本發(fā)明涉及大豆提取物制備方法，具體涉及酶法水解制備大豆異黃酮苷元的方法，更具體是一種酶法水解制備大豆苷元的方法。

背景技術(shù)：

大豆異黃酮是黃酮類化合物，是大豆生長中形成的一類次級代謝產(chǎn)物，是一種生物活性物質(zhì)。由于是從植物中提取，與雌激素有相似結(jié)構(gòu)，因此大豆異黃酮又稱植物雌激素，在延緩女性衰老、改善更年期癥狀、骨質(zhì)疏松等方面展現(xiàn)出良好的藥理活性。

迄今為止，從大豆中共分離出12種大豆異黃酮異構(gòu)體，分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩類，其中苷元占總量2％-3％，包括染料木素、大豆苷元和黃豆黃素三種。結(jié)合型糖苷由三種苷元衍生而成，占總量97％-98％，主要以染料木苷、大豆苷和6-O-丙二?；玖夏拒盏染欧N形式存在。研究發(fā)現(xiàn)，糖苷形式的大豆異黃酮不能直接被小腸壁吸收，必須經(jīng)水解去除糖基轉(zhuǎn)化為游離性的苷元才可被小腸吸收，因而大豆異黃酮的藥理活性主要來源于苷元。但是由于大豆中苷元的含量極少，這使得大豆異黃酮苷的水解極具研究價值，如何高效地將糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)換成生物活性更高的游離性苷元形式成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

大豆苷(Daidzin)，分子式C₂₁H₂₀O₉，結(jié)構(gòu)式：

大豆苷元(Daidzein)，分子式C₁₅H₁₀O₄，結(jié)構(gòu)式：

目前，對于大豆苷的水解方法很多，如酸堿催化水解法、乙酰解法、smith降解等，但這些方法都存在著很明顯的各種弊端：酸水解通常采用濃鹽酸、硫酸作為催化劑，但強(qiáng)酸條件下水解的同時大豆異黃酮苷元的穩(wěn)定性受到很大影響，且不利于工業(yè)化生產(chǎn)，安全性問題也有待提高；糖苷鍵的縮醛結(jié)構(gòu)使其對堿較為穩(wěn)定，但是異黃酮糖苷鍵具有酯苷的性質(zhì)，可以采用堿水解，但是堿催化產(chǎn)物的苷元容易發(fā)生降解。酶專一性很強(qiáng)，酶水解條件溫和，多采用弱酸性緩沖溶液，得到的大豆異黃酮苷元穩(wěn)定性好、純度高，但是由于酶的生產(chǎn)成本較高，且緩沖液中底物溶解度較低，因此期望能尋找到一類新型溶劑使得反應(yīng)更加高效，成本更加低廉。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對大豆苷元制備工藝的現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種簡單廉價、高效環(huán)保的酶法水解制備大豆苷元的方法。

本發(fā)明采用新型綠色溶劑—低共熔溶劑(DES)與傳統(tǒng)緩沖液組成混合反應(yīng)體系，以β-D葡萄糖苷酶催化水解大豆苷制備高純度大豆苷元，工藝操作簡單，過程綠色且成本低廉。

本發(fā)明提供的一種酶法水解制備大豆苷元的方法，包括如下步驟：

(1)將氫鍵供體化合物和氫鍵受體化合物按摩爾比1:0.5-3均勻混合，在80-100℃加熱攪拌至形成均一透明液體，P₂O₅干燥兩周，制得DES；所述的氫鍵受體化合物為季銨鹽或兩性離子化合物，氫鍵供體化合物為多元醇。

(2)以pH 4.0-7.0緩沖液配制體積含量10-40％的DES水溶液，將大豆苷提取物超聲溶解于DES溶液中，使其濃度達(dá)到0.5-1.0mg/mL，再按0.25-1.25U/mL加入45℃預(yù)先孵育的β-D葡萄糖苷酶，攪拌至混合均勻；將上述體系加熱至40-70℃，保溫、攪拌30-150min，取少量反應(yīng)液置于90℃高溫滅活，HPLC測定底物實(shí)際水解率；

(3)向上述體系中繼續(xù)加入適量大豆苷提取物，重復(fù)5-10次，使反應(yīng)平衡不斷向右進(jìn)行；結(jié)束后將反應(yīng)體系置于低溫條件，大豆苷元析出，過濾，沉淀物以去離子水沖洗，冷凍干燥即得產(chǎn)品。

所述步驟(1)中的季銨鹽優(yōu)選為氯化膽堿，多元醇優(yōu)選為乙二醇或甘油。

所述步驟(2)中，緩沖液為乙酸-乙酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鹽緩沖液中的任一種，優(yōu)選為0.1M pH5.8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液。

所述步驟(2)中，反應(yīng)溫度優(yōu)選為50℃。

所述步驟(2)中，混合反應(yīng)體系中DES的體積含量優(yōu)選為30％。

所述步驟(2)中，所述反應(yīng)體系中，β-D葡萄糖苷酶用量優(yōu)選為1.0U/mL。

與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢：

本發(fā)明采用的低共熔溶劑(DES)是一類廉價易得、原子經(jīng)濟(jì)，可循環(huán)使用的新型綠色溶劑，具有低揮發(fā)性、無毒性、可設(shè)計性以及生物降解性高等優(yōu)點(diǎn)，在β-D葡萄糖苷酶催化水解大豆苷反應(yīng)中，DES對于糖苷底物的溶解度明顯高于緩沖液，保持了酶的較高催化活性且穩(wěn)定性顯著提高，這些關(guān)鍵因素保障了水解反應(yīng)的高效率。

相較于傳統(tǒng)水解方法，本發(fā)明制備方法突破了產(chǎn)物不穩(wěn)定，過程復(fù)雜，食用安全性低以及污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)瓶頸，且產(chǎn)物提純更加容易，體系可重復(fù)多次利用。在最佳工藝條件下，底物大豆苷水解率達(dá)97.5％，平行試驗(yàn)三次，RSD為0.62％，過程高效簡便且重復(fù)性良好。

附圖說明

圖1實(shí)施例1步驟(2)產(chǎn)物HPLC圖譜

圖2實(shí)施例2步驟(2)產(chǎn)物HPLC圖譜

圖3實(shí)施例1步驟(3)產(chǎn)物HPLC圖譜

具體實(shí)施方式

為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明，本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。

以下實(shí)施例中所述的大豆苷提取物購自上海一基實(shí)業(yè)有限公司，經(jīng)測定其純度65％。

實(shí)施例1

A.準(zhǔn)確稱取27.93g氯化膽堿，量取5.56mL乙二醇，混合加入500mL圓底燒瓶中，加熱攪拌，溫度為80-100℃，轉(zhuǎn)速為300rpm。反應(yīng)10h后，形成均一透明液體，制得約30mL目標(biāo)DES，P₂O₅干燥兩周。

B.準(zhǔn)確稱取100mg 65％的大豆苷提取物超聲充分溶解于60mL DES中，再依次加入45℃預(yù)先孵育的140mL pH 5.8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，250Uβ-D葡萄糖苷酶，攪拌使混合均勻。將上述體系加熱至50℃，保溫、攪拌反應(yīng)120min，反應(yīng)結(jié)束后，取少量反應(yīng)液經(jīng)HPLC測定大豆苷轉(zhuǎn)化率達(dá)97.5％。

C.每隔2h向上述體系中繼續(xù)加入100mg大豆苷提取物，重復(fù)5次，使反應(yīng)平衡不斷向右進(jìn)行；結(jié)束后將反應(yīng)體系置于低溫條件，大豆苷元析出，過濾，沉淀物以去離子水沖洗，冷凍干燥得大豆苷元粗品0.3g，經(jīng)HPLC檢測純度為68.5％。

實(shí)施例2

A.準(zhǔn)確稱取27.93g氯化膽堿，量取7.28mL甘油，混合加入500mL圓底燒瓶中，加熱攪拌，溫度為80-100℃，轉(zhuǎn)速為300rpm。反應(yīng)10h后，形成均一透明液體，制得約30mL目標(biāo)DES，P₂O₅干燥兩周。

B.準(zhǔn)確稱取100mg 65％的大豆苷提取物超聲充分溶解于40mL DES中，再依次加入45℃預(yù)先孵育的160mL pH 5.8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，200Uβ-D葡萄糖苷酶，攪拌使混合均勻。將上述體系加熱至55℃，保溫、攪拌反應(yīng)120min，反應(yīng)結(jié)束后，取少量反應(yīng)液經(jīng)HPLC測定大豆苷轉(zhuǎn)化率達(dá)96.5％。

C.每隔2h向上述體系中繼續(xù)加入100mg大豆苷提取物，重復(fù)5次，使反應(yīng)平衡不斷向右進(jìn)行；結(jié)束后將反應(yīng)體系置于低溫條件，大豆苷元析出，過濾，沉淀物以去離子水沖洗，冷凍干燥得大豆苷元粗品0.26g，經(jīng)HPLC檢測純度為66.3％。

實(shí)施例3

A.準(zhǔn)確稱取27.93g氯化膽堿，量取29.12mL甘油，混合加入500mL圓底燒瓶中，加熱攪拌，溫度為80-100℃，轉(zhuǎn)速為300rpm。反應(yīng)10h后，形成均一透明液體，制得約50mL目標(biāo)DES，P₂O₅干燥兩周。

B.準(zhǔn)確稱取100mg 65％的大豆苷提取物超聲充分溶解于40mL DES中，再依次加入45℃預(yù)先孵育的160mL pH 5.8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，150Uβ-D葡萄糖苷酶，攪拌使混合均勻。將上述體系加熱至45℃，保溫、攪拌反應(yīng)120min，反應(yīng)結(jié)束后，HPLC測定大豆苷轉(zhuǎn)化率達(dá)95.8％。

C.每隔2h向上述體系中繼續(xù)加入100mg大豆苷提取物，重復(fù)5次，使反應(yīng)平衡不斷向右進(jìn)行；結(jié)束后將反應(yīng)體系置于低溫條件，大豆苷元析出，過濾，沉淀物以去離子水沖洗，冷凍干燥得大豆苷元粗品0.28g，經(jīng)HPLC檢測純度為65.8％。

實(shí)施例4

A.準(zhǔn)確稱取27.93g氯化膽堿，量取22.24mL乙二醇，混合加入500mL圓底燒瓶中，加熱攪拌，溫度為80-100℃，轉(zhuǎn)速為300rpm。反應(yīng)10h后，形成均一透明液體，制得約50mL目標(biāo)DES，P₂O₅干燥兩周。

B.準(zhǔn)確稱取100mg 65％的大豆苷提取物超聲充分溶解于80mL DES中，再依次45℃預(yù)先孵育的120mL pH 5.8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，250Uβ-D葡萄糖苷酶，攪拌使混合均勻。將上述體系加熱至50℃，保溫、攪拌反應(yīng)120min，反應(yīng)結(jié)束后，HPLC測定大豆苷轉(zhuǎn)化率達(dá)94.9％。

C.每隔2h向上述體系中繼續(xù)加入100mg大豆苷提取物，重復(fù)5次，使反應(yīng)平衡不斷向右進(jìn)行；結(jié)束后將反應(yīng)體系置于低溫條件，大豆苷元析出，過濾，沉淀物以去離子水沖洗，冷凍干燥得大豆苷元粗品0.32g，經(jīng)HPLC檢測純度為67.4％。