本發(fā)明涉及高分子材料和生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種pH敏感光交聯(lián)的聚乙二醇空心球、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

聚合物納米空心球作為一種新型給藥系統(tǒng)，在藥學(xué)領(lǐng)域有著和一般納米載藥系統(tǒng)相同的優(yōu)點(diǎn)：具有被動(dòng)靶向性、較好的控/緩釋效果、可降低藥物的毒副作用及提高藥物的穩(wěn)定性。此外，它還有一些獨(dú)特的特點(diǎn)，如具有較大的內(nèi)部空腔，可以包裹更多的藥物，提高載藥量，有效得提高藥物的生物利用度。（GD Fu, GL Li, KG Neoh, ET Kang. Hollow polymeric nanostructures-Synthesis, morphology and function. Prog. Polym. Sci., 2011, 36, 127-167.）。

聚合物納米空心球主要有3種常用的制備方法：自組裝法、模板法和微乳聚合法。其中，自組裝法是制備聚合物納米空心球的重要方法，主要利用嵌段或接枝聚合物在水溶液中的自組裝體制備聚合物納米空心球。但目前所報(bào)道的大多數(shù)聚合物空心球存在以下缺點(diǎn)：生物相容性較差，在制備過(guò)程中需要使用大量的表面活性劑，在除去聚合物膠束內(nèi)核時(shí)需用大量有機(jī)溶劑，且聚合物納米顆粒殼層的交聯(lián)不可逆，這些都影響給藥系統(tǒng)的安全性。

聚乙二醇（PEG）是一類廣泛應(yīng)用于生物材料和蛋白藥物修飾的大分子，很多研究表明：PEG分子對(duì)材料表面的修飾可以明顯提高材料的生物相容性，用PEG分子修飾的蛋白分子，可以降低蛋白藥物免疫原性和延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期 (WJ Li, FC Szoka. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharm. Res., 2007, 24, 438–449)。

基于PEG組分的聚醚胺制備方法簡(jiǎn)單，無(wú)需催化劑或引發(fā)劑；聚醚胺分子鏈中含有叔氨基基團(tuán)，能對(duì)環(huán)境的pH條件產(chǎn)生響應(yīng)；通過(guò)單體的設(shè)計(jì)選擇，能夠簡(jiǎn)單方便的賦予聚醚胺各種優(yōu)異性能（YR Ren, XS Jiang, GL Yin, J Yin. Multi-stimuli responsive amphiphlic graft poly (ether amine) (agPEA): synthesis, characterization and self-assembly in aqueous solution. J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem., 2009, 48:327-335; YR Ren, XS Jiang, R Liu, J Yin. Multi-stimuli responsive grafted poly (ether tert-amine) (gPEA): synthesis, characterization and controlled morphology in aqueous solution. J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem., 2009, 47:6353-6361; YR Ren, XS Jiang, J Yin. Poly(ether tert-amine): A novel family of multiresponsive polymer. J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem., 2009, 47:1292-1297; R Wang, XS Jiang, GL Yin, J Yin. Well-defined multi-stimuli responsive fluorinated graft poly(ether amine)s (fgPEAs). Polymer, 2011, 52:368-375.）。因此，可以利用聚醚胺設(shè)計(jì)開發(fā)一種制備方法簡(jiǎn)單，制備條件溫和、具有多重功能性的PEG聚合物納米空心球。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種pH敏感光交聯(lián)的聚乙二醇空心球、其制備方法及應(yīng)用。

基于上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

一種pH敏感光交聯(lián)的聚乙二醇空心球的制備方法，將兩親性梳形聚醚胺溶于水中，經(jīng)紫外光照射1-2h，水解，經(jīng)沉析、分離及干燥得到交聯(lián)的聚乙二醇空心球，

所述的兩親性梳形聚醚胺親水鏈段由聚乙二醇構(gòu)成，疏水鏈段由脂肪族羧酸構(gòu)成，主鏈由香豆素構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)單元結(jié)構(gòu)式如下：

式中，R為H或CH₃或CH₂CH₃，R’為碳原子數(shù)6~30的脂肪鏈，n=10~230，且n為整數(shù)。

所述兩親性梳形聚醚胺的具體制備步驟如下：

將單氨基聚乙二醇甲氧醚（mPEG-NH₂）與含雙環(huán)氧基香豆素類單體（DGC）溶解于溶劑中，在60~90℃下反應(yīng)8~30小時(shí)，經(jīng)沉析、分離及干燥，得到以香豆素為主鏈、聚乙二醇為側(cè)鏈的聚醚胺，然后將這種聚醚胺與脂肪族羧酸在DCC和DMAP存在下進(jìn)行酯化得到兩親性梳形聚醚胺粗產(chǎn)物，兩親性梳形聚醚胺粗產(chǎn)物經(jīng)離心、沉析、分離及干燥得到兩親性梳形聚醚胺純品。

所述的單氨基聚乙二醇甲氧醚與含雙環(huán)氧基香豆素類單體摩爾比例為（0.9~1.1）︰（0.9~1.1）。

所述的溶劑為乙醇、N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺。

上述制備方法制得的pH敏感光交聯(lián)的聚乙二醇空心球。

上述的pH敏感光交聯(lián)的聚乙二醇空心球作為脂溶性物質(zhì)載體的應(yīng)用。

所述的脂溶性物質(zhì)為姜黃素、紫杉醇、多西紫杉醇、喜樹堿、喜樹堿衍生物、阿霉素、阿霉素類似物、脂溶性鉑類抗癌藥、脂溶性診斷試劑或熒光試劑。

本發(fā)明將兩親性梳形聚醚胺溶于水中，自組裝形成膠束，經(jīng)紫外光照射使聚醚胺主鏈交聯(lián)，再水解除去疏水內(nèi)核，得到交聯(lián)的聚乙二醇空心球。

本發(fā)明設(shè)計(jì)、制備的pH敏感光交聯(lián)的聚乙二醇空心球，反應(yīng)條件溫和，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，制備得到的聚乙二醇空心球具有良好的生物相容性、穩(wěn)定性、pH敏感性、高載藥量，同時(shí)所述的聚乙二醇空心球在紫外光照射下可以光降解。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中中間產(chǎn)物gPEAC、中間產(chǎn)物acPEAC、最終產(chǎn)物hPEAC的核磁譜圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中聚乙二醇空心球hPEAC的TEM照片；

圖3是本發(fā)明試驗(yàn)例1中阿霉素在不同pH緩沖液中的釋放曲線；

圖4是本發(fā)明試驗(yàn)例2中聚乙二醇空心球的細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明。顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

pH敏感的光交聯(lián)聚乙二醇空心球的制備過(guò)程如下所示：

具體制備步驟：

a）含香豆素基團(tuán)的聚醚胺（gPEAC）的制備

2 g mPEG-NH₂（數(shù)均分子量Mn=2000 g/mol）和0.304 g 4-甲基-5,7-二（2,3-環(huán)氧丙氧基）香豆素（即DGC），溶于10 mL無(wú)水乙醇中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下充分?jǐn)嚢?，?0 ℃下反應(yīng)15小時(shí)后，取出冷卻至室溫；將反應(yīng)混合物沉析至正己烷中，分離所得固體并干燥得到gPEAC。所得gPEAC的核磁譜圖見圖1（化學(xué)位移為3.3-3.8、5.8/6.4的峰分別屬于聚乙二醇上亞甲基和香豆素基團(tuán)的氫原子）。

b）兩親性梳狀聚醚胺（acPEAC）的制備

將1.4g gPEAC、0.274 g十四酸、0.248 g DCC（N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺）和8 mg DMAP（4-二甲氨基吡啶）溶于10 mL二氯甲烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫下反應(yīng)24小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解粗產(chǎn)物，離心后取清液，沉析于正己烷中，分離所得固體并干燥得到acPEAC。所得acPEAC的核磁譜圖見圖1（經(jīng)酯化后，acPEAC的核磁譜圖上在化學(xué)位移1.2處出現(xiàn)烷基鏈的質(zhì)子峰）。

c）聚乙二醇空心球hPEAC的制備

將acPEAC配成濃度為2 g/L的水溶液，在攪拌狀態(tài)下于波長(zhǎng)為365 nm的紫外燈下光照2小時(shí)。取200 mL光照后的溶液，用冰水浴冷凍至0 ℃，在快速攪拌下逐滴加入0.3 mL三氟乙酸，反應(yīng)在 0 ℃進(jìn)行30分鐘后，在室溫下繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉溶劑后溶于四氫呋喃中，用正己烷沉析，收集沉淀并干燥，得到hPEAC。所得hPEAC的核磁譜圖見圖1（經(jīng)光交聯(lián)后，香豆素基團(tuán)上氫原子的峰強(qiáng)度大幅減弱；水解后，烷基鏈的峰強(qiáng)度大幅減弱），TEM照片見圖2，清晰看見外徑約為100nm的聚乙二醇空心球。

實(shí)施例2

pH敏感的光交聯(lián)聚乙二醇空心球的制備過(guò)程：

a）含香豆素基團(tuán)的聚醚胺（gPEAC）的制備

1 g mPEG-NH₂（數(shù)均分子量Mn = 1000 g/mol）和0.304 g4-甲基-5,7-二（2,3-環(huán)氧丙氧基）香豆素（即DGC），溶于10 mL乙醇中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下充分?jǐn)嚢?，?0 ℃下反應(yīng)20小時(shí)后，取出冷卻至室溫；將反應(yīng)混合物沉析至正己烷中，然后干燥沉淀物，得到gPEAC。

b）兩親性梳狀聚醚胺（acPEAC）的制備

將0.8 g gPEAC、0.27 g十四酸、0.25 g DCC和8 mg DMAP溶于10 mL二氯甲烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫下反應(yīng)16小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解粗產(chǎn)物，離心后取清液，沉析于正己烷中，分離所得固體并干燥得到acPEAC。

c）聚乙二醇空心球hPEAC的制備

將acPEAC配成濃度為1 g/L的水溶液，在攪拌狀態(tài)下于波長(zhǎng)為365 nm的紫外燈下光照1小時(shí)。取200 mL光照后的溶液，用冰水浴冷凍至0 ℃，攪拌下逐滴加入0.2 mL三氟乙酸，反應(yīng)在 0 ℃進(jìn)行30 分鐘后，在室溫下繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉溶劑后溶于四氫呋喃中，用正己烷沉析，收集沉淀并干燥得到hPEAC。

實(shí)施例3

pH敏感的光交聯(lián)聚乙二醇空心球的制備過(guò)程：

a）含香豆素基團(tuán)的聚醚胺（gPEAC）的制備

5 g mPEG-NH₂（數(shù)均分子量Mn = 5000 g/mol）和0.3 g 5,7-二（2,3-環(huán)氧丙氧基）香豆素（即DGC），溶于10 mL乙醇中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下充分?jǐn)嚢瑁?0 ℃下反應(yīng)24小時(shí)后，取出冷卻至室溫；將反應(yīng)混合物沉析至正己烷中，分離所得固體并干燥得到gPEAC。

b）兩親性梳狀聚醚胺（acPEAC）的制備

將2.4 g gPEAC、0.35 g十八酸、0.25 g DCC和8 mg DMAP溶于15 mL二氯甲烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫下反應(yīng)16小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解粗產(chǎn)物，離心后取清液，沉析于正己烷中，分離所得固體并干燥得到acPEAC。

c）聚乙二醇空心球hPEAC的制備

將acPEAC配成濃度為2 g/L的水溶液，在攪拌狀態(tài)下于波長(zhǎng)為365 nm的紫外燈下光照2小時(shí)。取200 mL光照后的溶液，用冰水浴冷凍至0 ℃，攪拌下逐滴加入0.3 mL三氟乙酸，反應(yīng)在 0 ℃進(jìn)行30 分鐘后，在室溫下繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉溶劑后溶于四氫呋喃中，用正己烷沉析，分離所得固體并干燥得到hPEAC。

試驗(yàn)例1

（1）聚乙二醇空心球hPEAC凍干粉的制備

將實(shí)施案例1中的hPEAC分散在水中得到濃度為5mg/mL的分散液，將分散液置于節(jié)流分子量3500 g/mol的透析袋中， 水中透析3天，每隔6小時(shí)換水，得到的產(chǎn)物凍干后得到聚乙二醇空心球hPEAC凍干粉。

（2）聚乙二醇空心球hPEAC包裹脂溶性藥物阿霉素凍干粉的制備

取20 mg 阿霉素鹽酸鹽和20 μL三乙胺溶于5 mL水中，攪拌30分鐘后加入200 mg步驟（1）制備的聚乙二醇空心球凍干粉，攪拌2小時(shí)，逐滴加入15 mL去離子水，攪拌24小時(shí)，然后透析48小時(shí)，每6小時(shí)換1次水，得到的產(chǎn)物凍干后得到聚乙二醇空心球hPEAC包裹阿霉素凍干粉。

（3）包裹阿霉素聚乙二醇空心球體外釋放行為的測(cè)定

取兩份步驟（2）制備的聚乙二醇空心球hPEAC包裹阿霉素凍干粉20 mg，分別置于20 ml兩種不同pH值（pH 5.0、pH 7.4）的磷酸鹽緩沖鹽釋放介質(zhì)中，在37 ℃的恒溫振蕩器（100次/分鐘）中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)取出6 mL釋放介質(zhì)，同時(shí)補(bǔ)充同體積的新鮮釋放介質(zhì)。取出的樣品用熒光光譜測(cè)定阿霉素的含量，計(jì)算阿霉素的累積釋放率。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明：在pH 7.4條件下，阿霉素60小時(shí)后只釋放了9.2%，而在pH 5.0條件下阿霉素釋放了23%，顯示出良好的緩釋能力和pH響應(yīng)性。

試驗(yàn)例2

聚乙二醇空心球的細(xì)胞毒性

用MTT法檢測(cè)材料的細(xì)胞毒性，細(xì)胞選用子宮頸癌細(xì)胞HeLa。具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中（37 ℃條件下含10%胎牛血清、飽和濕度、5% CO₂）。細(xì)胞接種前，使用0.25 vol%胰蛋白酶的磷酸鹽溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化。HeLa細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度1.0×10⁴/孔。將接種后的HeLa細(xì)胞置于組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，加入試驗(yàn)例1中聚乙二醇空心球凍干粉，以不加樣品的細(xì)胞作為對(duì)照，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)24小時(shí)后加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT的PBS溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸除培養(yǎng)基后，用150 μL的DMSO溶解生成的藍(lán)色晶體。5分鐘后，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔中的吸收，工作波長(zhǎng)490 nm。各個(gè)重復(fù)吸光度的平均值作為樣品吸光度值，細(xì)胞存活率=樣品吸光度/細(xì)胞對(duì)照吸光度。

如圖4所示，在濃度高至1.0 mg/mL時(shí)，所有HeLa細(xì)胞的存活率均為80％以上，表明聚乙二醇空心球膠束對(duì)HeLa細(xì)胞幾乎不具有毒副作用，因而具有良好的生物相容性。