本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的制備方法及所用的發(fā)酵培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-dione，簡(jiǎn)稱雄烯二酮、AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(androsta-1,4-diene-3,17-dione，簡(jiǎn)稱雄二烯二酮、ADD)均是重要的甾體類藥物中間體，很多甾體激素類藥物都是以AD或ADD作為基礎(chǔ)原料進(jìn)行生產(chǎn)的。到目前為止，ADD的制備方法主要是化學(xué)合成法和微生物轉(zhuǎn)化法。由于化學(xué)合成法耗材多、污染大、成本高，所以微生物降解植物甾醇轉(zhuǎn)化法成為主流。

受限于甾醇類物質(zhì)在水溶性的培養(yǎng)基中的溶解度，微生物對(duì)甾醇的利用率低，因而導(dǎo)致發(fā)酵周期較長(zhǎng)，且AD和/或ADD的有效轉(zhuǎn)化率不高。根據(jù)這些問(wèn)題，現(xiàn)在產(chǎn)業(yè)化的AD和/或ADD的生產(chǎn)方法主要集中在雙相發(fā)酵系統(tǒng)，即有機(jī)相-水相發(fā)酵系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化完成后的產(chǎn)物集中在有機(jī)相中，水相中會(huì)懸浮極少量的AD和/或ADD，發(fā)酵結(jié)束后可以通過(guò)萃取等技術(shù)把產(chǎn)物提取出來(lái)，然后進(jìn)行純化隨后進(jìn)行結(jié)晶而最后得到結(jié)晶。然而，雙相發(fā)酵系統(tǒng)也會(huì)帶來(lái)新的問(wèn)題，比如現(xiàn)有技術(shù)中，中國(guó)專利申請(qǐng)CN1639354A的公開(kāi)實(shí)例中，發(fā)酵液中的AD和/或ADD的提取一般均是先采用分批萃取的方法，采用有機(jī)溶劑對(duì)發(fā)酵液有機(jī)相進(jìn)行多次的萃取后，再分別合并每次萃取的萃取液，整體進(jìn)行減壓回收溶劑后即得所需的AD和/或ADD的粗品。這樣的處理均需要對(duì)產(chǎn)物所在的有機(jī)相進(jìn)行萃取，而在萃取的實(shí)際操作過(guò)程中，由于對(duì)象是發(fā)酵液的粗產(chǎn)品，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象。乳化現(xiàn)象的出現(xiàn)會(huì)直接導(dǎo)致萃取效率的下降以及部分產(chǎn)物的損失，從而影響最后的收率。因此，雙相發(fā)酵系統(tǒng)一方面需要處理油回收的問(wèn)題，另一方面需要在處理發(fā)酵液時(shí)面 對(duì)發(fā)酵液含油不易處理的問(wèn)題，此外還因在萃取過(guò)程中使用了大量的有機(jī)溶劑可能導(dǎo)致環(huán)境污染。綜合前述這些問(wèn)題，本領(lǐng)域亟需對(duì)現(xiàn)有的ADD發(fā)酵提取工藝進(jìn)行改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服了現(xiàn)有技術(shù)中雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(androsta-1,4-diene-3,17-dione，簡(jiǎn)稱雄二烯二酮、ADD)的發(fā)酵提取工藝目標(biāo)產(chǎn)物損失多、收率低且提取工藝中使用有機(jī)溶劑較多從而容易造成環(huán)境污染的缺陷，而提供一種新的ADD制備方法及其所用的發(fā)酵培養(yǎng)基。

本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)探究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵工藝中，若運(yùn)用特定類型的大孔吸附樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行提取，則有望減少損失，也可以減少有機(jī)溶劑的使用量。但是樹(shù)脂的種類成百上千，并不是任意的大孔樹(shù)脂均能用于提取ADD，不僅如此，若使用常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)ADD，也不能很好地利用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行提取。為了解決上述技術(shù)難題，發(fā)明人對(duì)發(fā)酵轉(zhuǎn)化ADD的制備工藝進(jìn)行了深入的研究和改進(jìn)，最終發(fā)現(xiàn)：特定的培養(yǎng)基配合特定的分離提取方法，使用特定的吸附樹(shù)脂，同時(shí)與其他工藝步驟和條件整體協(xié)同，能夠解決上述問(wèn)題。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，發(fā)明人通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，得到了本發(fā)明的技術(shù)方案，實(shí)現(xiàn)了如上所述的技術(shù)效果，具體如下。

本發(fā)明提供一種雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的制備方法，其包括如下步驟：

(1)發(fā)酵：向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種分枝桿菌(Mycobacterium sp.)，發(fā)酵獲得發(fā)酵液，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下的組成成分：20～40g/L植物甾醇、0.5～3g/L有機(jī)酸、0.5～3g/L無(wú)機(jī)氮源、5～20g/L有機(jī)碳源、35～50g/L有機(jī)氮源、1～3g/L無(wú)機(jī)鹽A、0.1～0.5g/L無(wú)機(jī)鹽B、0.002～0.006g/L微量元素和2～4g/L助溶劑，所述的有機(jī)酸選自乙酸、丙酸、酒石酸和檸檬酸中的一種或多種，所述的無(wú)機(jī)氮源選自硫酸銨、硝酸銨、氯化銨和硝酸鈉中的一種或多種，所述的有機(jī)碳源選自葡萄糖、麥芽糖、果糖、甘油和甘露醇中的一種或多種， 所述的有機(jī)氮源選自黃豆粉、花生粉、羽毛粉和棉籽粉中的一種或多種，所述的無(wú)機(jī)鹽A選自磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉中的一種或多種，所述的無(wú)機(jī)鹽B選自硫酸鎂、硫酸鈉和硫酸鉀中的一種或多種，所述的微量元素選自硫酸亞鐵、硫酸鋅、氯化錳中的一種或多種，所述的助溶劑選自吐溫20、吐溫80、乙醇和卵磷脂中的一種或多種；

(2)粗提：破碎處理步驟(1)獲得的發(fā)酵液，固液分離取上清液，將上清液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂A填充的色譜柱，之后對(duì)色譜柱用甲醇水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，得到洗脫液I；所述的大孔吸附樹(shù)脂A的基團(tuán)為磺酸基團(tuán)，所述的大孔吸附樹(shù)脂A的孔徑為2.3～10.5nm；

(3)精提：將步驟(2)所得的洗脫液I濃縮后濕法上樣過(guò)骨架為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂填充的色譜柱，以甲醇水溶液梯度洗脫，收集洗脫液，得到洗脫液II；所述的骨架為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂的孔徑為5～20nm；

(4)將步驟(3)所得的洗脫液II濃縮結(jié)晶，再以有機(jī)溶劑溶解后重結(jié)晶，即得雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮純品，所述的有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯、乙酸丁脂和丙酮中的任一種。

步驟(1)為：發(fā)酵：向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種分枝桿菌(Mycobacterium sp.)，發(fā)酵獲得發(fā)酵液，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下的組成成分：20～40g/L植物甾醇、0.5～3g/L有機(jī)酸、0.5～3g/L無(wú)機(jī)氮源、5～20g/L有機(jī)碳源、35～50g/L有機(jī)氮源、1～3g/L無(wú)機(jī)鹽A、0.1～0.5g/L無(wú)機(jī)鹽B、0.002～0.006g/L微量元素和2～4g/L助溶劑，所述的有機(jī)酸選自乙酸、丙酸、酒石酸和檸檬酸中的一種或多種，所述的無(wú)機(jī)氮源選自硫酸銨、硝酸銨、氯化銨和硝酸鈉中的一種或多種，所述的有機(jī)碳源選自葡萄糖、麥芽糖、果糖、甘油和甘露醇中的一種或多種，所述的有機(jī)氮源選自黃豆粉、花生粉、羽毛粉和棉籽粉中的一種或多種，所述的無(wú)機(jī)鹽A選自磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉中的一種或多種，所述的無(wú)機(jī)鹽B選自硫酸鎂、硫酸鈉和硫酸鉀中的一種或多種，所述的微量元素選自硫酸亞鐵、硫酸鋅、氯化錳中的一種或多 種，所述的助溶劑選自吐溫20、吐溫80、乙醇和卵磷脂中的一種或多種。其中，較佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下的組成成分：30～35g/L植物甾醇、1.5～2.5g/L有機(jī)酸、1～2g/L無(wú)機(jī)氮源、8～15g/L有機(jī)碳源、40～45g/L有機(jī)氮源、1.5～2.5g/L無(wú)機(jī)鹽A、0.2～0.5g/L無(wú)機(jī)鹽B、0.002～0.003g/L微量元素和2.5～3.5g/L助溶劑。更佳地，33g/L植物甾醇、2g/L有機(jī)酸、1.5g/L無(wú)機(jī)氮源、10g/L有機(jī)碳源、40g/L有機(jī)氮源、2g/L無(wú)機(jī)鹽A、0.3g/L無(wú)機(jī)鹽B、0.006g/L微量元素和3g/L助溶劑。較佳地，所述的有機(jī)酸為檸檬酸。較佳地，所述的無(wú)機(jī)氮源為硫酸鋅。較佳地，所述的有機(jī)碳源為葡萄糖。較佳地，所述的有機(jī)氮源為黃豆粉。較佳地，所述的無(wú)機(jī)鹽A為磷酸二氫鈉。較佳地，所述的無(wú)機(jī)鹽B為硫酸鎂。較佳地，所述的微量元素為氯化錳和硫酸亞鐵。較佳地，所述的助溶劑為吐溫80。較佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還包括0.5～2.5g/L氨基酸，更佳地包括1.0～2.0g/L氨基酸，所述的氨基酸較佳地為選自谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸和蘇氨酸中的一種或多種，更佳地為谷氨酸。

所述的發(fā)酵為本領(lǐng)域常規(guī)所述，現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)發(fā)酵生產(chǎn)ADD的條件均可。較佳地，所述發(fā)酵的溫度為28～32℃，更佳地為30℃。所述發(fā)酵的時(shí)間較佳地為48～96小時(shí)，更佳地為72～96小時(shí)。所述發(fā)酵的溶氧量較佳地為30～80％，更佳地為50～60％。所述的分枝桿菌(Mycobacterium sp.)為本領(lǐng)域常規(guī)所述，較佳地選為Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856(購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)ATCC)。如本領(lǐng)域常規(guī)，分枝桿菌在接種之前，一般先在種子罐中進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)達(dá)到一定種齡之后再進(jìn)行接種。較佳地，所述分枝桿菌在種齡達(dá)40～50小時(shí)時(shí)進(jìn)行接種，更佳地為48小時(shí)。所述分支桿菌的接種量較佳地為3～6％，更佳地為5％，所述百分比為接種的種子液占發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比。

步驟(2)為：粗提：破碎處理步驟(1)獲得的發(fā)酵液，固液分離取上清液，將上清液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂A填充的色譜柱，之后對(duì)色譜柱用甲醇水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，得到洗脫液I；所述的大孔吸附樹(shù)脂A的基團(tuán)為磺酸基團(tuán)，所述的大孔吸附樹(shù)脂A的孔徑為2.3～10.5nm。其中，所述的破碎 處理的前處理為本領(lǐng)域常規(guī)的破碎處理的前處理，較佳地，向步驟(1)獲得的發(fā)酵液中加入有機(jī)溶劑，所述的有機(jī)溶劑為乙醇、甲醇和丙酮中的任意一種，更佳地為乙醇。所述的乙醇為本領(lǐng)域常規(guī)的乙醇，較佳地是體積百分?jǐn)?shù)為85～100％的乙醇，更佳地為體積百分?jǐn)?shù)為95％的乙醇。所述有機(jī)溶劑的添加量為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為所述發(fā)酵液體積的1～3倍。所述的破碎處理的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，較佳地為超聲或浸泡于所述的有機(jī)溶劑后攪拌，更佳地為超聲。所述超聲的時(shí)間為本領(lǐng)域常規(guī)的時(shí)間，較佳地為10～60min分鐘，更佳地為30min。較佳地，所述的大孔吸附樹(shù)脂A還滿足下列要求：孔容1.02～1.93ml/g，比表面積790～1260m²/g，含水量46～60％，濕真密度1.00～1.10g/ml，濕視密度0.60～0.75g/ml。最佳地，所述的大孔吸附樹(shù)脂A為上海華震科技有限公司生產(chǎn)的牌號(hào)為HZ-16的大孔吸附樹(shù)脂。所述的洗脫的洗脫劑為本領(lǐng)域常規(guī)的洗脫劑，能夠?qū)ιV柱進(jìn)行洗脫為即可。較佳地為甲醇水溶液。更佳地是以體積百分?jǐn)?shù)為30～95％的甲醇水溶液，并按濃度由低到高對(duì)色譜柱進(jìn)行洗脫，更佳地為體積百分?jǐn)?shù)為50％和75％的甲醇水溶液，并按濃度由低到高對(duì)色譜柱進(jìn)行洗脫。

步驟(3)為：精提：將步驟(2)所得的洗脫液I濃縮后濕法上樣過(guò)骨架為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂填充的色譜柱，以甲醇水溶液梯度洗脫，收集洗脫液，得到洗脫液II；所述的骨架為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂的孔徑為5～20nm。其中，所述的濃縮為本領(lǐng)域常規(guī)的濃縮方式，較佳地是利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮。較佳地，所述的骨架為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂還滿足下列要求：孔容1.22～2.36ml/g，比表面積350～850m²/g，含水量58～68％，濕真密度1.00～1.10g/mL，濕視密度0.60～0.75g/mL。最佳地，所述的骨架為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂為上海華震科技有限公司生產(chǎn)的牌號(hào)為HZ-20SS的大孔吸附樹(shù)脂。所述的甲醇水溶液為本領(lǐng)域常規(guī)的甲醇水溶液，較佳地是體積百分?jǐn)?shù)為60～95％的甲醇水溶液，更佳地是體積百分?jǐn)?shù)為75～95％的甲醇水溶液。

步驟(4)為：將步驟(3)所得的洗脫液II濃縮結(jié)晶，再以有機(jī)溶劑溶 解后重結(jié)晶，即得雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮純品，所述的有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯、乙酸丁脂和丙酮中的任一種。其中，所述的濃縮為本領(lǐng)域常規(guī)的濃縮方式，較佳地是利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮。

本發(fā)明提供一種用于發(fā)酵分枝桿菌(Mycobacterium sp.)產(chǎn)生雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括如下的組成成分：20～40g/L植物甾醇、0.5～3g/L有機(jī)酸、0.5～3g/L無(wú)機(jī)氮源、5～20g/L有機(jī)碳源、35～50g/L有機(jī)氮源、1～3g/L無(wú)機(jī)鹽A、0.1～0.5g/L無(wú)機(jī)鹽B、0.002～0.006g/L微量元素和2～4g/L助溶劑，所述的有機(jī)酸選自乙酸、丙酸、酒石酸和檸檬酸中的一種或多種，所述的無(wú)機(jī)氮源選自硫酸銨、硝酸銨、氯化銨和硝酸鈉中的一種或多種，所述的有機(jī)碳源選自葡萄糖、麥芽糖、果糖、甘油和甘露醇中的一種或多種，所述的有機(jī)氮源選自黃豆粉、花生粉、羽毛粉和棉籽粉中的一種或多種，所述的無(wú)機(jī)鹽A選自磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉中的一種或多種，所述的無(wú)機(jī)鹽B選自硫酸鎂、硫酸鈉和硫酸鉀中的一種或多種，所述的微量元素選自硫酸亞鐵、硫酸鋅、氯化錳中的一種或多種，所述的助溶劑選自吐溫20、吐溫80、乙醇和卵磷脂中的一種或多種。

較佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下的組成成分：30～35g/L植物甾醇、1.5～2.5g/L有機(jī)酸、1～2g/L無(wú)機(jī)氮源、8～15g/L有機(jī)碳源、40～45g/L有機(jī)氮源、1.5～2.5g/L無(wú)機(jī)鹽A、0.2～0.5g/L無(wú)機(jī)鹽B、0.002～0.003g/L微量元素和2.5～3.5g/L助溶劑。更佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下的組成成分：33g/L植物甾醇、2g/L有機(jī)酸、1.5g/L無(wú)機(jī)氮源、10g/L有機(jī)碳源、40g/L有機(jī)氮源、2g/L無(wú)機(jī)鹽A、0.3g/L無(wú)機(jī)鹽B、0.006g/L微量元素和3g/L助溶劑。較佳地，所述的有機(jī)酸為檸檬酸。較佳地，所述的無(wú)機(jī)氮源為硫酸銨。較佳地，所述的有機(jī)碳源為葡萄糖。較佳地，所述的有機(jī)氮源為黃豆粉。較佳地，所述的無(wú)機(jī)鹽A為磷酸二氫鈉。較佳地，所述的無(wú)機(jī)鹽B為硫酸鎂。較佳地，所述的微量元素為氯化錳和硫酸亞鐵。較佳地，所述的助溶劑為吐溫80。較佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還包括0.5～2.5g/L氨基酸，更佳地包括1.0～2.0g/L氨基酸，所述的氨基酸較佳地為選自谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸和蘇氨酸中的 一種或多種，更佳地為谷氨酸。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明通過(guò)改進(jìn)培養(yǎng)基，利用表面活性劑將底物懸浮在發(fā)酵培養(yǎng)基中，借助底物和產(chǎn)物在水中的溶解度差異使生物轉(zhuǎn)化的作用能夠持續(xù)地進(jìn)行。同時(shí)由于沒(méi)有添加有機(jī)相，發(fā)酵液可以直接通過(guò)有機(jī)溶劑進(jìn)行抽提，得到澄清的濾液，便于后續(xù)大孔樹(shù)脂的操作。此外選擇特殊的大孔吸附樹(shù)脂對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行提取，該大孔吸附樹(shù)脂可以進(jìn)行循環(huán)利用節(jié)省生產(chǎn)成本，處理簡(jiǎn)單。并且本發(fā)明全面改進(jìn)了ADD的發(fā)酵提取工藝，在發(fā)酵液抽提以及大孔吸附樹(shù)脂洗脫過(guò)程中產(chǎn)品的損失極少，從而使得發(fā)酵產(chǎn)物純度高、得率高；提取過(guò)程使用的有機(jī)溶劑較少，更加環(huán)保。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。

下述實(shí)施例中部分材料和試劑的來(lái)源如下：

大孔吸附樹(shù)脂HZ-16：購(gòu)自上海華震科技有限公司。

大孔吸附樹(shù)脂HZ-20SS：購(gòu)自購(gòu)自上海華震科技有限公司。

色譜柱：Welchrom-C18，5μm，4.6×250mm，購(gòu)自Welchrom公司。

分支桿菌(Mycobacterium sp.)菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，購(gòu)自ATCC。

實(shí)施例1ADD的發(fā)酵提取

(1)發(fā)酵：向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種菌株Mycobaterium fortuituunsubsp.ATCC 35856，接種量為5％，所述百分比為占發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比，接種時(shí)種子液的種齡為48小時(shí)菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，30℃ 條件下發(fā)酵96小時(shí)獲得發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程控制溶氧量為60％。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括33g/L植物甾醇、2g/L檸檬酸、1.5g/L硫酸銨、10g/L葡萄糖、40g/L黃豆粉、2g/L磷酸二氫鈉、0.0002g/L硫酸鋅、0.2g/L硫酸鎂、0.0002g/L氯化錳、0.002g/L硫酸亞鐵、3g/L吐溫80、1g/L谷氨酸和1g/L甘氨酸。

(2)粗提：向步驟(1)獲得的發(fā)酵液中加入2倍體積95％(v/v)的乙醇，超聲處理30min后，過(guò)濾除去菌體和蛋白沉淀，取上清液。室溫下，采用直徑和柱高比(徑高比)為1∶5的大孔吸附色譜，填充預(yù)處理過(guò)的HZ-16樹(shù)脂，將所得上清液以1mL/min的流速上樣，加于大孔吸附色譜柱上吸附ADD，硅膠GF254薄層(展開(kāi)劑石油醚∶乙酸乙酯為6∶4，噴20％硫酸溶液后再100℃加熱10min后顯色，ADD呈紅色，Rf在0.3，或與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，所述百分比為質(zhì)量百分比)或高效液相(流動(dòng)相甲醇∶水為75∶25，流速0.8mL/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm)檢測(cè)柱下流份。直至有ADD斑點(diǎn)或有對(duì)應(yīng)峰出現(xiàn)時(shí)表明已經(jīng)完全吸附。吸附完全后，先以適量水洗脫(5mL/min)一遍樹(shù)脂柱除雜，廢棄流份，之后依次使用體積百分?jǐn)?shù)為50％和75％的甲醇水溶液對(duì)色譜柱進(jìn)行梯度洗脫(1mL/min)，收集洗脫液，得到洗脫液I；

(3)精提：將步驟(2)所得的洗脫液I濃縮后濕法上樣過(guò)大孔吸附樹(shù)脂HZ-20SS填充的色譜柱，以體積百分?jǐn)?shù)為75％甲醇水溶液洗脫，洗脫速度為2BV/h，1BV后ADD開(kāi)始流出，收集1BV后的洗脫液，得到洗脫液II。

(4)將步驟(3)所得的洗脫液II濃縮結(jié)晶，再以60℃的乙酸丁酯溶解后再結(jié)晶，即得無(wú)色透明的ADD純品結(jié)晶，純度為98.11％，回收率為82.37％。

本實(shí)施例中，大孔樹(shù)脂的預(yù)處理過(guò)程為：將準(zhǔn)備裝柱使用的新樹(shù)脂，用2倍左右體積的甲醇浸泡2小時(shí)，并不時(shí)攪動(dòng)，使樹(shù)脂充分溶脹。將已充分溶脹的吸附樹(shù)脂裝柱，以每小時(shí)3倍床層體積的流速，將5倍的甲醇通過(guò)樹(shù)脂層，至流出液加水稀釋不變混。甲醇處理后，以每小時(shí)6倍床層體積的流速將去離子水流過(guò)樹(shù)脂層，置換出甲醇即可投入使用。

對(duì)于剛使用過(guò)的樹(shù)脂，用水沖至沒(méi)有醇味即可再次重復(fù)利用。

實(shí)施例2ADD的發(fā)酵提取

(1)發(fā)酵，包括發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵過(guò)程均同實(shí)施例1。

(2)粗提：向步驟(1)獲得的發(fā)酵液中加入1倍體積95％(v/v)的乙醇，超聲處理10min后，過(guò)濾除去菌體和蛋白沉淀，取上清液。室溫下，采用直徑和柱高比(徑高比)為1∶5的大孔吸附色譜，填充預(yù)處理過(guò)的HZ-16樹(shù)脂，將所得上清液以1mL/min的流速上樣，加于大孔吸附色譜柱上吸附ADD，硅膠GF254薄層(展開(kāi)劑石油醚∶乙酸乙酯為6∶4，噴20％硫酸溶液后再100℃加熱10min后顯色，ADD呈紅色，Rf在0.3，或與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，所述的百分比為質(zhì)量百分比)或高效液相(流動(dòng)相甲醇∶水為75∶25，流速0.8mL/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm)檢測(cè)柱下流份。直至有ADD斑點(diǎn)或有對(duì)應(yīng)峰出現(xiàn)時(shí)表明已經(jīng)完全吸附。吸附完全后，先以適量水洗脫(5mL/min)一遍樹(shù)脂柱除雜，廢棄流份，之后依次使用體積百分?jǐn)?shù)為75％和95％的甲醇水溶液對(duì)色譜柱進(jìn)行梯度洗脫(1mL/min)，收集洗脫液，得到洗脫液I；

(3)精提：將步驟(2)所得的洗脫液I濃縮后濕法上樣過(guò)大孔吸附樹(shù)脂HZ-20SS填充的色譜柱，以體積百分?jǐn)?shù)為95％甲醇水溶液洗脫，洗脫速度為2BV/h，1BV后ADD開(kāi)始流出，收集1BV后的洗脫液，得到洗脫液II。

(4)將步驟(3)所得的洗脫液II濃縮結(jié)晶，再以60℃的乙酸丁酯溶解后再結(jié)晶，即得無(wú)色透明的ADD純品結(jié)晶，純度為97.34％，回收率為83.34％。

實(shí)施例3

(1)發(fā)酵：向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接種量為3％，所述的百分比為占發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比，接種時(shí)種子液的種齡為40小時(shí)菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，32℃條件下發(fā)酵72小時(shí)獲得發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程控制溶氧量為50％。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括30g/L植物甾醇、0.5g/L酒石酸、1g/L乙 酸、1g/L硝酸銨、4g/L麥芽糖、4g/L果糖、30g/L黃豆粉、10g/L羽毛粉、0.75g/L磷酸二氫鉀、0.75g/L磷酸氫二鉀、0.3g/L硫酸鎂、0.00025g/L氯化錳、0.0025g/L硫酸亞鐵、2.5g/L吐溫20、0.25g/L谷氨酸、0.25g/L脯氨酸、0.25g/L甘氨酸和0.25g/L蘇氨酸。

(2)粗提：向步驟(1)獲得的發(fā)酵液中加入3倍體積85％(v/v)的乙醇，超聲處理60min后，過(guò)濾除去菌體和蛋白沉淀，取上清液。室溫下，采用直徑和柱高比(徑高比)為1∶5的大孔吸附色譜，填充預(yù)處理過(guò)的HZ-16樹(shù)脂，將所得上清液以1mL/min的流速上樣，加于大孔吸附色譜柱上吸附ADD，硅膠GF254薄層(展開(kāi)劑石油醚∶乙酸乙酯為6∶4，噴20％硫酸溶液后再100℃加熱10min后顯色，ADD呈紅色，Rf在0.3，或與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，所述百分比為質(zhì)量百分比)或高效液相(流動(dòng)相甲醇∶水為75∶25，流速0.8mL/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm)檢測(cè)柱下流份。直至有ADD斑點(diǎn)或有對(duì)應(yīng)峰出現(xiàn)時(shí)表明已經(jīng)完全吸附。吸附完全后，先以適量水洗脫(5mL/min)一遍樹(shù)脂柱除雜，廢棄流份，之后依次使用體積百分?jǐn)?shù)為30％和95％的甲醇水溶液對(duì)色譜柱進(jìn)行梯度洗脫(1mL/min)，收集洗脫液，得到洗脫液I；

(3)精提：將步驟(2)所得的洗脫液I濃縮后濕法上樣過(guò)大孔吸附樹(shù)脂HZ-20SS填充的色譜柱，以體積百分?jǐn)?shù)為60％甲醇水溶液洗脫，洗脫速度為2BV/h，1BV后ADD開(kāi)始流出，收集1BV后的洗脫液，得到洗脫液II。

(4)將步驟(3)所得的洗脫液II濃縮結(jié)晶，再以60℃的乙酸丁酯溶解后再結(jié)晶，即得無(wú)色透明的ADD純品結(jié)晶，純度為95.12％，回收率為80.31％。

實(shí)施例4

(1)發(fā)酵：向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種菌株Mycobaterium fortuituunsubsp.ATCC 35856，接種量為6％，所述的百分比為占發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比，接種時(shí)種子液的種齡為50小時(shí)菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，28℃條件下發(fā)酵96小時(shí)獲得發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程控制溶氧量為80％。所述的發(fā)酵 培養(yǎng)基包括35g/L植物甾醇、2g/L檸檬酸、0.5g/L丙酸、0.5g/L硫酸銨、0.5g/L硝酸銨、0.5g/L氯化銨、0.5g/L硝酸鈉、0.5g/L硫酸鎂、5g/L葡萄糖、5g/L甘油糖、5g/L甘露醇、45g/L棉籽粉、1.25g/L磷酸二氫鈉、1.25g/L磷酸氫二鈉、0.0003g/L氯化錳、0.005g/L硫酸亞鐵、3.5g/L卵磷脂、0.25g/L谷氨酸、0.25g/L脯氨酸。

(2)、粗提：使用大孔吸附樹(shù)脂A進(jìn)行粗提，大孔吸附樹(shù)脂A的基團(tuán)為磺酸基團(tuán)，孔徑為2.3nm、孔容1.02ml/g、比表面積790m²/g、含水量46％、濕真密度(g/ml)1.00和濕視密度(g/ml)0.60。

(3)、精提：使用骨架為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行精提，骨架為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂孔徑為5nm，孔容1.22ml/g、比表面積350m²/g、含水量58％、濕真密度(g/mL)1.00和濕視密度(g/mL)0.60。

其余步驟同實(shí)施例1，得無(wú)色透明的ADD純品結(jié)晶，純度為93.21％，回收率為76.13％。

實(shí)施例5

(1)發(fā)酵：向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接種量為5％，所述的百分比為占發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比，接種時(shí)種子液的種齡為48小時(shí)菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，30℃條件下發(fā)酵96小時(shí)獲得發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程控制溶氧量為50％。20g/L植物甾醇、0.5g/L檸檬酸、0.5g/L硫酸銨、5g/L葡萄糖、35g/L黃豆粉、0.1g/L硫酸鎂、0.0002g/L氯化錳、0.003g/L硫酸亞鐵、1g/L磷酸二氫鈉、0.0001g/L硫酸鋅和3g/L吐溫80。

(2)、粗提：使用大孔吸附樹(shù)脂A進(jìn)行粗提，大孔吸附樹(shù)脂A的基團(tuán)為磺酸基團(tuán)，孔徑為10.5nm、孔容1.93ml/g、比表面積1260m²/g、含水量60％、濕真密度(g/ml)1.10和濕視密度(g/ml)0.75。

(3)、精提：使用骨架為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行精提，骨架為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂孔徑為20nm，孔容2.36ml/g、比表面積850m²/g、含水量68％、濕真密度(g/mL)1.10和濕視密度(g/mL)0.75。

其余步驟同實(shí)施例1，得無(wú)色透明的ADD純品結(jié)晶，純度為96.65％，回收率為84.12％。

實(shí)施例6

(1)發(fā)酵：向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接種量為5％，所述的百分比為占發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比，接種時(shí)種子液的種齡為48小時(shí)菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，30℃條件下發(fā)酵96小時(shí)獲得發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程控制溶氧量為50％。40g/L植物甾醇、3g/L檸檬酸、3g/L硫酸銨、20g/L葡萄糖、50g/L黃豆粉、0.3g/L硫酸鎂、0.0001g/L氯化錳、0.006g/L硫酸亞鐵、3g/L磷酸二氫鈉、0.00015g/L硫酸鋅和4g/L吐溫80。

(2)、粗提：使用大孔吸附樹(shù)脂A進(jìn)行粗提，大孔吸附樹(shù)脂A的基團(tuán)為磺酸基團(tuán)，孔徑為3nm、孔容1.50ml/g、比表面積1000m²/g、含水量50％、濕真密度(g/ml)1.05和濕視密度(g/ml)0.65。

(3)、精提：使用骨架為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行精提，骨架為苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附樹(shù)脂孔徑為10nm，孔容2.00ml/g、比表面積600m²/g、含水量60％、濕真密度(g/mL)1.05和濕視密度(g/mL)0.70。

其余步驟同實(shí)施例1，得無(wú)色透明的ADD純品結(jié)晶，純度為95.27％，回收率為85.29％。

實(shí)施例7

(1)發(fā)酵：向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種菌株Mycobaterium fortuituunsubsp.ATCC 35856，接種量為5％，所述的百分比為占發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比，接種時(shí)種子液的種齡為48小時(shí)菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，30℃條件下發(fā)酵96小時(shí)獲得發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程控制溶氧量為50％。40g/L植物甾醇、3g/L檸檬酸、3g/L硫酸銨、20g/L葡萄糖、50g/L黃豆粉、0.3g/L硫酸鎂、0.0005g/L氯化錳、0.005g/L硫酸亞鐵、3g/L磷酸二氫鈉、0.00015g/L硫酸鋅和4g/L吐溫80。

其余步驟同實(shí)施例1，得無(wú)色透明的ADD純品結(jié)晶，純度為93.15％， 回收率為79.83％。

實(shí)施例8

(1)發(fā)酵：向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接種量為5％，所述的百分比為占發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比，接種時(shí)種子液的種齡為48小時(shí)菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，30℃條件下發(fā)酵96小時(shí)獲得發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程控制溶氧量為50％。40g/L植物甾醇、3g/L檸檬酸、3g/L硫酸銨、20g/L葡萄糖、50g/L黃豆粉、0.15g/L硫酸鎂、0.15g/L硫酸鈉、0.0005g/L氯化錳、0.005g/L硫酸亞鐵、3g/L磷酸二氫鈉、0.00015g/L硫酸鋅和4g/L吐溫80。

其余步驟同實(shí)施例1，得無(wú)色透明的ADD純品結(jié)晶，純度為94.43％，回收率為75.18％。

實(shí)施例9

(1)發(fā)酵：向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接種量為5％，所述的百分比為占發(fā)酵培養(yǎng)基的體積百分比，接種時(shí)種子液的種齡為48小時(shí)菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，30℃條件下發(fā)酵96小時(shí)獲得發(fā)酵液，發(fā)酵過(guò)程控制溶氧量為50％。40g/L植物甾醇、3g/L檸檬酸、3g/L硫酸銨、20g/L葡萄糖、50g/L黃豆粉、0.1g/L硫酸鎂、0.1g/L硫酸鈉、0.1g/L硫酸鉀、0.0005g/L氯化錳、0.005g/L硫酸亞鐵、3g/L磷酸二氫鈉、0.00015g/L硫酸鋅和4g/L吐溫80。

其余步驟同實(shí)施例1，得無(wú)色透明的ADD純品結(jié)晶，純度為89.12％，回收率為75.31％。

對(duì)比例1

本對(duì)比例的發(fā)酵提取方法基本同實(shí)施例1，不同的是在發(fā)酵液經(jīng)過(guò)步驟(2)中乙醇粗提過(guò)濾得到濾液后，用中等極性的HZ-806樹(shù)脂進(jìn)行吸附。結(jié)果表明，即使在1ml/min的流速上樣的情況下，仍然有大量的ADD流出，ADD的吸附效果很差。

對(duì)比例2

本對(duì)比例的發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基為包括33g/L植物甾醇、2g/L檸檬酸、1.5g/L硫酸銨、10g/L葡萄糖、40g/L黃豆粉、2g/L磷酸二氫鈉、0.0008g/L硫酸鋅、0.3g/L硫酸鎂、0.0005g/L氯化錳、0.005g/L硫酸亞鐵。其余的操作步驟與實(shí)施例1完全相同。結(jié)果表明，即使在1ml/min的流速上樣的情況下，仍然有大量的ADD流出，ADD的吸附效果很差。

對(duì)比例3

本對(duì)比例的發(fā)酵提取方法基本同實(shí)施例1，不同的是在步驟(3)中使用NM100樹(shù)脂進(jìn)行精提，所得產(chǎn)物ADD純度僅為85％。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不構(gòu)成對(duì)權(quán)利要求范圍的限制，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以想到的其他實(shí)質(zhì)上等同的替代，均在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。