本發(fā)明涉及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及用于多重核酸測(cè)序的標(biāo)簽和用于構(gòu)建真菌ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)的PCR引物。
背景技術(shù)：
：微生物多樣性，尤其是真菌多樣性和農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品以及工業(yè)生產(chǎn)等諸多領(lǐng)域有密切聯(lián)系。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物多樣性研究方法也逐漸完善和成熟。在微生物進(jìn)化過(guò)程中，核糖體RNA，具有一定的進(jìn)化保守性，保守區(qū)序列為所有同類微生物所共有，在保守序列之間存在由于進(jìn)化造成的物種之間序列差異的可變區(qū)域，因此被認(rèn)為是最適合系統(tǒng)分類的基因之一。通過(guò)對(duì)這些序列可變區(qū)域的測(cè)定和比對(duì)，能夠探究并揭示土壤中微生物物種和群落結(jié)構(gòu)的多樣性。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)憑借其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)也被引入微生物多樣性的研究技術(shù)中。高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughputsequencing)，又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)("Next-generation"sequencingtechnology)，以能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長(zhǎng)較短等為標(biāo)志。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，為了節(jié)約測(cè)序成本或研究需要發(fā)展出了多重測(cè)序(Multiplexedsequencing)技術(shù)，通常在構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)時(shí)，借助PCR引物，用不同的標(biāo)簽(Index)標(biāo)記不同樣品后，將不同樣品混合起來(lái)上機(jī)測(cè)序，測(cè)序結(jié)束后通過(guò)識(shí)別Index來(lái)區(qū)分同一條泳道(Lane)中的不同樣品數(shù)據(jù)。多重測(cè)序技術(shù)極大程度的降低了測(cè)序成本，節(jié)約測(cè)序資源，并且給生物學(xué)研究提供的便利手段。例如，在進(jìn)行實(shí)際的真菌多樣性研究時(shí)，通常需要對(duì)數(shù)百個(gè)樣品的多樣性進(jìn)行分析，若沒(méi)有多重測(cè)序技術(shù)，科研成本和時(shí)間成本將大大增加。用于區(qū)分不同樣品的標(biāo)簽(Index)實(shí)際上為一段核苷酸序列，一方面在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，測(cè)序反應(yīng)對(duì)不同的Index序列具有一定的數(shù)據(jù)產(chǎn)出偏好性，造成檢測(cè)插入片段時(shí)光強(qiáng)參數(shù)的波動(dòng)，影響輸出的數(shù)據(jù)質(zhì)量和平衡性，即Index序列一定程度影響混合樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，因此并非任何核苷酸序列都適合用作Index。鑒于目前已有的經(jīng)過(guò)實(shí)際測(cè)序驗(yàn)證的對(duì)數(shù)據(jù)平衡性較好的Index數(shù)目并不多，因此提供更多的對(duì)數(shù)據(jù)產(chǎn)出平衡性影響較小的Index序列對(duì)多重核酸測(cè)序技術(shù)非常重要。另一方面，在真菌多樣性研究早期常使用18SrRNA作為分類鑒定的遺傳標(biāo)記，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，逐步采用ITS序列取代18SrRNA作為遺傳標(biāo)記。盡管目前已有多種ITS序列擴(kuò)增的通用引物，但其用于不同種類的樣品測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建時(shí)，并不能都獲得較好的擴(kuò)增效果。比如用于土壤樣品的測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建時(shí)，由于土壤樣品本身的復(fù)雜性，目前常規(guī)的ITS通用引物獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物彌散嚴(yán)重，擴(kuò)增特異性相對(duì)較差。而擴(kuò)增特異性直接影響分類鑒定的準(zhǔn)確性，進(jìn)而影響對(duì)樣品中真菌多樣性檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因此，提供一組高特異性的、用于真菌多樣性檢測(cè)的ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的PCR引物，能夠有效的提高對(duì)樣品中真菌多樣性檢測(cè)的準(zhǔn)確性，進(jìn)而對(duì)農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品以及工業(yè)領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用提供更加科學(xué)有效的指導(dǎo)。再一方面，現(xiàn)有技術(shù)中僅有給細(xì)菌16SrRNA測(cè)序文庫(kù)樣品添加Index的試劑盒，Illunima公司的NexteraXTIndexKit和NexteraXTv2IndexKit；然而，目前并沒(méi)有用于給真菌ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)樣品添加Index的試劑盒。綜上所述，提供一組測(cè)序數(shù)據(jù)平衡性相對(duì)更好的Index以及一組特異性更高的構(gòu)建ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)的PCR引物以及給真菌ITS序列測(cè)序文庫(kù)添加Index的試劑盒，能夠使得多重核酸測(cè)序技術(shù)以及土壤真菌多樣性研究工作更加高效便捷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)簽”也稱為Index，具體指一段用于區(qū)分不同測(cè)序樣品的核苷酸序列；術(shù)語(yǔ)“PCR”指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；術(shù)語(yǔ)“連接子”指任意一段和待測(cè)序的目的序列之間不存在超過(guò)連續(xù)5個(gè)堿基以上的特異性配對(duì)的核苷酸序列。用于區(qū)分不同樣品的標(biāo)簽，也被稱為Index，實(shí)際上為一段核苷酸序列，一方面在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，測(cè)序反應(yīng)對(duì)不同的Index序列具有一定的數(shù)據(jù)產(chǎn)出偏好性，造成檢測(cè)插入片段時(shí)光強(qiáng)參數(shù)的波動(dòng)，影響輸出的數(shù)據(jù)質(zhì)量和平衡性，即Index序列一定程度影響混合樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，因此并非任何核苷酸序列都適合用作Index，然而目前已有的經(jīng)過(guò)實(shí)際測(cè)序驗(yàn)證的對(duì)數(shù)據(jù)平衡性較好的Index數(shù)目并不多。本發(fā)明同時(shí)考慮Index對(duì)PCR引物的擴(kuò)增效率和數(shù)據(jù)產(chǎn)出的偏好性的影響，提供了一組用于標(biāo)記待測(cè)序核酸樣品的標(biāo)簽，所述的一組標(biāo)簽包含以下29個(gè)Index中的2個(gè)或多個(gè)：本發(fā)明還提供了上述Index用于測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建和/或用于測(cè)序的用途：將所述的Index包含在用于擴(kuò)增待測(cè)序序列的PCR引物中，從而構(gòu)成相對(duì)應(yīng)的Index-PCR引物，通過(guò)PCR方法將上述Index引入待測(cè)序序列中；所述的Index-PCR引物用可以用作PCR的3’端引物或5’端引物，或同時(shí)用作3’端引物和5’端引物。其中，在所述的Index-PCR引物中，所述的Index通過(guò)或者不通過(guò)連接子與用于擴(kuò)增待測(cè)序序列的PCR引物的5’端或3’端相連。其中，所述的待測(cè)序序列優(yōu)選為真菌ITS序列。真菌ITS序列被用作真菌分類鑒定的重要遺傳標(biāo)記，目前常用的ITS區(qū)段為ITS1-ITS4，然而現(xiàn)有的用于擴(kuò)增ITS1-ITS4這一區(qū)段的引物并不能對(duì)各種類型的樣品進(jìn)行高特異性擴(kuò)增，比如復(fù)雜性相對(duì)較高的土壤樣品。為解決這一技術(shù)問(wèn)題，辦發(fā)明還提供了一組用于構(gòu)建ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)的PCR引物。所述的一組用于構(gòu)建ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)的PCR引物包括正向引物組和反向引物組，所述的正向引物組和反向引物組中不能含有包含相同Index的引物。在使用時(shí)，所述的正向引物組中的任意一條引物和反向引物組中的任意一條引物兩兩配對(duì)組成引物對(duì)，通過(guò)PCR反應(yīng)用于擴(kuò)增樣品中的ITS序列；獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的上游和下游各含有一個(gè)Index，這兩個(gè)Index作為該樣品的特異性標(biāo)記，用于和其他待測(cè)序樣品進(jìn)行區(qū)分。所述的正向引物組由以下引物中的一條或多條組成：引物F1：包含本發(fā)明所述的Index1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；引物F2：包含本發(fā)明所述的Index2，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；引物F3：包含本發(fā)明所述的Index3，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；引物F4：包含本發(fā)明所述的Index4，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；引物F5：包含本發(fā)明所述的Index5，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；引物F6：包含本發(fā)明所述的Index6，其核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；引物F7：包含本發(fā)明所述的Index7，其核苷酸序列如SEQIDNO：7所示；引物F8：包含本發(fā)明所述的Index8，其核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；引物F9：包含本發(fā)明所述的Index9，其核苷酸序列如SEQIDNO：9所示；引物F10：包含本發(fā)明所述的Index10，其核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；引物F11：包含本發(fā)明所述的Index11，其核苷酸序列如SEQIDNO：11所示；引物F12：包含本發(fā)明所述的Index12，其核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；引物F13：包含本發(fā)明所述的Index13，其核苷酸序列如SEQIDNO：13所示；引物F14：包含本發(fā)明所述的Index14，其核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；引物F15：包含本發(fā)明所述的Index15，其核苷酸序列如SEQIDNO：15所示；引物F16：包含本發(fā)明所述的Index16，其核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；引物F17：包含本發(fā)明所述的Index17，其核苷酸序列如SEQIDNO：17所示；引物F18：包含本發(fā)明所述的Index18，其核苷酸序列如SEQIDNO：18所示；引物F19：包含本發(fā)明所述的Index19，其核苷酸序列如SEQIDNO：19所示；引物F20：包含本發(fā)明所述的Index20，其核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；引物F21：包含本發(fā)明所述的Index21，其核苷酸序列如SEQIDNO：21所示；引物F22：包含本發(fā)明所述的Index22，其核苷酸序列如SEQIDNO：22所示；引物F23：包含本發(fā)明所述的Index23，其核苷酸序列如SEQIDNO：23所示；引物F24：包含本發(fā)明所述的Index24，其核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；引物F25：包含本發(fā)明所述的Index25，其核苷酸序列如SEQIDNO：25所示；引物F26：包含本發(fā)明所述的Index26，其核苷酸序列如SEQIDNO：26所示；引物F27：包含本發(fā)明所述的Index27，其核苷酸序列如SEQIDNO：27所示；引物F28：包含本發(fā)明所述的Index28，其核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；引物F29：包含本發(fā)明所述的Index29，其核苷酸序列如SEQIDNO：29所示。所述的反向引物組由以下引物中的一條或多條組成：引物R1：包含本發(fā)明所述的Index1，其核苷酸序列如SEQIDNO：30所示；引物R2：包含本發(fā)明所述的Index2，其核苷酸序列如SEQIDNO：31所示；引物R3：包含本發(fā)明所述的Index3，其核苷酸序列如SEQIDNO：32所示；引物R4：包含本發(fā)明所述的Index4，其核苷酸序列如SEQIDNO：33所示；引物R5：包含本發(fā)明所述的Index5，其核苷酸序列如SEQIDNO：34所示；引物R6：包含本發(fā)明所述的Index6，其核苷酸序列如SEQIDNO：35所示；引物R7：包含本發(fā)明所述的Index7，其核苷酸序列如SEQIDNO：36所示；引物R8：包含本發(fā)明所述的Index8，其核苷酸序列如SEQIDNO：37所示；引物R9：包含本發(fā)明所述的Index9，其核苷酸序列如SEQIDNO：38所示；引物R10：包含本發(fā)明所述的Index10，其核苷酸序列如SEQIDNO：39所示；引物R11：包含本發(fā)明所述的Index11，其核苷酸序列如SEQIDNO：40所示；引物R12：包含本發(fā)明所述的Index12，其核苷酸序列如SEQIDNO：41所示；引物R13：包含本發(fā)明所述的Index13，其核苷酸序列如SEQIDNO：42所示；引物R14：包含本發(fā)明所述的Index14，其核苷酸序列如SEQIDNO：43所示；引物R15：包含本發(fā)明所述的Index15，其核苷酸序列如SEQIDNO：44所示；引物R16：包含本發(fā)明所述的Index16，其核苷酸序列如SEQIDNO：45所示；引物R17：包含本發(fā)明所述的Index17，其核苷酸序列如SEQIDNO：46所示；引物R18：包含本發(fā)明所述的Index18，其核苷酸序列如SEQIDNO：47所示；引物R19：包含本發(fā)明所述的Index19，其核苷酸序列如SEQIDNO：48所示；引物R20：包含本發(fā)明所述的Index20，其核苷酸序列如SEQIDNO：49所示；引物R21：包含本發(fā)明所述的Index21，其核苷酸序列如SEQIDNO：50所示；引物R22：包含本發(fā)明所述的Index22，其核苷酸序列如SEQIDNO：51所示；引物R23：包含本發(fā)明所述的Index23，其核苷酸序列如SEQIDNO：52所示；引物R24：包含本發(fā)明所述的Index24，其核苷酸序列如SEQIDNO：53所示；引物R25：包含本發(fā)明所述的Index25，其核苷酸序列如SEQIDNO：54所示；引物R26：包含本發(fā)明所述的Index26，其核苷酸序列如SEQIDNO：55所示；引物R27：包含本發(fā)明所述的Index27，其核苷酸序列如SEQIDNO：56所示；引物R28：包含本發(fā)明所述的Index28，其核苷酸序列如SEQIDNO：57所示；引物R29：包含本發(fā)明所述的Index29，其核苷酸序列如SEQIDNO：58所示。所述的ITS序列指ITS1-ITS4這一區(qū)域的核酸序列。所述的樣品包含但不限于以下類型：土壤樣品，腸道樣品，水體樣品，淤泥樣品，大曲樣品。本發(fā)明還提供了一種ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含本發(fā)明所述的一組用于構(gòu)建真菌ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)的PCR引物。上述一種ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑盒還可以包含基因組DNA提取試劑、DNA聚合酶、ITS測(cè)序接頭添加試劑。本發(fā)明還提供了上述一種ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑盒在真菌多樣性檢測(cè)中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)、本發(fā)明提供的Index充分考慮到索引標(biāo)簽之間的序列差異程度、堿基識(shí)別率以及測(cè)序反應(yīng)對(duì)不同Index序列的數(shù)據(jù)產(chǎn)出偏好性。本發(fā)明提供的Index的序列避免了序列之間出現(xiàn)3或3個(gè)以上連續(xù)的相同堿基的出現(xiàn)，極大程度的降低了其序列合成或測(cè)序過(guò)程中可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤率；標(biāo)簽包含入建庫(kù)或測(cè)序引物中后，盡可能地避免了出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)或與測(cè)序引物及其反向互補(bǔ)序列相同的現(xiàn)象。本發(fā)明提供的Index經(jīng)過(guò)龐大數(shù)量的實(shí)際測(cè)序檢驗(yàn)，將其包含于測(cè)序或建庫(kù)引物后，混合測(cè)序反應(yīng)得到的測(cè)序數(shù)據(jù)平衡性相對(duì)較好。(2)、本發(fā)明提供的用于構(gòu)建真菌ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)的PCR引物用于擴(kuò)增ITS序列中的ITS1-ITS4這一區(qū)段，這一區(qū)段對(duì)真菌分類鑒定的效果要明顯好于18SrRNA或ITS1-ITS2區(qū)段；其中還包含有本發(fā)明提供的Index，使用上正向引物和反向引物構(gòu)成的引物對(duì)通過(guò)1輪PCR反應(yīng)在擴(kuò)增ITS序列的同時(shí)對(duì)其引入兩個(gè)Index，這兩個(gè)Index作為該樣品的特異性標(biāo)簽，用于和其他混合測(cè)序樣品進(jìn)行區(qū)分；由于其含有本發(fā)明提供的Index，在文庫(kù)混合測(cè)序時(shí)數(shù)據(jù)產(chǎn)出的平衡性相對(duì)較好，進(jìn)而能夠更加真實(shí)可靠地反應(yīng)樣品中的真菌組成情況。(3)、本發(fā)明提供的用于構(gòu)建真菌ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)的PCR引物比現(xiàn)有的常規(guī)ITS引物的特異性更高。常規(guī)用于擴(kuò)增ITS1-ITS4的PCR引物在用于土壤、淤泥等復(fù)雜性較強(qiáng)的樣品時(shí)，特異性不好，目的條帶電泳彌散嚴(yán)重，往往可能導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果不準(zhǔn)確，無(wú)法獲得可靠的分析結(jié)果，也就無(wú)法獲得更加真實(shí)的樣品中真菌組成情況，一定程度對(duì)食品、衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用造成不良影響。本發(fā)明提供的用于構(gòu)建真菌ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)的PCR引物不僅能夠?qū)?dòng)物腸道、水體以及大曲等復(fù)雜性相對(duì)較低的樣品類型獲得高特異的擴(kuò)增產(chǎn)物；對(duì)土壤和淤泥等高復(fù)雜性的樣品類型也具有較高的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高、擴(kuò)增條帶清晰，無(wú)彌散現(xiàn)象，因此保障了后續(xù)測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)而能夠獲得相對(duì)更加準(zhǔn)確的分析結(jié)果和更加真實(shí)的真菌組成情況。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)驗(yàn)例1步驟(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為對(duì)比例1中的擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施例的下述說(shuō)明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例中，而是可以應(yīng)用于符合與本文所公開(kāi)的原理和新穎特點(diǎn)相一致的更寬的范圍。雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“ddH2O”指雙蒸水。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。SoilDNAKit購(gòu)自O(shè)mega公司；KOD-Plus-Neo購(gòu)自TOYOBO公司；引物合成委托生工生物工程股份有限公司進(jìn)行；100個(gè)不同來(lái)源的土壤樣品由中科院北京基因組研究所提供。實(shí)施例1一組用于構(gòu)建ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)的PCR引物由20條引物組成，其中正向引物組由以下10條引物組成：本發(fā)明所述的：引物F1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；引物F2，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；引物F7，其核苷酸序列如SEQIDNO：7所示；引物F8，其核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；引物F9，其核苷酸序列如SEQIDNO：9所示；引物F12，其核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；引物F13，其核苷酸序列如SEQIDNO：13所示；引物F14，其核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；引物F23，其核苷酸序列如SEQIDNO：23所示；其中反向引物組由以下10條引物組成：本發(fā)明所述的：引物R15，其核苷酸序列如SEQIDNO：44所示；引物R17，其核苷酸序列如SEQIDNO：46所示；引物R18，其核苷酸序列如SEQIDNO：47所示；引物R19，其核苷酸序列如SEQIDNO：48所示；引物R21，其核苷酸序列如SEQIDNO：50所示；引物R25，其核苷酸序列如SEQIDNO：54所示；引物R26，其核苷酸序列如SEQIDNO：55所示；引物R27，其核苷酸序列如SEQIDNO：56所示；引物R28，其核苷酸序列如SEQIDNO：57所示；引物R29，其核苷酸序列如SEQIDNO：58所示。實(shí)驗(yàn)例1真菌多樣性檢測(cè)應(yīng)用對(duì)100個(gè)不同樣品構(gòu)建ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)實(shí)驗(yàn)樣品：100個(gè)不同來(lái)源的土壤樣品實(shí)驗(yàn)步驟：(1)、樣品基因組DNA提?。河肧oilDNAKit提取土壤樣品中的基因組DNA，獲得100個(gè)不同基因組DNA樣品，提取步驟參見(jiàn)其產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)；(2)、PCR擴(kuò)增ITS1-ITS4序列，同時(shí)利用PCR引物對(duì)每個(gè)文庫(kù)樣品添加2個(gè)Index：分別以步驟(1)得到的100個(gè)不同基因組DNA樣品為模板，將本發(fā)明實(shí)施例1中提供的20條PCR引物兩兩配對(duì)，構(gòu)成100個(gè)不同引物對(duì)，用于擴(kuò)增模板中的ITS1-ITS4序列；PCR反應(yīng)體系如下表所示：成分含量基因組DNA(10ng/μL)2μL引物(10μM)各0.75μLMgSO4(25mM)3μLdNTPs(2mM)5μL10×KOD-Plus-NeoBuffer5μLKOD-Plus-Neo1μLddH2O32.5μL共計(jì)50μLPCR程序如下表所示：對(duì)獲得的100個(gè)不同擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度0.8％，電泳結(jié)果顯示采用本發(fā)明提供的引物獲得的ITS1-ITS4擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，無(wú)彌散現(xiàn)象。由于樣品數(shù)量較多，在此展示1-10號(hào)樣品的電泳結(jié)果，如圖1所示，目的條帶清晰，無(wú)彌散現(xiàn)象；第11-100號(hào)樣品的電泳結(jié)果和1-10號(hào)相同或相似。(3)、添加測(cè)序接頭：以步驟(2)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，利用以下引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以下引物對(duì)中含有IlluminaMiSeq測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序接頭。5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTG-3’5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3’PCR反應(yīng)體系如下表所示：成分含量步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物(1ng/μL)2μL引物(10μM)各0.75μLMgSO4(25mM)3μLdNTPs(2mM)5μL10×KOD-Plus-NeoBuffer5μLKOD-Plus-Neo1μLddH2O32.5μL共計(jì)50μLPCR程序如下表所示：使用AgencourtAMPureXP磁珠純化步驟(3)獲得的100個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，純化后的100個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物混合后，即為100個(gè)不同來(lái)源的土壤樣品的ITS序列多重測(cè)序文庫(kù)。對(duì)比例1以下引物對(duì)為現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)使用的ITS1-ITS4序列的擴(kuò)增引物：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’利用上述引物對(duì)對(duì)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中使用的100個(gè)不同來(lái)源的土壤樣品中的隨機(jī)50個(gè)樣品的ITS1-ITS4序列進(jìn)行擴(kuò)增：樣品基因組DNA的提取方法同本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1步驟(1)，PCR體系和PCR程序同本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1步驟(2)。將獲得的50個(gè)不同擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度和電泳條件同實(shí)驗(yàn)例1步驟(2)。由于樣品數(shù)量較多，在此展示其中10個(gè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，如圖2所示，擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶不清晰，彌散嚴(yán)重；本對(duì)比例中其余樣品的電泳結(jié)果與圖2相同或相似，擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶不清晰，彌散嚴(yán)重。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3