本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗氧化活性的鱟血漿蛋白水解肽及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人的身體在代謝正常的情況下自由基處在不斷產(chǎn)生和不斷消除的動(dòng)態(tài)平衡中，但是由于外界環(huán)境的影響，如太陽(yáng)光的輻射，吸入污染的氣體，吸煙等情況下，這種動(dòng)態(tài)平衡極易被破壞，當(dāng)平衡破壞后，過多的自由基積累不僅會(huì)造成身體正常組織的損害，還有可能引起一些嚴(yán)重的疾病如腫瘤、心臟病和老年癡呆等。為了防止或減輕自由基造成的損害，需要合適的自由基清除劑來去除身體里多余的自由基，保障人們身體健康。
現(xiàn)有的自由基清除劑存在半衰期短、給藥不方便、易引起過敏反應(yīng)的缺點(diǎn)，有些自由基清除劑只對(duì)部分自由基的清除有效，并且現(xiàn)有的自由基清除劑還存在毒性大、價(jià)格昂貴等弊端。因此，尋找高效、穩(wěn)定、低毒、實(shí)用的自由基清除劑一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者孜孜以求的目標(biāo)。
鱟血資源珍貴，蛋白含量高，含有人體所必須的8種必須氨基酸以及多種微量元素，存在著多種具有抗菌抗內(nèi)毒素的小分子活性多肽。我國(guó)對(duì)鱟血的利用研究，主要是提取鱟血中的變形細(xì)胞，然后從變形細(xì)胞中分離具有抗菌抗內(nèi)毒素活性的小分子活性肽并生產(chǎn)鱟試劑，國(guó)內(nèi)外正著手以鱟血內(nèi)源性多肽為先導(dǎo)化合物開發(fā)新的抗菌、抗病毒、抗腫瘤藥物，但是鱟血分離變形細(xì)胞后剩余的鱟血漿由于銅含量超出人類食用標(biāo)準(zhǔn)，鱟血漿一般作為廢物被丟棄，這就造成了極大的浪費(fèi)。截至目前，對(duì)鱟血漿蛋白水解肽的直接研究國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道，隨著人們對(duì)肽類食品和藥品的需要，特別是一些病人和特殊人群，如患消化道疾病、低過敏性患者、老年人、運(yùn)動(dòng)員等，研究鱟血水解肽及其制備方法的意義重大。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有抗氧化活性的鱟血漿蛋白水解肽的制備方法，該方法制備得到的鱟血漿蛋白水解肽具有較高的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力，并實(shí)現(xiàn)了鱟血漿的充分利用。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的鱟血漿蛋白水解肽。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述鱟血漿蛋白水解肽的應(yīng)用。
一種具有抗氧化活性的鱟血漿蛋白水解肽的制備方法，所述制備方法具體包括如下步驟：
S1：將鱟血漿于70～100℃條件下恒溫水浴2～4小時(shí)，然后將鱟血漿抽濾并用水洗滌，備用；
S2：使用蛋白酶水解步驟S1所得鱟血漿，然后將鱟血漿水解液離心分離得上清液備用；
S3：將步驟S2所得上清液過SephadexG-50葡聚糖凝膠柱，收集在波長(zhǎng)230nm處吸光度最大的組分即得鱟血漿蛋白水解肽。
鱟血漿蛋白是銅藍(lán)蛋白，其中銅含量高達(dá)144.21ug/mL，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.13中規(guī)定水產(chǎn)類食品含銅量要小于等于50mg/kg，所以鱟血漿是不能直接食用的，只有經(jīng)過降銅后鱟血漿才能被人食用。鱟血漿蛋白經(jīng)過熱處理后會(huì)變性，易于被蛋白酶水解成肽。發(fā)明人在對(duì)鱟血漿蛋白進(jìn)行水解處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，一定溫度下的水浴一方面能夠使鱟血漿蛋白變性成沉淀析出，另一方面還可以脫去鱟血漿蛋白中的銅離子，從而降低鱟血漿蛋白的銅含量。S1步驟中水浴溫度的高低會(huì)直接影響到鱟血漿蛋白的水解率和所得水解肽中的銅含量。發(fā)明人經(jīng)過眾多嘗試之后發(fā)現(xiàn)當(dāng)步驟S1中恒溫水浴的溫度為70～100℃時(shí)，鱟血漿蛋白具有較高的水解率和較低的銅含量。
優(yōu)選地，步驟S1中恒溫水浴的溫度為90℃。
優(yōu)選地，步驟S1中恒溫水浴的時(shí)間為3小時(shí)。
優(yōu)選地，步驟S2中的蛋白酶為胰蛋白酶、胰酶或木瓜蛋白酶中的一種或幾種；更為優(yōu)選地，步驟S2中的蛋白酶為胰蛋白酶。
優(yōu)選地，所述蛋白酶的濃度為2～4%，更為優(yōu)選地，所述蛋白酶的濃度為3%。
優(yōu)選地，步驟S2中，水解體系的pH為7.0～9.0；更為優(yōu)選地，所述pH為8.0。
上述制備方法制備得到的具有抗氧化活性的鱟血漿蛋白水解肽，該鱟血漿蛋白水解肽具有較高的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力，對(duì)DPPH自由基的清除的IC50值為6.2ug/mL，總抗氧化能力FRAP值為81.5umol/L。
上述具有抗氧化活性的鱟血漿蛋白水解肽在制備具有抗氧化活性制劑中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
（1）本發(fā)明提供的方法制備得到的鱟血漿蛋白水解肽具有較高的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力，并且鱟血漿蛋白水解肽對(duì)自由基的清除率隨樣品濃度增加而升高，當(dāng)濃度增加到一定條件時(shí)，自由基清除率的升高水平趨于平緩；鱟血漿蛋白水解肽對(duì)DPPH自由基的清除的IC50值為6.2ug/mL，總抗氧化能力FRAP值為81.5umol/L。
（2）本發(fā)明提供的方法實(shí)現(xiàn)了鱟血漿的充分利用，制備得到的抗氧化活性的鱟血漿蛋白水解肽無毒，可制備成美容養(yǎng)顏、延緩衰老的保健品以提升鱟血漿蛋白的使用價(jià)值，并且還可以提高人們的生命質(zhì)量。
（3）本發(fā)明提供的鱟血漿蛋白水解肽的制備方法工藝簡(jiǎn)單，易于大規(guī)模生產(chǎn)，具有較大的推廣應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說明，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明作任何限定。除非特別說明，所有本發(fā)明提供的實(shí)施例中，提供的原材料均可從市面采購(gòu)獲得。
實(shí)施例1
（1）將鱟血在90℃水浴鍋里熱處理3小時(shí)，抽濾，用蒸餾水沖洗變性蛋白；
（2）用胰蛋白酶酶法水解步驟（1）中的變性蛋白獲得水解肽，離心、取上清液備用；
（3）上清液過SephadexG-50葡聚糖凝膠柱，收集在波長(zhǎng)230nm處吸光度最大的組分即得鱟血漿蛋白水解肽，冷凍干燥得到水解肽粉。
實(shí)施例2
（1）將鱟血在100℃水浴鍋里熱處理3小時(shí)，抽濾，用蒸餾水沖洗變性蛋白；
（2）用胰酶酶法水解步驟（1）中的變性蛋白獲得水解肽，離心、取上清液備用；
（3）上清液過SephadexG-50葡聚糖凝膠柱，收集在波長(zhǎng)230nm處吸光度最大的組分即得鱟血漿蛋白水解肽，冷凍干燥得到水解肽粉。
實(shí)施例3
（1）將鱟血在90℃水浴鍋里熱處理4小時(shí)，抽濾，用蒸餾水沖洗變性蛋白；
（2）用胰酶與木瓜蛋白酶的混合酶水解步驟（1）中的變性蛋白獲得水解肽，離心、取上清液備用；
（3）上清液過SephadexG-50葡聚糖凝膠柱，收集在波長(zhǎng)230nm處吸光度最大的組分即得鱟血漿蛋白水解肽，冷凍干燥得到水解肽粉。
對(duì)照例1
（1）鱟血在60℃水浴鍋里熱處理2小時(shí)，抽濾，用蒸餾水沖洗變性蛋白；
（2）用胰蛋白酶酶法水解步驟（1）中的變性蛋白獲得水解肽，離心、取上清液備用；
（3）上清液過SephadexG-50葡聚糖凝膠柱，收集在波長(zhǎng)230nm處吸光度最大的組分即得鱟血漿蛋白水解肽，冷凍干燥得到水解肽粉。
對(duì)照例2
（1）將鱟血在110℃水浴鍋里熱處理3小時(shí)，抽濾，用蒸餾水沖洗變性蛋白三次；
（2）用胰蛋白酶酶法水解步驟（1）中的變性蛋白獲得水解肽，離心、取上清液備用；
（3）上清液過SephadexG-50葡聚糖凝膠柱，收集在波長(zhǎng)230nm處吸光度最大的組分即得鱟血漿蛋白水解肽，冷凍干燥得到水解肽粉。
試驗(yàn)例1 鱟血漿蛋白水解肽的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)
（1）DPPH自由基清除能力的測(cè)定
DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其乙醇溶液呈紫色，在波長(zhǎng)517nm處有強(qiáng)烈吸收；在有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的孤對(duì)電子被配對(duì)，從而使其褪色，褪色程度與其接受電子呈定量關(guān)系，因而可用比色法進(jìn)行定量分析抗氧化劑對(duì)DPPH自由基清除作用大小。清除50% DPPH自由基時(shí)樣品濃度稱為抗氧化劑的IC50值，IC50值越小抗氧化性越好。DPPH自由基清除能力的測(cè)定的步驟具體如下：
分別準(zhǔn)確量取2.0 mL水解肽溶液，加入10 mL比色管中，各加入濃度為0.2μmol/L DPPH溶液2.0 mL，室溫下暗處反應(yīng)30min后，在517nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)公式[(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照]×100%計(jì)算清除率，其中A對(duì)照為未加樣品的DPPH自由基吸光度，即DPPH自由基溶液＋溶劑；A樣品為加入樣品反應(yīng)平衡后的吸光度，即DPPH自由基溶液+樣品溶液。
（2）總抗氧化能力測(cè)定
FRAP法測(cè)定總抗氧化能力的原理是酸性條件下抗氧化物可以還原Fe3+-TPTZ產(chǎn)生藍(lán)紫色的Fe2+-TPTZ，隨后在593nm測(cè)定吸光度，即可作為樣品中的總抗氧化能力的指標(biāo)。總抗氧化能力用FRAP值即Fe2+當(dāng)量數(shù)表示，F(xiàn)RAP值越大，抗氧化活性越強(qiáng)。
采用FRAP法，用移液槍取5個(gè)梯度的水解肽溶液0.1 mL于24孔板中，梯度濃度分別為1mg/ mL、0.5mg/ mL、0.25mg/ mL、0.125mg/ mL、0.0625mg/ mL，加入0.9 mL預(yù)熱至37℃的三價(jià)鐵還原抗氧化能力工作液（FRAP工作液），充分混勻后防放置10min，在波長(zhǎng)593nm處測(cè)量吸光度。以無水乙醇代替樣品加入FRAP工作液作為空白對(duì)照。根據(jù)反應(yīng)后測(cè)定的吸光度計(jì)算相應(yīng)的FeSO4濃度（μmol/L），定義為FRAP值。
（3）血蛋白水解率
取鱟血2.5mL，加入10%TCA2.5mL，混勻靜置10min，4000轉(zhuǎn)/分離心15min，上清液加3mL雙縮脲試劑，混勻靜置10min，2000轉(zhuǎn)/分離心10min。上清液在540nm測(cè)OD1值。測(cè)定的OD1值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求得含量N1。
取鱟血2.5mL，加3.0mL雙縮脲試劑，混勻靜置10min，2000轉(zhuǎn)/分離心10min。上清液在540nm測(cè)OD0值。由標(biāo)準(zhǔn)蛋白回歸方程換算成含量N0。
取水解液2.5mL，加入10%TCA2.5mL，混勻靜置10min，4000轉(zhuǎn)/分離心15min，上清液加3.0mL雙縮脲試劑，混勻靜置10min。2000轉(zhuǎn)/分離心10min。上清液在540nm測(cè)OD2值。由標(biāo)準(zhǔn)蛋白回歸方程換算成蛋白質(zhì)含量N2。
水解率=(N2-N1)/(N0-N1)
（4）Cu含量
按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.13-1996：食品中的銅的測(cè)定方法測(cè)定。
稱取已前處理過的鱟樣品1.000mg，平行3份，與于鋼襯消解內(nèi)罐，加入 5mL 硝酸，1ml過氧化氫，微熱樣品至溶解，靜置過夜，次日再加入 5 mL硝酸和1 ml過氧化氫，把鋼襯消解內(nèi)罐放入不銹鋼外罐中，旋緊罐蓋，置于 130 ℃烘箱，恒溫消解2 h。自然冷卻到室溫，取出內(nèi)罐，將消化液轉(zhuǎn)移到 50 ml容量瓶，用水定容到刻度。用Z-5000原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定Cu含量，儀器的工作條件：波長(zhǎng) 327nm, 燈電流 2.0mA，空氣流量6.5L/min,乙炔流量1.0L/min。
實(shí)施例1～3制備得到的鱟血漿蛋白水解肽及對(duì)照例1～2的抗氧化性能如下表1。
表1 實(shí)施例1～3及對(duì)照例1～2制備得到的鱟血漿蛋白水解肽的抗氧化性能
由上表1可知，實(shí)施例1～3用不同的方法水解鱟血蛋白，得到的水解肽都有一定的抗氧化性；綜合抗氧化性能最好的是實(shí)施例1。各實(shí)施例中，血蛋白水解率依次為：實(shí)施例1〉實(shí)施例2〉實(shí)施例3，這表明酶解最為完全的是實(shí)施例1，胰蛋白酶的水解效率最高。對(duì)照例1和對(duì)照例2盡管水解率和抗氧化都不錯(cuò)，但實(shí)驗(yàn)測(cè)得其Cu含量超過食品標(biāo)準(zhǔn)，得到的水解肽失去使用價(jià)值。