本發(fā)明涉及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及用于多重核酸測序的Index和構(gòu)建16SrRNA多重核酸測序文庫的PCR引物。
背景技術(shù)：
：微生物多樣性，尤其是細菌多樣性微和農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品以及工業(yè)生產(chǎn)等諸多領(lǐng)域有密切聯(lián)系。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物多樣性研究方法也逐漸完善和成熟。在微生物進化過程中，核糖體RNA(尤其是細菌的16SrRNA或真菌的18SrRNA)，具有一定的進化保守性，保守區(qū)序列為所有同類微生物所共有，在保守序列之間存在由于進化造成的物種之間序列差異的可變區(qū)域，因此被認為是最適合系統(tǒng)分類的基因之一。通過對這些序列可變區(qū)域的測定和比對，能夠探究并揭示土壤中微生物物種和群落結(jié)構(gòu)的多樣性。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)也被引入微生物多樣性的研究技術(shù)中。在高通量測序技術(shù)中，為了節(jié)約測序成本或研究需要，通常會將不同樣品混合測序，稱為多重測序(Multiplexedsequencing)技術(shù)，即在構(gòu)建測序文庫時，借助PCR引物，用不同的索引標簽(Index)標記不同樣品后，將不同樣品混合起來上機測序，測序結(jié)束后通過識別Index來區(qū)分同一條泳道(Lane)中的不同樣品數(shù)據(jù)。多重測序技術(shù)極大程度的降低了測序成本，節(jié)約測序資源，并且給生物學(xué)研究提供的便利手段。例如，在進行細菌等微生物多樣性研究時，通常需要對數(shù)百個樣品的多樣性進行分析，若沒有多重測序技術(shù)，科研成本和時間成本將大大增加。一方面，實際測序反應(yīng)對不同的Index序列具有一定的數(shù)據(jù)產(chǎn)出偏好性，造成檢測插入片段時光強參數(shù)的波動，影響輸出的數(shù)據(jù)質(zhì)量和平衡性，即Index序列一定程度影響混合樣品的測序數(shù)據(jù)的準確性，并非任何核苷酸序列都適合用作Index。因此，提供更多的可用Index序列對多重測序
技術(shù)領(lǐng)域：
非常重要。另一方面，發(fā)明人在進行微生物多樣性研究時發(fā)現(xiàn)：目前常規(guī)的用于細菌樣品多樣性研究的16SrRNA擴增引物(如Illunima公司提供的16SrRNA擴增引物)雖然能夠?qū)δc道樣品獲得相對較好的擴增效果；但當用于復(fù)雜性較強、雜質(zhì)較多的土壤樣品時，擴增產(chǎn)物特異性不高，電泳顯示擴增條帶彌散嚴重，這將嚴重影響后續(xù)測序和分析結(jié)果的準確性。綜上所述，提供一組測序數(shù)據(jù)平衡性相對更好的Index序列以及一組適用于構(gòu)建土壤樣品中細菌16SrRNA多重測序文庫的PCR引物，能夠使得土壤細菌多樣性研究工作更加高效便捷。技術(shù)實現(xiàn)要素：除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。本發(fā)明中的術(shù)語“Index”指索引標簽，具體指一段用于區(qū)分不同測序樣品的核苷酸序列；術(shù)語“PCR”指聚合酶鏈式反應(yīng)；術(shù)語“連接子”指任意一段和待測序的核苷酸序列之間不存在超過連續(xù)5個堿基以上的特異性配對的核苷酸序列。本發(fā)明同時考慮索引標簽對PCR引物的擴增效率和數(shù)據(jù)產(chǎn)出的偏好性的影響，提供了一組用于標記待測序核酸樣品的索引標簽，所述的一組索引標簽包含以下34個Index中的2個或多個；所述的34個Index的核苷酸序列如下表所示：本發(fā)明還提供了上述Index用于測序文庫的構(gòu)建和/或用于測序的用途：將所述的Index包含在用于擴增待測序序列的PCR引物中，從而構(gòu)成相對應(yīng)的Index-PCR引物，通過PCR方法將上述Index引入待測序序列中；所述的Index-PCR引物用可以用作PCR的3’端引物或5’端引物，或同時用作3’端引物和5’端引物。其中，在所述的Index-PCR引物中，所述的Index通過或者不通過連接子與用于擴增待測序序列的PCR引物的5’端或3’端相連。其中，所述的待測序序列優(yōu)選為細菌16SrRNA序列。由于土壤中除了細菌之外，還含有大量真菌、動物、植物等的遺傳物質(zhì)，在利用16SrRNA測序進行細菌多樣性研究時，土壤樣品相較于腸道等其他類型的樣品往往具有更高的復(fù)雜性?，F(xiàn)有的構(gòu)建測序文庫的16SrRNA擴增引物用于腸道樣品時，能夠保證一定的特異性；然而用于土壤樣品時，由于其復(fù)雜性，往往無法獲得理想的擴增產(chǎn)物，獲得的擴增產(chǎn)物特異性差，電泳條帶彌散嚴重。本發(fā)明的另一個目的是提供了一組用于構(gòu)建16SrRNA多重測序文庫的PCR引物。所述的一組用于構(gòu)建16SrRNA多重測序文庫的PCR引物包括正向引物組和反向引物組；所述的正向引物組中的任意一條引物和反向引物組中的任意一條引物兩兩配對組成引物對，通過PCR反應(yīng)用于擴增樣品中的16SrRNA；獲得的擴增產(chǎn)物的上游和下游各含有一個Index，這兩個Index作為該樣品的特異性標記，用于和其他待測序樣品進行區(qū)分。獲得的擴增產(chǎn)物連接測序接頭后，可混合上機測序；所述的正向引物組和反向引物組中不能含有包含相同Index的引物。所述的正向引物組由以下引物中的一條或多條組成：引物F1：包含本發(fā)明所述的Index1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；引物F2：包含本發(fā)明所述的Index2，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；引物F3：包含本發(fā)明所述的Index3，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；引物F4：包含本發(fā)明所述的Index4，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；引物F5：包含本發(fā)明所述的Index5，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；引物F6：包含本發(fā)明所述的Index6，其核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；引物F7：包含本發(fā)明所述的Index7，其核苷酸序列如SEQIDNO：7所示；引物F8：包含本發(fā)明所述的Index8，其核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；引物F9：包含本發(fā)明所述的Index9，其核苷酸序列如SEQIDNO：9所示；引物F10：包含本發(fā)明所述的Index10，其核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；引物F11：包含本發(fā)明所述的Index11，其核苷酸序列如SEQIDNO：11所示；引物F12：包含本發(fā)明所述的Index12，其核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；引物F13：包含本發(fā)明所述的Index13，其核苷酸序列如SEQIDNO：13所示；引物F14：包含本發(fā)明所述的Index14，其核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；引物F15：包含本發(fā)明所述的Index15，其核苷酸序列如SEQIDNO：15所示；引物F16：包含本發(fā)明所述的Index16，其核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；引物F17：包含本發(fā)明所述的Index17，其核苷酸序列如SEQIDNO：17所示；引物F18：包含本發(fā)明所述的Index18，其核苷酸序列如SEQIDNO：18所示；引物F19：包含本發(fā)明所述的Index19，其核苷酸序列如SEQIDNO：19所示；引物F20：包含本發(fā)明所述的Index20，其核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；引物F21：包含本發(fā)明所述的Index21，其核苷酸序列如SEQIDNO：21所示；引物F22：包含本發(fā)明所述的Index22，其核苷酸序列如SEQIDNO：22所示；引物F23：包含本發(fā)明所述的Index23，其核苷酸序列如SEQIDNO：23所示；引物F24：包含本發(fā)明所述的Index24，其核苷酸序列如SEQIDNO：24所示；引物F25：包含本發(fā)明所述的Index25，其核苷酸序列如SEQIDNO：25所示；引物F26：包含本發(fā)明所述的Index26，其核苷酸序列如SEQIDNO：26所示；引物F27：包含本發(fā)明所述的Index27，其核苷酸序列如SEQIDNO：27所示；引物F28：包含本發(fā)明所述的Index28，其核苷酸序列如SEQIDNO：28所示；引物F29：包含本發(fā)明所述的Index29，其核苷酸序列如SEQIDNO：29所示；引物F30：包含本發(fā)明所述的Index30，其核苷酸序列如SEQIDNO：30所示；引物F31：包含本發(fā)明所述的Index31，其核苷酸序列如SEQIDNO：31所示；引物F32：包含本發(fā)明所述的Index32，其核苷酸序列如SEQIDNO：32所示；引物F33：包含本發(fā)明所述的Index33，其核苷酸序列如SEQIDNO：33所示；引物F34：包含本發(fā)明所述的Index34，其核苷酸序列如SEQIDNO：34所示。所述的反向引物組由以下引物中的一條或多條組成：引物R1：包含本發(fā)明所述的Index1，其核苷酸序列如SEQIDNO：35所示；引物R2：包含本發(fā)明所述的Index2，其核苷酸序列如SEQIDNO：36所示；引物R3：包含本發(fā)明所述的Index3，其核苷酸序列如SEQIDNO：37所示；引物R4：包含本發(fā)明所述的Index4，其核苷酸序列如SEQIDNO：38所示；引物R5：包含本發(fā)明所述的Index5，其核苷酸序列如SEQIDNO：39所示；引物R6：包含本發(fā)明所述的Index6，其核苷酸序列如SEQIDNO：40所示；引物R7：包含本發(fā)明所述的Index7，其核苷酸序列如SEQIDNO：41所示；引物R8：包含本發(fā)明所述的Index8，其核苷酸序列如SEQIDNO：42所示；引物R9：包含本發(fā)明所述的Index9，其核苷酸序列如SEQIDNO：43所示；引物R10：包含本發(fā)明所述的Index10，其核苷酸序列如SEQIDNO：44所示；引物R11：包含本發(fā)明所述的Index11，其核苷酸序列如SEQIDNO：45所示；引物R12：包含本發(fā)明所述的Index12，其核苷酸序列如SEQIDNO：46所示；引物R13：包含本發(fā)明所述的Index13，其核苷酸序列如SEQIDNO：47所示；引物R14：包含本發(fā)明所述的Index14，其核苷酸序列如SEQIDNO：48所示；引物R15：包含本發(fā)明所述的Index15，其核苷酸序列如SEQIDNO：49所示；引物R16：包含本發(fā)明所述的Index16，其核苷酸序列如SEQIDNO：50所示；引物R17：包含本發(fā)明所述的Index17，其核苷酸序列如SEQIDNO：51所示；引物R18：包含本發(fā)明所述的Index18，其核苷酸序列如SEQIDNO：52所示；引物R19：包含本發(fā)明所述的Index19，其核苷酸序列如SEQIDNO：53所示；引物R20：包含本發(fā)明所述的Index20，其核苷酸序列如SEQIDNO：54所示；引物R21：包含本發(fā)明所述的Index21，其核苷酸序列如SEQIDNO：55所示；引物R22：包含本發(fā)明所述的Index22，其核苷酸序列如SEQIDNO：56所示；引物R23：包含本發(fā)明所述的Index23，其核苷酸序列如SEQIDNO：57所示；引物R24：包含本發(fā)明所述的Index24，其核苷酸序列如SEQIDNO：58所示；引物R25：包含本發(fā)明所述的Index25，其核苷酸序列如SEQIDNO：59所示；引物R26：包含本發(fā)明所述的Index26，其核苷酸序列如SEQIDNO：60所示；引物R27：包含本發(fā)明所述的Index27，其核苷酸序列如SEQIDNO：61所示；引物R28：包含本發(fā)明所述的Index28，其核苷酸序列如SEQIDNO：62所示；引物R29：包含本發(fā)明所述的Index29，其核苷酸序列如SEQIDNO：63所示；引物R30：包含本發(fā)明所述的Index30，其核苷酸序列如SEQIDNO：64所示；引物R31：包含本發(fā)明所述的Index31，其核苷酸序列如SEQIDNO：65所示；引物R32：包含本發(fā)明所述的Index32，其核苷酸序列如SEQIDNO：66所示；引物R33：包含本發(fā)明所述的Index33，其核苷酸序列如SEQIDNO：67所示；引物R34：包含本發(fā)明所述的Index34，其核苷酸序列如SEQIDNO：68所示。本發(fā)明還提供的了一種細菌16SrRNA多重測序文庫構(gòu)建試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒包含本發(fā)明所述的一組用于構(gòu)建16SrRNA多重測序文庫的PCR引物。上述一種細菌16SrRNA多重測序文庫構(gòu)建試劑盒還可以包含基因組DNA提取試劑、DNA聚合酶、16SrRNA測序接頭添加試劑。本發(fā)明還提供了上述一種細菌16SrRNA多重測序文庫構(gòu)建試劑盒在細菌多樣性檢測中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)、本發(fā)明提供的Index充分考慮到索引標簽之間的序列差異程度、堿基識別率以及測序反應(yīng)對不同Index序列的數(shù)據(jù)產(chǎn)出偏好性。本發(fā)明提供的Index的序列避免了序列之間出現(xiàn)3或3個以上連續(xù)的相同堿基的出現(xiàn)，極大程度的降低了其序列合成或測序過程中可能出現(xiàn)的錯誤率；標簽包含入建庫或測序引物中后，盡可能地避免了出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)或與測序引物及其反向互補序列相同的現(xiàn)象；將其包含于測序或建庫引物后，混合測序反應(yīng)得到的測序數(shù)據(jù)平衡性相對較好。(2)、本發(fā)明提供的用于構(gòu)建16SrRNA多重測序文庫的PCR引物在常規(guī)16SrRNA擴增引物的基礎(chǔ)上添加了本發(fā)明提供的Index，以及長度為28-36個堿基的接頭序列，并意外發(fā)現(xiàn)由此構(gòu)成的PCR引物除了能夠?qū)δc道等樣品獲得特異性較高的16SrRNA擴增產(chǎn)物之外，還非常適用于土壤樣品，在擴增土壤樣品中的16SrRNA時，特異性強，目的擴增條帶清晰、無彌散現(xiàn)象，極大程度地保證了后續(xù)測序反應(yīng)和研究結(jié)果的準確性，使得土壤樣品中細菌多樣性研究更加高效便捷準確。(3)、本發(fā)明提供的用于構(gòu)建16SrRNA測序文庫的PCR引物，通過正向引物組合反向引物組中的引物引入本發(fā)明提供的Index，獲得的擴增產(chǎn)物中含有兩個Index標簽，將該Index用于混合樣品測序，實現(xiàn)對不同測序文庫的區(qū)分。附圖說明圖1為實驗例1步驟(2)中的擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為對比例1中的擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。具體實施方式以下實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。對所公開的實施例的下述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例中，而是可以應(yīng)用于符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的更寬的范圍。雖然在本發(fā)明的實施或測試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。本發(fā)明中的術(shù)語“ddH2O”指雙蒸水。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。SoilDNAKit購自O(shè)mega公司；KOD-Plus-Neo購自TOYOBO公司；引物合成委托生工生物工程股份有限公司進行；100個不同來源的土壤樣品由中科院北京基因組研究所提供。實施例1一組用于構(gòu)建16SrRNA多重測序文庫的PCR引物由20條引物組成，其中正向引物組由以下10條引物組成：本發(fā)明所述的引物F1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；本發(fā)明所述的引物F2，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；本發(fā)明所述的引物F4，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；本發(fā)明所述的引物F5，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；本發(fā)明所述的引物F7，其核苷酸序列如SEQIDNO：7所示；本發(fā)明所述的引物F8，其核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；本發(fā)明所述的引物F9，其核苷酸序列如SEQIDNO：9所示；本發(fā)明所述的引物F10，其核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；本發(fā)明所述的引物F12，其核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；本發(fā)明所述的引物F13，其核苷酸序列如SEQIDNO：13所示；其中反向引物組由以下10條引物組成：本發(fā)明所述的引物R14，其核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；本發(fā)明所述的引物R15，其核苷酸序列如SEQIDNO：15所示；本發(fā)明所述的引物R16，其核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；本發(fā)明所述的引物R18，其核苷酸序列如SEQIDNO：18所示；本發(fā)明所述的引物R19，其核苷酸序列如SEQIDNO：19所示；本發(fā)明所述的引物R20，其核苷酸序列如SEQIDNO：20所示；本發(fā)明所述的引物R22，其核苷酸序列如SEQIDNO：22所示；本發(fā)明所述的引物R23，其核苷酸序列如SEQIDNO：23所示；本發(fā)明所述的引物R25，其核苷酸序列如SEQIDNO：25所示；本發(fā)明所述的引物R26，其核苷酸序列如SEQIDNO：26所示。實驗例1細菌多樣性檢測應(yīng)用構(gòu)建100個不同來源的土壤樣品的細菌16SrRNA多重測序文庫(1)、樣品基因組DNA的提?。河肧oilDNAKit提取土壤樣品中的基因組DNA，提取步驟參見產(chǎn)品說明書。(2)、PCR擴增16SrRNA：以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，利用本發(fā)明實施例1中提供的PCR引物擴增樣品中的16SrRNA，其中正向引物組和反向引物組中的引物兩兩配對，獲得100個不同引物對，用于100個不同樣品的PCR擴增。PCR反應(yīng)體系如下表所示：成分含量基因組DNA(10ng/μL)2μL引物(10μM)各0.75μLMgSO4(25mM)3μLdNTPs(2mM)5μL10×KOD-Plus-NeoBuffer5μLKOD-Plus-Neo1μLddH2O32.5μL共計50μLPCR程序如下表所示：對獲得的100個擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度0.8％，電泳結(jié)果顯示采用本發(fā)明提供的引物獲得的16SrRNA擴增產(chǎn)物條帶清晰，無彌散現(xiàn)象。由于樣品數(shù)量較多，在此展示1-24號樣品的電泳結(jié)果，如圖1所示，目的條帶清晰，無彌散現(xiàn)象；第25-100號樣品的電泳結(jié)果和1-24號相同或相似。(3)、添加測序接頭：分別以步驟(2)獲得的100個擴增產(chǎn)物作為模板，利用以下引物對進行PCR擴增，以下引物中含有IlluminaMiSeq測序平臺的測序接頭。5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTG-3’；5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3’。PCR反應(yīng)體系如下表所示：PCR程序如下表所示：使用AgencourtAMPureXP磁珠純化步驟(3)獲得的100個擴增產(chǎn)物，純化后的100個擴增產(chǎn)物混合后即為100個不同來源的土壤樣品的細菌16SrRNA多重測序文庫。對比例1以下引物對1和引物對2分別為常規(guī)16SrRNA擴增引物和Illunima公司提供的16SrRNA測序文庫構(gòu)建引物。引物對1：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’引物對2：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’；5’-GTCTCGTGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’。利用上述兩個引物對本發(fā)明實驗例1中使用的100個不同來源的土壤樣品中的隨機50個土壤樣品中的16SrRNA進行擴增。樣品基因組DNA的提取方法同本發(fā)明實驗例1步驟(1)，PCR體系和PCR程序同本發(fā)明實驗例1步驟(2)。將獲得的2份50個不同擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度和電泳條件同實驗例1步驟(2)。電泳結(jié)果顯示：采用引物對1和引物對2獲得的16SrRNA擴增產(chǎn)物目的條帶不清晰，彌散嚴重。由于樣品數(shù)量較多，在此展示對比例1中引物對1對1-24號樣品的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果，如圖2所示，擴增產(chǎn)物目的條帶不清晰，彌散嚴重；本對比例中其余樣品的電泳結(jié)果與圖2相同或相似。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3