本申請為國際申請日2012年5月4日、國際申請?zhí)杙ct/ep2012/058259于2013年11月6日進(jìn)入中國國家階段、申請?zhí)?01280022096.0、發(fā)明名稱“包含內(nèi)部標(biāo)記引物的核酸的測序、擴(kuò)增和檢測方法”的分案申請。

本發(fā)明屬于生物學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域，特別是分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體來說，本發(fā)明涉及用于核酸測序或擴(kuò)增和檢測的方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

如今，分子方法在診斷學(xué)和鑒定個(gè)體，例如在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域或親子鑒定中發(fā)揮重要作用。靶區(qū)域的擴(kuò)增是這些方法中的中心程序。此外，方法包括在大多數(shù)情況下通過凝膠電泳如毛細(xì)管電泳來分析被擴(kuò)增靶區(qū)域的長度。被擴(kuò)增材料的分析通過熒光標(biāo)記物的檢測來進(jìn)行。將標(biāo)記物附連到用于擴(kuò)增的位點(diǎn)特異性引物的5’-末端。然而，當(dāng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，小的干擾性人為峰、即所謂的“染料污跡(dyeblobs)”的出現(xiàn)，導(dǎo)致基線具有高的“背景噪音”，這干擾了方法的靈敏度。“染料污跡”是電泳圖中不代表特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，而是代表包含標(biāo)記物的降解產(chǎn)物的峰。造成它們的分子是游離的熒光染料標(biāo)記物以及與標(biāo)記物相連的1-8bp長的寡核苷酸。后者可能代表降解的引物或降解的pcr產(chǎn)物。

現(xiàn)在，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，內(nèi)部標(biāo)記的寡核苷酸引物的使用減少了染料污跡的出現(xiàn)。因此，本申請?zhí)峁┝擞糜跍y序或擴(kuò)增和檢測核酸的方法，所述方法包括使用內(nèi)部標(biāo)記的核酸引物。使用內(nèi)部標(biāo)記的引物的技術(shù)效果是提供了具有更高靈敏度的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明解決了上面提到的問題，并提供了用于測序或擴(kuò)增和檢測核酸的方法，所述方法包括下列步驟：

i)提供至少一種核酸引物，其包含至少一個(gè)標(biāo)記的核苷酸，

ii)提供酶和試劑，其使用所述至少一種標(biāo)記的核酸引物來擴(kuò)增靶核酸，

iii)將反應(yīng)組分在適合于靶核酸引物的擴(kuò)增的條件下溫育，

iv)通過標(biāo)記的核苷酸來檢測擴(kuò)增的核酸，

其中所述核酸引物包含下列序列：

5’-naxnb-3’，

其中n可以是任意核苷酸或修飾的核苷酸，

其中a和b表示核苷酸數(shù)量，并可以在1至150的范圍內(nèi)；

并且其中x是所述至少一個(gè)標(biāo)記的核苷酸。

在本文中，“核酸引物”是指適用于擴(kuò)增的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，為了適用于擴(kuò)增，3’-末端應(yīng)該可以通過聚合酶進(jìn)行延伸。核酸引物可以使用任何適合的方法來制備，例如磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自動(dòng)化實(shí)施方式。在一種這樣的自動(dòng)化實(shí)施方式中，使用二乙基-亞磷酰胺作為起始原料，其可以如beaucage等，tetrahedronletters,22:1859-1862(1981)所述進(jìn)行合成，該文獻(xiàn)通過引用并入本文。一種在修飾的固體支持物上合成寡核苷酸的方法描述在美國專利號4,458,006中，所述專利通過引用并入本文。還可以使用從生物樣品(例如限制性內(nèi)切酶消化物)分離的引物。核酸引物的長度可以各不相同。長度可以適應(yīng)于需要。

在本發(fā)明的方法的情形中，“核酸”是指樣品中特定類型的核酸，尤其是rna、dna、cdna(互補(bǔ)dna)、lna(鎖核酸)、mrna(信使rna)、mtrna(線粒體的)、rrna(核糖體rna)、trna(轉(zhuǎn)運(yùn)rna)、nrna(核rna)、sirna(短干擾rna)、snrna(小核rna)、snorna(小核仁rna)、scarna(小卡哈爾體特異性rna)、microrna、dsrna(雙鏈rna)、核酶、核糖開關(guān)、病毒rna、dsdna(雙鏈dna)、ssdna(單鏈dna)、質(zhì)粒dna、粘粒dna、染色體dna、病毒dna、mtdna(線粒體dna)、ndna(核dna)、或sndna(小核dna)等，或可以與樣品中主體核酸區(qū)分開的任何其他類型或亞類的核酸。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用內(nèi)部標(biāo)記的核酸引物導(dǎo)致引起染料污跡的片段減少。如果擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測之前必須按照其長度進(jìn)行分離，則染料污跡是特別不想要的。因此，在本發(fā)明方法的一種實(shí)施方式中，步驟iv)優(yōu)選地在通過標(biāo)記的核苷酸檢測擴(kuò)增的核酸之前，包括按照長度分離擴(kuò)增的核酸的步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解按照核酸長度分離核酸的大量方法。一種常用方法是凝膠電泳。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，使用凝膠電泳對擴(kuò)增的核酸按照其大小進(jìn)行分離。凝膠電泳是使用施加于凝膠基質(zhì)的電場來分離核酸分子的技術(shù)。術(shù)語“凝膠”是指用于包含、然后分離靶分子的基質(zhì)。在大多數(shù)情況下，凝膠是交聯(lián)聚合物，其組成和孔隙度根據(jù)待分析的靶的具體重量/長度和組成來選擇。當(dāng)分離小核酸(dna、rna或寡核苷酸)時(shí)，凝膠通常由不同濃度的丙烯酰胺和交聯(lián)劑構(gòu)成，產(chǎn)生不同網(wǎng)孔尺寸的聚丙烯酰胺網(wǎng)狀物。丙烯酰胺可以是例如丙烯酰胺、直鏈聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺或聚異丙基丙烯酰胺。當(dāng)分離較大核酸(大于幾百堿基)時(shí)，可以選擇純化的瓊脂糖作為基質(zhì)。在兩種情形中，凝膠形成固體但有孔的基質(zhì)。瓊脂糖由沒有交聯(lián)的不帶電荷的糖類的無分支長鏈構(gòu)成，產(chǎn)生具有大孔的凝膠，允許分離大分子和大分子復(fù)合物。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，用于分離核酸的基質(zhì)是聚丙烯酰胺或瓊脂糖。

凝膠電泳使用在法醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)和生物化學(xué)中。通過用成像裝置將凝膠中標(biāo)記的核酸可視化，可以對結(jié)果進(jìn)行定量分析，所述成像裝置通常包含激發(fā)標(biāo)記物熒光的光源，例如激光。用檢測裝置記錄來自于標(biāo)記物的信號，并測量條帶或斑點(diǎn)的強(qiáng)度。測量和分析大多使用專門的軟件來進(jìn)行，所述軟件將檢測到的信號按照核酸的長度和被檢測核酸的量轉(zhuǎn)變成電泳圖。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，擴(kuò)增的核酸的分離通過毛細(xì)管凝膠電泳來進(jìn)行。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解在內(nèi)部位置標(biāo)記寡核苷酸的方法。一種可能方法是將標(biāo)記物附連于核堿基，例如核堿基的環(huán)外氨基(在本文中也稱為胺基)，另一種可能方法是將標(biāo)記物附連于糖的2’-碳。

“環(huán)外”是指位于環(huán)狀化學(xué)結(jié)構(gòu)的環(huán)外部的基團(tuán)，例如環(huán)的一部分取代基對于環(huán)來說是環(huán)外的。當(dāng)在本文中使用時(shí)，環(huán)外胺基是指作為雜環(huán)堿基的環(huán)的取代基的胺基，并包括胺基的氮直接附連于環(huán)結(jié)構(gòu)的成員的實(shí)施方式，還包括胺基的氮可以通過居間基團(tuán)連接到雜環(huán)堿基的環(huán)結(jié)構(gòu)的實(shí)施方式。

此外，可以將標(biāo)記物連接到2’-修飾的核苷酸，例如，將胺基直接附連于糖的2’-碳，或者胺基的氮可以通過居間基團(tuán)連接到糖的2’-碳。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將標(biāo)記物通過環(huán)外胺基連接到所述被標(biāo)記核苷酸(x)或連接到所述被標(biāo)記核苷酸(x)的修飾的2’-位置。在優(yōu)選實(shí)施方式中，將標(biāo)記物連接到被標(biāo)記核苷酸(x)的環(huán)外氨基。在優(yōu)選實(shí)施方式中，將標(biāo)記物連接到胸腺嘧啶的環(huán)外胺基。

標(biāo)記寡核苷酸的可能方法對于專業(yè)技術(shù)人員來說是已知的，包括但不限于氨基-修飾物-c6’-dtcep(例如5-[n-(三氟乙?；被夯?-3-丙烯酰亞胺基]，也稱為5-[e-2-[n-[6-(三氟乙酰胺基)己基]甲酰胺基]乙烯基])、氨基-修飾物-c2-dtcep、5-氨基烯丙基-ducep、氨基-修飾物-c6-dacep、氨基-修飾物-c6-dgcep(例如3'-o-[(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦基]-5'-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-n2-[(二甲基氨基)亞甲基]-n8-[6-(三氟乙?；被?己基]-2'-脫氧鳥苷)、氨基-修飾物-15-dtcep(例如3’-o-[(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦基]-5’-o-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-5-[e-2’-[n-[15-(三氟乙酰胺基)-7-氮雜-10,13-二氧雜-8-氧基十五烷基]甲酰胺基]乙烯基]-2’-脫氧尿苷、2’-o-氨基連接物-ucep(例如3'-o-[(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦基]-5'-o-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-o-2-[2-(三氟乙酰胺基)乙氧基]乙基尿苷)和2'-氨基-d-尿苷。

標(biāo)記的核苷酸(x)在核酸引物中的位置可以變化。然而，由于本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)內(nèi)部標(biāo)記的核酸引物減少電泳圖中染料污跡的出現(xiàn)，因此本發(fā)明的核酸引物被內(nèi)部標(biāo)記，即標(biāo)記的核苷酸不是在核酸引物的5’-或3’-位置處的核苷酸。因此，在本發(fā)明的核酸引物中，“a”和“b”至少為1。“a”和“b”的值取決于標(biāo)記的核苷酸的內(nèi)部位置和核酸引物的總長度。在優(yōu)選實(shí)施方式中，“a”和/或“b”在1至150之間，優(yōu)選地在2至50之間，甚至更優(yōu)選地在3至25之間，更優(yōu)選地在4至17之間。在其他實(shí)施方式中，“a”在1至150之間，優(yōu)選地在2至50之間，甚至更優(yōu)選地在3至25之間，更優(yōu)選地在4至17之間。在其他實(shí)施方式中，“b”在1至150之間，優(yōu)選地在2至50之間，甚至更優(yōu)選地在3至25之間，更優(yōu)選地在4至17之間。本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記的核苷酸越處于引物的中央位置中，減少染料污跡的效果越強(qiáng)。因此，在一種實(shí)施方式中，“a”和“b”相差15或更小，優(yōu)選地相差10或更小，更優(yōu)選地相差5或更小。在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，“a”和“b”具有相同的值。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)“a”和“b”為10時(shí)，減少染料污跡的效果達(dá)到最高。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，“a”和“b”為10。然而，專業(yè)技術(shù)人員可以根據(jù)引物的長度和序列改變標(biāo)記物的確切位置。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會理解，在整個(gè)分子中，核苷酸或修飾的核苷酸(n)不必是相同的，例如，如果“a”和“b”為5，這不意味著在得到的序列nnnnnxnnnnn中所有的“n”都是相同核苷酸。此外，專業(yè)技術(shù)人員將根據(jù)待擴(kuò)增的靶核酸來選擇核酸引物的核苷酸或修飾的核苷酸，即他將選擇與靶核酸的一部分互補(bǔ)的序列。

可以根據(jù)需要并根據(jù)所需的特異性來改變核酸引物的長度，例如，較長引物具有較高特異性程度。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸引物具有約3至300nt之間，更優(yōu)選地約5至100nt之間，甚至更優(yōu)選地約6至50nt之間的總長度。在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸引物具有15至34nt之間的總長度。

通過本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)的技術(shù)效果，可以在大量不同標(biāo)記物上觀察到。因此，它原則上可以使用適合于標(biāo)記核酸的任何標(biāo)記物來進(jìn)行。然而，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，標(biāo)記物選自由熒光團(tuán)、生色團(tuán)、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光物和酶構(gòu)成的標(biāo)記物組。在優(yōu)選實(shí)施方式中，標(biāo)記物是熒光團(tuán)，其優(yōu)選地選自包含下列熒光團(tuán)的熒光團(tuán)組：5-或6-羧基熒光素(fam^tm)，vic^tm，ned^tm，熒光素，熒光素異硫氰酸酯(fitc)，ird-700/800，花青染料例如cy3^tm，cy5^tm，cy3.5^tm，cy5.5^tm，cy7^tm，氧雜蒽，6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯熒光素(hex)，6-羧基-1,4-二氯-2’,7’-二氯-熒光素6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基熒光素(joe^tm)，n,n,n’,n’-四甲基-6-羧基羅丹明(tamra^tm)，6-羧基-x-羅丹明(rox)，5-羧基羅丹明-6g(r6g5)，6-羧基羅丹明-6g(rg6)，羅丹明，羅丹明綠，羅丹明紅，羅丹明110，羅丹明bodipy染料例如bodipytmr，俄勒岡綠，香豆素類例如傘形酮，苯甲酰亞胺類例如hoechst33258，菲啶類例如雅吉瓦黃，alexa350，alexa405，alexa430，alexa488，alexa500，alexa514，alexa532，alexa546，alexa555，alexa568，alexa594，alexa610，alexa633，alexa647，alexa660，alexa680，alexa700，alexa750，溴化乙錠，吖啶染料，咔唑染料，吩噁嗪染料，卟啉染料，聚甲炔染料，atto390，atto425，atto465，atto488，atto495，atto520，atto532，atto550，atto565，atto590，atto594，atto620，atto633，atto647n，atto655，attorhog6，attorho11，attorho12，attorho101，bmn^tm-5，bmn^tm-6，ceq8000d2，ceq8000d3，ceq8000d4，dy-480xl，dy-485xl，dy-495，dy-505，dy-510xl，dy-521xl，dy-521xl，dy-530，dy-547，dy-550，dy-555，dy-610，dy-615，dy-630，dy-631，dy-633，dy-635，dy-647，dy-651，dy-675，dy-676，dy-680，dy-681，dy-700，dy-701，dy-730，dy-731，dy-732，dy-750，dy-751，dy-776，dy-780，dy-781，dy-782，6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基熒光素(joe)，tet^tm，calgold540，calfluorred590，calfluorred610，calfluorred635，700dx，800cw，marinapacific6-(4,7-二氯-2',7'-二苯基-3',6'-二特戊酰熒光素-6-甲酰胺基)-己基-1-o-(2-氰基乙基)-(n,n-二異丙基)-亞磷酰胺(sima)，calgold540，calorange560，calfluorred635，quasar570，quasar670，liz，桑尼維爾紅，lc610，lc640，lc670和lc705。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方式中，標(biāo)記物選自由下列構(gòu)成的熒光團(tuán)組：atto465，dy-485xl，fam^tm，alexa488，dy-495，atto495，dy-510xl，joe，tet^tm，calgold540，dy-521xl，羅丹明atto532，alexa532，hex，sima，attorhog6，vic，calfluororange560，dy-530，tamra^tm，quasar570，cy3^tm，ned^tm，dy-550，atto550，alexa555，calfluorred590，rox，calfluorred610，calfluorred635，atto633，alexa633，dy-630，dy-633，dy-631，liz，quasar670，dy-635和cy5^tm。在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，標(biāo)記物選自由下列構(gòu)成的熒光團(tuán)組：fam^tm，dy-510xl，dy-530和atto550。

在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸引物包含修飾的核苷酸。修飾的核苷酸涵蓋：作為標(biāo)記的核苷酸的核苷酸，其選自包含上文中列出的標(biāo)記物的核苷酸；修飾的核苷酸；脫堿基位點(diǎn)；和淬滅劑。專業(yè)技術(shù)人員能夠根據(jù)需要從大量不同核苷酸類型中選出適合的核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施方式中，每個(gè)n獨(dú)立地選自胸苷、腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷和次黃苷。還涵蓋核苷酸堿基，其中所述核苷酸堿基是例如次黃嘌呤、黃嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、黃嘌呤核苷(xanthinosine)、7-甲基鳥苷、5,6-二氫尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氫尿苷、5-甲基胞苷。因此，在一種實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)“n”是修飾的核苷酸。

在本文中，“修飾的核苷酸”是指非天然核苷酸?！靶揎椀暮塑账帷睘楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所公知。然而，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，修飾的核苷酸選自鎖核酸(lna)或肽核酸(pna)、如上文中所列出的標(biāo)記的核苷酸、連接到淬滅劑的核苷酸、和脫堿基位點(diǎn)。

“淬滅”是指降低給定物質(zhì)的熒光強(qiáng)度的任何過程。在本發(fā)明的情形中，“淬滅劑”是指適合于淬滅例如標(biāo)記物的基本熒光而不激活的殘基。各種不同過程可以導(dǎo)致淬滅，例如激發(fā)態(tài)反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)移、復(fù)合物形成和碰撞引起的淬滅。因此，淬滅通常嚴(yán)重依賴于壓力和溫度。分子氧和碘離子是常見的化學(xué)淬滅劑。淬滅為非即時(shí)光譜測定法例如激光誘導(dǎo)的熒光提出了問題。淬滅是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)測定法的基礎(chǔ)。與特異性分子生物學(xué)靶相互作用后的淬滅和解淬滅，是用于分子成像的可激活光學(xué)造影劑的基礎(chǔ)。存在幾種不同的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制：兩種染料即供體和受體之間的非輻射性機(jī)制(沒有光子吸收或發(fā)射)，共振能量轉(zhuǎn)移，dexter能量轉(zhuǎn)移，激發(fā)復(fù)合體(激發(fā)態(tài)復(fù)合物)形成和靜態(tài)淬滅(也稱為接觸淬滅)。專業(yè)技術(shù)人員能夠根據(jù)需要選擇淬滅劑。

在本發(fā)明的情形中，“脫堿基位點(diǎn)”(也稱為ap位點(diǎn)(脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)))是核酸/寡核苷酸中既沒有嘌呤也沒有嘧啶堿基的位置。脫堿基位點(diǎn)已在“用于提高雜交和引發(fā)特異性的組合物和方法”(compositionsandmethodsforenhancinghybridizationandprimingspecificity)(us-b16,361,940)和“用于雜交dna靶的無標(biāo)記物檢測的方法”(methodforlabel-freedetectionofhybridizeddnatarget)(us-b16,579,680)以及“使用含有脫堿基位點(diǎn)的dna鏈在水中進(jìn)行核堿基識別”(useofabasicsite-containingdnastrandsfornucleobaserecognitioninwater，yoshimoto等，jacscommunications,網(wǎng)絡(luò)版，07/04/2003)中提到。

此外，專業(yè)技術(shù)人員將會認(rèn)識到，本發(fā)明的核酸引物可以由不同類型的核酸或修飾的核酸構(gòu)成。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸引物由dna、rna、pna或lna構(gòu)成。

本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，如果通過連接物將標(biāo)記物附連于核酸引物內(nèi)的核苷酸，可以進(jìn)一步增強(qiáng)本發(fā)明的方法的技術(shù)效果。因此，在一種實(shí)施方式中，通過連接物將標(biāo)記物附連于核苷酸。適合的連接物可以包括從現(xiàn)有技術(shù)已知的間隔物。例如，根據(jù)本發(fā)明，可以在標(biāo)記物與核苷酸之間使用包含2至18個(gè)碳原子的連接物例如c5-連接物或c6-連接物。優(yōu)選地，間隔物是支鏈或直鏈氨基連接物。在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，間隔物選自c2-至c18–連接物或氨基連接物，優(yōu)選地，間隔物選自c3-至c12-連接物或氨基連接物。連接物或氨基連接物優(yōu)選地是直鏈烷基。在非常特殊的實(shí)施方式中，間隔物是c5-間隔物或c6-間隔物?？梢允褂冒被B接物將伯氨基并到寡核苷酸的5’-末端、3’-末端、環(huán)外氨基或修飾的2’-位置上?？梢允褂没钚园被?，用標(biāo)記試劑來標(biāo)記寡核苷酸，例如采取n-羥基琥珀酰亞胺酯的形式。

本發(fā)明的方法包括核酸的擴(kuò)增。擴(kuò)增可以通過各種已知擴(kuò)增方法來進(jìn)行。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，擴(kuò)增通過選自下列的方法來進(jìn)行：聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)，等溫?cái)U(kuò)增(例如在walker等，“鏈置換擴(kuò)增—一種等溫體外dna擴(kuò)增技術(shù)”(stranddisplacementamplification--anisothermal,invitrodnaamplificationtechnique)，nucleicacidsres.20(7):1691-6(1992)中)，連接酶鏈反應(yīng)(lcr；例如在landegren等，“連接酶介導(dǎo)的基因檢測技術(shù)”(aligase-mediatedgenedetectiontechnique)，science241:1077-1080,1988或wiedmann等，“連接酶鏈反應(yīng)(lcr)—概述和應(yīng)用”(ligasechainreaction(lcr)--overviewandapplications)，《pcr方法和應(yīng)用》(pcrmethodsandapplications)(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharborlaboratory,ny,1994)pp.s51-s64.)中)，基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(tas)，基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba；kievits等，(1991)jvirolmethods35:273-286)，滾環(huán)擴(kuò)增(rca；例如在liu等，“滾環(huán)dna合成：小的環(huán)狀寡核苷酸作為dna聚合酶的有效模板”(rollingcirclednasynthesis:smallcircularoligonucleotidesasefficienttemplatesfordnapolymerases)，j.am.chem.soc.118:1587-1594(1996)中)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(tma；vuorinen等，(1995)jclinmicrobiol33:1856-1859)，自持序列復(fù)制(3sr)，qβ擴(kuò)增，鏈置換擴(kuò)增(sda)(walker等，(1992)nucleicacidsres20(7):1691-6)，多重置換擴(kuò)增(mda)(dean等，(2002)procnatlacadsciusa99(8):5261-5266)，限制性酶輔助的rca(wang等，(2004)genomeres14:2357–2366)，單引物等溫?cái)U(kuò)增(spia；dafforn等，(2004)biotechniques37(5):854-7)，環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(lamp；notomi等，(2000)nucleicacidsres28(12):e63)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(tma)，解旋酶依賴性擴(kuò)增(hda)，熱穩(wěn)定hda(thda)(an等，(2005)jbiolchem280(32):28952-28958)，smart擴(kuò)增方法(smap；mitani等，(2007)natmethods4(3):257-62))，定量實(shí)時(shí)pcr(qpcr)，反轉(zhuǎn)錄酶pcr(rt-pcr)，sanger測序。

本發(fā)明還涉及用于測序或擴(kuò)增和檢測核酸的試劑盒，所述試劑盒包含：

-包含至少一個(gè)標(biāo)記的核苷酸的核酸引物，

其中所述核酸引物包含下列序列：

5’-naxnb-3’，

其中n可以是任意核苷酸或修飾的核苷酸，

其中a和b表示核苷酸數(shù)量并且可以在1至150的范圍內(nèi)，并且其中x是所述至少一個(gè)標(biāo)記的核苷酸。

如上所概述的用于本發(fā)明方法的核酸引物的實(shí)施方式，也適用于本發(fā)明試劑盒的核酸引物。

如上所概述的，擴(kuò)增方法可以選自不同方法。取決于模板核酸和擴(kuò)增方法，可以將不同酶或試劑合并到本發(fā)明的試劑盒中。在其他實(shí)施方式中，除了核酸引物之外，試劑盒還包含緩沖劑、dntp和/或ntp和/或酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，試劑盒還包含聚合酶。聚合酶可以作為獨(dú)立的反應(yīng)試劑存在于試劑盒中，或者可以以合并的測定混合物例如主混合物的形式與其他試劑盒組分預(yù)先混合在一起。dna聚合酶優(yōu)選地是“熱穩(wěn)定的”，意味著它在用于變性dna鏈的高溫下一般是穩(wěn)定的。更具體來說，熱穩(wěn)定dna聚合酶在pcr中使用的高溫下不顯著失活。這樣的溫度隨著大量反應(yīng)條件，包括ph、鹽濃度和本領(lǐng)域已知的其他條件而變。在本發(fā)明的情形中，優(yōu)選的實(shí)施方式包含可能具有5’-3’外切酶活性的熱穩(wěn)定dna聚合酶或具有降低的或不具有5’-3’外切酶活性的熱穩(wěn)定dna聚合酶。在另一種實(shí)施方式中，熱穩(wěn)定dna聚合酶可能另外具有3’-5’外切酶(校正讀碼)活性。在本領(lǐng)域中已報(bào)道了大量熱穩(wěn)定dna聚合酶。特別有用的聚合酶是從各種棲熱菌屬(thermus)細(xì)菌物種例如水生棲熱菌(thermusaquaticus)、thermusfiliformis、黃棲熱菌(thermusflavus)或嗜熱棲熱菌(thermusthermophilus)獲得的聚合酶。其他有用的熱穩(wěn)定聚合酶從各種其他微生物來源包括thermococcusliteralis、強(qiáng)烈熾熱球菌(pyrococcusfuriosus)、熱袍菌屬菌種(thermotogasp.)以及在wo-a-89/06691(1989年7月27日出版)中描述的微生物獲得。這樣的聚合酶包括但不限于嗜熱棲熱菌(tth)dna聚合酶、水生棲熱菌(taq)dna聚合酶、thermotoganeopalitana(tne)dna聚合酶、海棲熱袍菌(thermotogamaritima)(tma)dna聚合酶、thermococcuslitoralis(tli或vent.(tm).)dna聚合酶、thermuseggertssonii(teg)dna聚合酶、強(qiáng)烈熾熱球菌(pfu)dna聚合酶、deepvent.dna聚合酶、pyrococcuswoosii(pwo)dna聚合酶、pyrococcusspkdd2(kod)dna聚合酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillussterothermophilus)(bst)dna聚合酶、bacilluscaldophilus(bea)dna聚合酶、嗜熱硫化葉菌(sulfolobusacidocaldarius)(sac)dna聚合酶、嗜酸熱原體(thermoplasmaacidophilum)(tac)dna聚合酶、thermusflavus(tfl/tub)dna聚合酶、紅色棲熱菌(thermusruber)(tru)dna聚合酶、thermusbrockianus(dynazyme)dna聚合酶、methanobacteriumthermoautotrophicum(mth)dna聚合酶、分枝桿菌dna聚合酶(mtb,mlep)，及其突變體、變體和衍生物，包括在室溫下無活性并且通過在高溫下溫育可以快速重新獲得全部活性的熱啟動(dòng)聚合酶。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“dntp”是指脫氧核糖核苷三磷酸。這樣的dntp的非限制性實(shí)例是datp、dgtp、dctp、dttp、dutp，其也可以以標(biāo)記的衍生物的形式存在，例如包含熒光標(biāo)記物、放射活性標(biāo)記物、生物素標(biāo)記物。還涵蓋具有修飾的核苷酸堿基的dntp，其中所述核苷酸堿基是例如次黃嘌呤、黃嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、次黃苷、黃嘌呤核苷、7-甲基鳥苷、5,6-二氫尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氫尿苷、5-甲基胞苷。此外，上述分子的ddntp也涵蓋在本發(fā)明中。

當(dāng)在本文中使用前，術(shù)語“ntp”是指核糖核苷三磷酸。這樣的ntp的非限制性實(shí)例是atp、gtp、ctp、ttp、utp，其也可以以標(biāo)記的衍生物的形式存在，例如包含熒光標(biāo)記物、放射活性標(biāo)記物、生物素標(biāo)記物。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的試劑盒或核酸引物在測序或擴(kuò)增和檢測核酸的方法中的使用。上文中描述的核酸引物的實(shí)施方式，也適用于所使用的核酸引物的實(shí)施方式。

附圖說明

圖1：通過內(nèi)部標(biāo)記的引物改良基線。使用各0.4μm正向和反向引物，進(jìn)行不使用模板dna的pcr。隨后通過毛細(xì)管電泳分析pcr探針。在上方的電泳圖中，示出了使用標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)記引物的無模板對照(ntc)pcr的結(jié)果(a)。使用內(nèi)部標(biāo)記的引物的ntc-pcr的結(jié)果示出在b中。內(nèi)部標(biāo)記的引物在70至550bp之間的范圍內(nèi)不引起任何假陽性信號，基線絕對平坦。

圖2：內(nèi)部染料偶聯(lián)位置的影響。對引物epl11-y在各種不同內(nèi)部引物位置處進(jìn)行熒光標(biāo)記(參見表1)。示出了使用0.4μm引物(終濃度)但是不使用模板dna的pcr后毛細(xì)管電泳的結(jié)果。染料越偶聯(lián)于引物的中間，出現(xiàn)的人為峰越少。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例

實(shí)施例1

在這些實(shí)施例中的pcr如下進(jìn)行：

使用0.2μlmultitaq2dna聚合酶(qiagen,hilden,germany)作為熱啟動(dòng)dna聚合酶。使用2.5μlreactionmixb(qiagen,hilden,germany)作為pcr緩沖溶液。使用0.4μm內(nèi)部標(biāo)記的正向引物d16-p-intern(5’-gggggtctaagagcxtgtaaaaag-3’；seqidno.1；其中x表示連接到胸苷核苷酸的環(huán)外氨基的atto550)或0.4μm標(biāo)記的正向引物d16-p-atto550(5’-atto550-gggggtctaagagcttgtaaaaag-3’；seqidno.2)與0.4μm未標(biāo)記的d16_rev反向引物(5’-gtttgtgtgtgcatctgtaagcatgtatc-3’；seqidno.3)的組合進(jìn)行pcr，所有引物由biomers.net(ulm,germany)生產(chǎn)。

表1：

用無核酸酶的水(qiagen,hilden,germany)補(bǔ)足25μl的體積。

pcr使用9700pcrsystemgold熱循環(huán)儀(lifetechnologiescorporation,carlsbad,ca,usa)，按照下列方案來進(jìn)行：

表2：用于實(shí)施例1的循環(huán)條件

向12μlhi-diformamid(lifetechnologiescorporation,carlsbad,ca,usa)和0.5μldna尺寸標(biāo)準(zhǔn)品550(bto)(qiagen,hilden,germany)加入1μl循環(huán)的pcr探針，并在95℃溫育3分鐘。

通過毛細(xì)管電泳，使用3500geneticanalyzer(lifetechnologiescorporation,carlsbad,ca,usa)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下分析變性的pcr探針。

在圖1中示出的結(jié)果清楚地證實(shí)，使用內(nèi)部標(biāo)記的引物導(dǎo)致普通背景噪音的不想要的人為峰的降低。在70至550bp范圍內(nèi)的基線絕對干凈，即沒有任何背景峰或染料污跡。相反，在5’末端標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)pcr引物產(chǎn)生大量人為峰，其具有高達(dá)500個(gè)相對熒光單位(rfu)。使用最少量模板dna的pcr擴(kuò)增通常產(chǎn)生的pcr產(chǎn)物給出200rfu左右的峰。使用標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)記引物，電泳圖的解釋受到大量高的人為峰(染料污跡)的損害，導(dǎo)致對探針的不完整的評價(jià)。使用內(nèi)部標(biāo)記的引物，由于沒有可見的染料污跡，可以清楚地辨別和指派200rfu的pcr產(chǎn)物。這些改進(jìn)在方法的靈敏度方面提供了巨大優(yōu)勢。

實(shí)施例2

當(dāng)使用在任何內(nèi)部堿基處標(biāo)記的引物時(shí)，背景噪音的強(qiáng)烈減少是明顯的。然而，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中顯示，通過選擇內(nèi)部標(biāo)記物在引物中的位置，可以進(jìn)一步增強(qiáng)這種效果。

引物在epl-11-y序列的不同堿基對位置處被標(biāo)記(seqidno.4至9；參見表1)。如實(shí)施例1中所述進(jìn)行分析，使用引物epl11/2(5’-gaacaactctggttgtattgtcttc-3’；seqidno.10)作為反向引物和下列循環(huán)條件。

表3：用于實(shí)施例2的循環(huán)條件

圖2中示出的結(jié)果證實(shí)，通過將標(biāo)記物的內(nèi)部位置選擇成接近引物的中間位置，可以進(jìn)一步增強(qiáng)基線平滑效果。

序列表

<110>凱杰有限公司

<120>包含內(nèi)部標(biāo)記引物的核酸的測序、擴(kuò)增和檢測方法

<130>b051-0080wo1

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