涵體30分鐘，之后用0.45μm的濾器過(guò)濾去除沒(méi)有溶解的包涵體，將溶解完全的包涵體在透析緩沖液中進(jìn)行梯度透析復(fù)性。最后，將透析復(fù)性之后的包涵體進(jìn)行離子交換層析和疏水層析，進(jìn)行進(jìn)一步的純化。在柱層析過(guò)程中，選用離子交換介質(zhì)DEAE和疏水介質(zhì)phneuylFF。最后，將最終的純化產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析純度，純化后的包涵體純度大于90％。實(shí)施例2：融合蛋白EAMMH亞單位疫苗的配制：將融合蛋白EAMMH用PBS(磷酸鹽緩沖液)稀釋到0.2mg/ml或0.04mg/ml；PolyI:C(作用于Toll樣受體3的激動(dòng)劑)用PBS溶解至0.5mg/ml；陽(yáng)離子脂質(zhì)體—二甲基三十六烷基銨(dimo-thylidioctylammoniumbromide，DDA)用無(wú)菌蒸餾水配制成2.5mg/ml，80℃水浴10min，冷卻至室溫。取PolyI:C溶液50μl與等量EAMMH蛋白溶液充分混勻，室溫放置1min。在混合溶液中逐滴加入100μLDDA溶液，然后充分乳化，使疫苗呈均一的乳油狀即得到亞單位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C。該疫苗用于免疫時(shí)，用量為200μL/只小鼠。實(shí)施例3：融合蛋白EAMMH亞單位疫苗的免疫學(xué)活性檢測(cè)：1、實(shí)驗(yàn)材料：亞單位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C；卡介苗(BCG)；磷酸鹽緩沖液(PBS)；2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6小鼠；3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組(共四組)：(1)PBS；(2)BCG；(3)(EAMM+MH)-DDA/PolyI:C；(4)2μgEAMMH-DDA/PolyI:C；(5)10μgEAMMH-DDA/PolyI:C；(6)50μgEAMMH-DDA/PolyI:C；4、免疫動(dòng)物：第0周用制備好的亞單位疫苗腹股溝皮下免疫實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物一次(200μl/只)，同時(shí)免疫對(duì)照組PBS和BCG組(5×106CFU/只)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物第0周免疫后分別在第2、4周以相同劑量加強(qiáng)免疫動(dòng)物兩次；5、免疫指標(biāo)測(cè)定方法：(1)ELISPOT方法檢測(cè)小鼠分泌抗原特異性IFN-γ的水平：最后一次免疫小鼠6周和24周后，無(wú)菌分離脾臟淋巴細(xì)胞，應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(ELISPOT)技術(shù)檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞在ESAT6，Ag85B，HspX及PPD(結(jié)核菌素)刺激后IFN-γ的分泌水平；具體步驟：無(wú)菌摘除脾臟，研磨后經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，將分離出的淋巴細(xì)胞加入96孔IFN-γ預(yù)包被的ELISPOT板中，終濃度為5×106/孔，分別給予ESAT6(10μg/ml),Ag85B(5μg/ml),HspX(10μg/ml)及PPD(5μg/ml)刺激，在37℃、5％CO2條件下共同孵育48小時(shí)后，按ELISPOT操作說(shuō)明依次加入檢測(cè)抗體等試劑，洗板、顯色，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。結(jié)果顯示為：本發(fā)明的亞單位疫苗EAMMH免疫小鼠后，可誘導(dǎo)脾細(xì)胞產(chǎn)生高水平的針對(duì)結(jié)核菌特定抗原的IFN-γ水平，且明顯高于PBS組、BCG組及EAMM+MH疫苗組，如圖2a所示。此外，低劑量組的免疫反應(yīng)在末次免疫后24周的免疫反應(yīng)要高于常規(guī)劑量50μg及10μg組，如圖3所示。(2)ELISA方法檢測(cè)小鼠分泌抗原特異性IL-2的水平：小鼠末次免疫6W后無(wú)菌分離脾臟淋巴細(xì)胞，抗原Ag85B和脾細(xì)胞在24板中共同孵育68小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA方法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞在Ag85B刺激后IL-2的分泌水平。具體步驟：無(wú)菌摘除脾臟，研磨后經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。將分離出的淋巴細(xì)胞加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，終濃度為5×106，加入等體積的Ag85B蛋白溶液(5μg/ml)。在37℃、5％CO2條件下共同孵育68時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。將細(xì)胞培養(yǎng)上清加入到96孔ELISA板中，100μl/孔，按ELISA說(shuō)明依次加入檢測(cè)抗體等試劑，洗板、顯色、終止反應(yīng)、酶標(biāo)儀讀板、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求的IFN-r的數(shù)值(pg/ml)。結(jié)果顯示：本發(fā)明的融合蛋白EAMMH和佐劑聯(lián)合所構(gòu)建的亞單位疫苗所誘導(dǎo)的IL-2細(xì)胞因子的水平明顯高于PBS和BCG對(duì)照組，如圖2b所示。(3)ELISA方法檢測(cè)小鼠分泌抗原特異性抗體(IgG1，IgG2c)的水平：用ESAT6(10μg/ml)、Ag85B(5μg/ml)及HspX(10μg/ml)分別包被96孔板(100μl/well)4℃過(guò)夜；用PBST溶液300μl/well洗板5次×1min/次；從1：100開(kāi)始倍比稀釋至1：102400，加入對(duì)倍稀釋的血清樣品，37℃放置1h。洗板后，加入200μl/well的1：15000稀釋的兔抗鼠IgG1、1：10000稀釋的兔抗鼠IgG2c，37℃放置1h。洗板后，加入100μl/wellTMB顯色液，室溫避光反應(yīng)15分鐘顯色后，加入50μl/well終止液(2N的H2SO4)終止反應(yīng)；在450nm檢測(cè)OD值。結(jié)果：疫苗組小鼠產(chǎn)生的抗體水平均高于PBS和BCG對(duì)照組。此外，低劑量和高劑量的EAMMH疫苗組做產(chǎn)生的抗體水平均高于EAMM+MH疫苗組，如圖4所示。此結(jié)果顯示，本發(fā)明的融合蛋白EAMMH可刺激機(jī)體產(chǎn)生結(jié)核抗原特異性抗體，具有較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，說(shuō)明抗原融合后保留了原單個(gè)抗原ESAT6、Ag85B及HspX的免疫原性。實(shí)施例4：結(jié)核亞單位疫苗EAMMH加強(qiáng)BCG的免疫效應(yīng)：1、實(shí)驗(yàn)材料：亞單位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C；卡介苗(BCG)；磷酸鹽緩沖液(PBS)。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6小鼠；3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組(共四組)：(1)PBS；(2)：BCG；(3)：BCG初免，EAMMH-DDA/PolyI:C疫苗加強(qiáng)組；4，免疫動(dòng)物：第0周卡介苗(BCG)5×106CFU腹股溝皮下免疫動(dòng)物一次；卡介苗(BCG)初次免疫后分別在第18、21周用制備好的EAMMH亞單位疫苗腹股溝皮下加強(qiáng)免疫兩次(200μl/只)。5、免疫指標(biāo)測(cè)定方法：(1)ELISPOT方法檢測(cè)小鼠分泌抗原特異性IFN-γ的水平：末次免疫后6W，檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞在抗原ESAT6，Ag85B及HSpX的刺激下，分泌細(xì)胞因子的水平。具體方法與步驟和實(shí)施例3相同。結(jié)果顯示，BCG初免EAMMH疫苗加強(qiáng)組的小鼠所產(chǎn)生的細(xì)胞因子IFN-γ的水平明顯高于PBS和BCG對(duì)照組，說(shuō)明EAMMH疫苗強(qiáng)化了BCG免疫的細(xì)胞免疫效應(yīng)，如圖5所示。(2)ELISA方法檢測(cè)小鼠分泌抗原特異性抗體(IgG1,IgG2c)的水平：末次免疫后6周，檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞在抗原ESAT6、Ag85B及HSpX的刺激下，抗體的水平。具體方法與步驟和實(shí)施例3相同。結(jié)果顯示，BCG初免EAMMH疫苗加強(qiáng)組的小鼠所產(chǎn)生的抗體水平明顯高于PBS和BCG對(duì)照組，說(shuō)明EAMMH疫苗強(qiáng)化了BCG免疫的體液免疫效應(yīng)，如圖6所示。實(shí)施例5：結(jié)核亞單位疫苗EAMMH免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)及加強(qiáng)BCG效應(yīng)的保護(hù)效果評(píng)價(jià)：1、實(shí)驗(yàn)材料：亞單位疫苗EAMMH-DDA/PolyI:C；卡介苗(BCG)；磷酸鹽緩沖液(PBS)。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6小鼠；3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組(共四組)：(1)PBS；(2)BCG；(3)2μgEAMMH-DDA/PolyI:C；(4)10μgEAMMH-DDA/PolyI:C(5)：BCG初免，EAMMH-DDA/PolyI:C疫苗加強(qiáng)組；4、動(dòng)物免疫方法及時(shí)間點(diǎn)同實(shí)施例三及實(shí)施例四。5、保護(hù)效果的評(píng)價(jià)：疫苗免疫后，在第30周進(jìn)行了結(jié)核菌毒株H37Rv株的攻擊，攻擊方法為經(jīng)呼吸道氣霧攻擊，攻擊劑量為50-100CFU/只小鼠。毒株攻擊后10周，進(jìn)行肺臟及脾臟結(jié)核菌載量的檢測(cè)。具體方法：無(wú)菌取小鼠肺臟及脾臟，在研缽中將臟器研碎，加入2ml的PBS緩沖液，然后將該液體倍比稀釋五個(gè)或四個(gè)梯度，將每個(gè)梯度液體0.1ml接種到7H11培養(yǎng)上。37°孵箱培養(yǎng)18天，進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，本發(fā)明的結(jié)核亞單位疫苗EAMMH組的臟器結(jié)核菌載量明顯低于PBS和BCG對(duì)照組，如圖7所示；低劑量的EAMMH疫苗組臟器結(jié)核菌載量明顯低于PBS和BCG對(duì)照組及EAMM+MH疫苗組，如圖7所示。此外，BCG初次免疫的小鼠，經(jīng)EAMMH疫苗加強(qiáng)之后，可明顯提高BCG本身的保護(hù)作用，如圖8所示。最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110>蘭州大學(xué)<120>結(jié)核分枝桿菌融合蛋白EAMMH、其構(gòu)建、表達(dá)和純化方法及其應(yīng)用<210>1<211>1950<212>DNA<213>人工序列<400>1atgacagagcagcagtggaatttcgcgggtatcgaggccgcggcaagcgcaatccaggga60aatgtcacgtccattcattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagctcgca120gcggcctggggcggtagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacgcc180acggctaccgagctgaacaacgcgctgcagaacctggcgcggacgatcagcgaagccggt240caggcaatggcttcgaccgaaggcaacgtcactgggatgttcgcagaattcttctcccgg300ccggggctgccggtcgagtacctgcaggtgccgtcgccgtcgatgggccgcgacatcaag360gttcagttccagagcggtgggaacaactcacctgcggtttatctgctcgacggcctgcgc420gcccaagacgactacaacggctgggatatcaacaccccggcgttcgagtggtactaccag480tcgggactgtcgatagtcatgccggtcggcgggcagtccagcttctacagcgactggtac540agcccggcctgcggtaaggctggctgccagacttacaagtgggaaaccttcctgaccagc600gagctgccgcaatggttgtccgccaacagggccgtgaagcccaccggcagcgctgcaatc660ggcttgtcgatggccggctcgtcggcaatgatcttggccgcctaccacccccagcagttc720atctacgccggctcgctgtcggccctgctggacccctctcaggggatggggcctagcctg780atcggcctcgcgatgggtgacgccggcggttacaaggccgcagacatgtggggtccctcg840agtgacccggcatgggagcgcaacgaccctacgcagcagatccccaagctggtcgcaaac900aacacccggctatgggtttattgcgggaacggcaccccgaacgagttgggcggtgccaac960atacccgccgagttcttggagaacttcgttcgtagcagcaacctgaagttccaggatgcg1020tacaacgccgcgggcgggcacaacgccgtgttcaacttcccgcccaacggcacgcacagc1080tgggagtactggggcgctcagctcaacgccatgaagggtgacctgcagagttcgttaggc1140gccggcagatctttcgcagtcacgaacgacggggtgattatgaggctgtcgttgaccgca1200ttgagcgccggtgtaggcgccgtggcaatgtcgttgaccgtcggggccggggtcgcctcc1260gcagatcccgtggacgcggtcattaacaccacctgcaattacgggcaggtagtagctgcg1320ctcaacgcgacggatccgggggctgccgcacagttcaacgcctcaccggtggcgcagtcc1380tatttgcgcaatttcctcgccgcaccgccacctcagcgcgctgccatggccgcgcaattg1440caagctgtgccgggggcggcacagtacatcggccttgtcgagtcggttgccggctcctgc1500aacaactatgagctcatggccaccacccttcccgttcagcgccacccgcggtccctcttc1560cccgagttttctgagctgttcgcggccttcccgtcattcgccggactccggcccaccttc1620gacacccggttgatgcggctggaagacgagatgaaagaggggcgctacgaggtacgcgcg1680gagcttcccggggtcgaccccgacaaggacgtcgacattatggtccgcgatggtcagctg1740accatcaaggccgagcgcaccgagcagaaggacttcgacggtcgctcggaattcgcgtac1800ggttccttcgttcgcacggtgtcgctgccggtaggtgctgacgaggacgacattaaggcc1860acctacgacaagggcattcttactgtgtcggtggcggtttcggaagggaagccaaccgaa1920aagcacattcagatccggtccaccaactga1950<210>2<211>649<212>PRT<213>人工序列<400>2MetThrGluGlnGlnTrpAsnPheAlaGlyIleGluAlaAlaAlaSer151015AlaIleGlnGlyAsnValThrSerIleHisSerLeuLeuAspGluGly202530LysGlnSerLeuThrLysLeuAlaAlaAlaTrpGlyGlySerGlySer354045GluAlaTyrGlnGlyValGlnGlnLysTrpAspAlaThrAlaThrGlu505560LeuAsnAsnAlaLeuGlnAsnLeuAlaArgThrIleSerGluAlaGly65707580GlnAlaMetAlaSerThrGluGlyAsnValThrGlyMetPheAlaGlu859095PhePheSerArgProGlyLeuProValGluTyrLeuGlnValProSer100105110ProSerMetGlyArgAspIleLysValGlnPheGlnSerGlyGlyAsn115120125AsnSerProAlaValTyrLeuLeuAspGlyLeuArgAlaGlnAspAsp130135140TyrAsnGlyTrpAspIleAsnThrProAlaPheGluTrpTyrTyrGln145150155160SerGlyLeuSerIleValMetProValGlyGlyGlnSerSerPheTyr165170175SerAspTrpTyrSerProAlaCysGlyLysAlaGlyCysGlnThrTyr180185190LysTrpGluThrPheLeuThrSerGluLeuProGlnTrpLeuSerAla195200205AsnArgAlaValLysProThrGlySerAlaAlaIleGlyLeuSerMet210215220AlaGlySerSerAlaMetIleLeuAlaAlaTyrHisProGlnGlnPhe225230235240IleTyrAlaGlySerLeuSerAlaLeuLeuAspProSerGlnGlyMet245250255GlyProSerLeuIleGlyLeuAlaMetGlyAspAlaGlyGlyTyrLys260265270AlaAlaAspMetTrpGlyProSerSerAspProAlaTrpGluArgAsn275280285AspProThrGlnGlnIleProLysLeuValAlaAsnAsnThrArgLeu290295300TrpValTyrCysGlyAsnGlyThrProAsnGluLeuGlyGlyAlaAsn305310315320IleProAlaGluPheLeuGluAsnPheValArgSerSerAsnLeuLys325330335PheGlnAspAlaTyrAsnAlaAlaGlyGlyHisAsnAlaValPheAsn340345350PheProProAsnGlyThrHisSerTrpGluTyrTrpGlyAlaGlnLeu355360365AsnAlaMetLysGlyAspLeuGlnSerSerLeuGlyAlaGlyArgSer370375380PheAlaValThrAsnAspGlyValIleMetArgLeuSerLeuThrAla385390395400LeuSerAlaGlyValGlyAlaValAlaMetSerLeuThrValGlyAla405410415GlyValAlaSerAlaAspProValAspAlaValIleAsnThrThrCys420425430AsnTyrGlyGlnValValAlaAlaLeuAsnAlaThrAspProGlyAla435440445AlaAlaGlnPheAsnAlaSerProValAlaGlnSerTyrLeuArgAsn450455460PheLeuAlaAlaProProProGlnArgAlaAlaMetAlaAlaGlnLeu465470475480GlnAlaValProGlyAlaAlaGlnTyrIleGlyLeuValGluSerVal485490495AlaGlySerCysAsnAsnTyrGluLeuMetAlaThrThrLeuProVal500505510GlnArgHisProArgSerLeuPheProGluPheSerGluLeuPheAla515520525AlaPheProSerPheAlaGlyLeuArgProThrPheAspThrArgLeu530535540MetArgLeuGluAspGluMetLysGluGlyArgTyrGluValArgAla545550555560GluLeuProGlyValAspProAspLysAspValAspIleMetValArg565570575AspGlyGlnLeuThrIleLysAlaGluArgThrGluGlnLysAspPhe580585590AspGlyArgSerGluPheAlaTyrGlySerPheValArgThrValSer595600605LeuProValGlyAlaAspGluAspAspIleLysAlaThrTyrAspLys610615620GlyIleLeuThrValSerValAlaValSerGluGlyLysProThrGlu625630635640LysHisIleGlnIleArgSerThrAsn645<210>3<211>53<212>DNA<213>人工序列<400>3gaagatctttcgcagtcacgaacgacggggtgattaggctgtcgttgaccgca53<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4taggcaagctttcagttggtggaccggat29<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>5cggcatatgacagagcagcagtggaat27<210>6<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>6gaagatctgccggcgcctaacgaactctggag32