本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種牛、羊的布魯氏菌的多重PCR檢測方法。

背景技術(shù)：

牛羊布魯氏菌病是由布魯氏菌(Brucella)引起的危害嚴(yán)重的人畜共患傳染病，患病動物是主要傳染源，該病廣泛分布于世界各地，在許多國家均有不同程度的流行。

臨床上該病主要引起家畜的生殖系統(tǒng)炎癥、流產(chǎn)，人則表現(xiàn)為波浪熱、寒顫、頭痛、全身疼痛、疲勞、關(guān)節(jié)炎等非特異性癥狀，該病的傳染源主要是發(fā)病及帶菌的牛、羊等，感染動物首先在同種動物間傳播，造成帶菌或發(fā)病，隨后波及人類。布魯氏菌可經(jīng)呼吸、消化、生殖系統(tǒng)粘膜及損傷甚至未損傷的皮膚等多種途徑，通過接觸或食入感染動物的分泌物、體液等發(fā)生侵入感染。

布魯氏菌病的診斷是布魯氏菌病的研究重點和難點，目前，確診布魯氏菌病的金標(biāo)準(zhǔn)是對病原菌的分離鑒定，但其對病原的分離率偏低，并且需要一定的生物安全防護措施且監(jiān)測時間長。虎紅平板凝集試驗(RBPT)是我國法定的檢測方法，但也不適于牧場的快速檢測。因此，需要研究一種快速、特異、靈敏的PCR檢測方法，以應(yīng)用到布魯氏菌病的診斷中。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速、特異的牛、羊的布魯氏菌的多重PCR檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種牛、羊的布魯氏菌的多重PCR檢測方法，包括以下步驟：

1)待檢測樣品DNA的提??；

2)引物對的設(shè)計：應(yīng)用Primer 5.0軟件分別設(shè)計布魯氏菌屬特異性引物和牛、羊種布魯氏菌特異性引物，具體的引物序列如下：

布魯氏菌屬特異性引物：

上游引物：F1：5’-CGC TTG CCT TTC AGG TCTG-3’，如SEQ ID NO：1所示；

下游引物：R1：5’-TGG CTC GGT TGC CAA TATCA-3’，如SEQ ID NO：2所示；

牛、羊種布魯氏菌特異性引物：

牛上游引物：F2：5’-ATC AGG ACA AGG ACG AACG-3’，如SEQ ID NO：3所示；

羊上游引物：F3：5’-GAT AAT CAT CCA CCA CCT TG-3’，如SEQ ID NO：4所示；

公用下游引物：R2：5’-GCT GCG AAT AAA GCC AAC-3’，如SEQ ID NO：5所示；

3)配置多重PCR反應(yīng)體系，進行多重PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，進行1％的瓊脂糖凝膠電泳；所述的1％的瓊脂糖凝膠中，瓊脂糖：凝膠的質(zhì)量體積比為0.01g/ml；

4)檢測結(jié)果分析：被檢樣品擴增出大小為222bp、615bp的目的條帶，表明該樣品中牛種布魯氏菌陽性；被檢樣品擴增出大小為222bp、932bp的目的條帶，表明該樣品中羊種布魯氏菌陽性；被檢樣品同時擴增出大小為222bp、615bp、932bp的目的條帶，表明該樣品中牛種布魯氏菌和羊種布魯氏菌均陽性。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述的多重PCR反應(yīng)體系包括：引物F1、引物R1各1.5μL，引物F2為1.5μL，引物F3為2μL，引物R2為4μL，待檢測樣品DNA 1μL，Taq酶1μL，GC Enhancer 5μL，dNTP 4μL，10×PCR Buffer 5μL，ddH₂O補滿50μL。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述的引物的濃度配比為10pmol/μL。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述的dNTP的濃度為2.5mmol/L。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述的多重PCR反應(yīng)的條件為：94℃預(yù)變性10min，94℃變性50s，56℃退火50s，72℃延伸90sec，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。

作為本發(fā)明進一步的方案：在反應(yīng)結(jié)束后，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明建立了一種快速的能同時檢測牛、羊的布魯氏菌的多重PCR診斷方法，其所設(shè)計的引物對具有較高的特異性和交叉特異性，可以被廣泛應(yīng)用到牛、羊布魯氏菌病的診斷中。

附圖說明

圖1是引物特異性的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；a泳道依次為牛、羊種布魯氏菌通用布魯氏菌屬引物對牛種布魯氏菌的PCR；b泳道依次為牛、羊種布魯氏菌通用布魯氏菌屬引物對羊種布魯氏菌的PCR；c泳道為牛種布魯氏菌牛種特異性引物對牛種布魯氏菌的PCR；d泳道為羊種布魯氏菌羊種特異性引物對羊種布魯氏菌的PCR；e泳道為空白對照；

圖2是引物交叉特異性的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；a泳道為牛種布魯氏菌牛種特異性引物對牛種布魯氏菌的PCR；b泳道為牛種布魯氏菌牛種特異性引物對羊種布魯氏菌的PCR；c泳道為羊種布魯氏菌牛種特異性引物對牛種布魯氏菌的PCR；d泳道為羊種布魯氏菌牛種特異性引物對羊種布魯氏菌的PCR；e泳道為空白對照；

圖3是本發(fā)明多重PCR擴增的電泳圖；其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；a泳道為牛種布魯氏菌的多重PCR；b泳道為羊種布魯氏菌的多重PCR；c泳道為牛、羊種布魯氏菌混合物的多重PCR；d泳道為空白對照；

圖4是本發(fā)明檢測乳樣的電泳圖；其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；a泳道為陽性對照PCR；b～t泳道分別為乳樣1～19的PCR；u泳道為空白對照。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明實施例中，一種牛、羊的布魯氏菌的多重PCR檢測方法，首先根據(jù)GenBank登錄的BCPS31基因序列和IS711在牛、羊種布魯氏菌基因組中插入位置的不同，應(yīng)用Primer 5.0軟件分別設(shè)計布魯氏菌屬特異性引物和牛、羊種布魯氏菌特異性引物。

布魯氏菌屬特異性引物(222bp)：

上游引物：F1：5’-CGC TTG CCT TIC AGG TCTG-3’，如SEQ ID NO：1所示；

下游引物：R1：5’-TGG CTC GGT TGC CAA TATCA-3’，如SEQ ID NO：2所示。

牛、羊種布魯氏菌特異性引物(615bp、932bp)：

牛上游引物：F2：5’-ATC AGG ACA AGG ACG AACG-3’，如SEQ ID NO：3所示；

羊上游引物：F3：5’-GAT AAT CAT CCA CCA CCT TG-3’，如SEQ ID NO：4所示；

公用下游引物：R2：5’-GCT GCG AAT AAA GCC AAC-3’，如SEQ ID NO：5所示。

請參閱圖1～4，本發(fā)明從以下具體實施步驟進行試驗：

1、引物特異性驗證

用布魯氏菌屬引物擴增牛、羊種布魯氏菌的基因組DNA模板，用牛種布魯氏菌的引物擴增牛種布魯氏菌的基因組DNA模板，用羊種布魯氏菌的引物擴增羊種布魯氏菌的基因組DNA模板。

PCR反應(yīng)體系(50μL)：上下游引物各2μL(10pmol/μL)，模板DNA 2μL，Taq酶1μL，dNTPs(2.5m Mg)4μL，10×PCR Buffer 5μL，ddH₂O補滿至50μL。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，58℃退火50s，72℃延伸90sec，共35個循環(huán)。72℃延伸10min。4℃保存。取5μL PCR產(chǎn)物，進行1％的瓊脂糖凝膠電泳。

2、引物交叉特異性分析

用牛種布魯氏菌的引物分別擴增牛、羊種布魯氏菌的基因組DNA模板，觀察牛種布魯氏菌的引物是否特異性擴增牛種布魯氏菌；同時，用羊種布魯氏菌的引物分別擴增牛、羊種布魯氏菌的基因組DNA模板，觀察羊種布魯氏菌的引物是否特異性擴增羊種布魯氏菌。

反應(yīng)條件同上。

3、多重PCR條件優(yōu)化

分別對Taq酶、PCR Buffer和dNTP的用量，引物濃度配比，PCR反應(yīng)的退火溫度(50～60℃)，及循環(huán)數(shù)(25～40個)進行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。

4、結(jié)果

(1)引物特異性的擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1所示，由圖可知：本發(fā)明所設(shè)計的三 對引物均具有較高的特異性。

(2)引物交叉特異性的擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖2所示，由圖可知：本發(fā)明所設(shè)計的三對引物均具有較高的交叉特異性。

(3)多重PCR條件優(yōu)化結(jié)果如下：

最終確定多重PCR最佳反應(yīng)體系為：引物(10pmol/μL)F1、R1各1.5μL、F2為1.5μL、F3為2μL、R2為4μL，牛、羊種布魯菌基因組DNA模板各1μL(檢測臨床樣品時根據(jù)所提核算濃度靈活掌握)，Taq酶1μL，GC Enhancer 5μL，dNTP(2.5mmol)4μL，10×PCR Buffer 5μL，ddH₂O補滿50μL。

最終確定最佳反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10min，94℃變性50s，56℃退火50s，72℃延伸90sec，共35個循環(huán)。72℃延伸10min。4℃保存。

在上述多重PCR最佳反應(yīng)體系以及最佳反應(yīng)條件下，分別將牛種布魯氏菌、羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌與羊種布魯氏菌混合物作為模板，在每個擴增體系中均同時加入引物對，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖3所示。由圖可知，在以牛種布魯氏菌、羊種布魯氏菌為模板的擴增產(chǎn)物中，均可以得到兩條特異性條帶；在以牛種布魯氏菌與羊種布魯氏菌混合物為模板的擴增產(chǎn)物中，可以得到三條特異性條帶；說明利用本發(fā)明的引物組進行多重PCR可以用于對牛種布魯氏菌、羊種布魯氏菌進行同步檢測，并且，檢測結(jié)果精確可信。

(4)驗證：

用建立的多重PCR方法對19份乳樣(布魯氏菌病血清抗體虎紅平板凝集、試管凝集檢測均為陽性的牛乳樣)的核酸提取物按照上述方法進行擴增，擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖4所示。由圖可知，19份均為布魯氏菌屬PCR陽性，其中15份(1、2、4、5、6、7、10～18)為牛種布魯氏菌，4份(3、8、9、19)為其他種布魯菌。

5、分析

用所建立的多重PCR方法對19份乳樣(布魯氏菌病血清抗體虎紅平板凝集、試管凝集均為陽性)的核酸提取物進行擴增，所有樣品均檢出布魯氏菌屬陽性，部分樣品檢出牛 種布魯氏菌陽性，未檢出羊種布魯氏菌陽性樣品，因此該檢測方法有一定的使用價值。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。