本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種毛霉型豆豉苦味肽的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

毛霉型豆豉是一種歷史悠久的中國特色傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，其滋味鮮美、營養(yǎng)豐富，近年來越來越多的研究表明毛霉型豆豉組成成分還具有保健和治療疾病的作用。因此，數(shù)千年來毛霉型豆豉一直深受中華兒女的喜愛。隨著時代的發(fā)展，毛霉型豆豉的生產(chǎn)模式也變得現(xiàn)代化，但對于毛霉型豆豉苦味肽的研究我國卻落后于日本納豆與韓國豆醬。如何借鑒納豆和豆醬的成功經(jīng)驗，研究透徹毛霉型豆豉苦味肽的結(jié)構(gòu)與其苦味機理是目前研究的重點。

苦味肽是影響毛霉型豆豉滋味表達的重要成分，但目前國內(nèi)外關(guān)于毛霉型豆豉苦味肽的研究報道較少，對于毛霉型豆豉苦味肽的提取無法采用酶解法等人工方法，只能采用直接提取法，而由于缺乏成熟的提取工藝路線使得提取率不高；由于發(fā)酵豆制品復(fù)雜的滋味成分，純化毛霉型豆豉苦味肽的難度也很高，因而國內(nèi)對于毛霉型豆豉苦味肽的結(jié)構(gòu)鑒定處于空白狀態(tài)，也無從研究其結(jié)構(gòu)對其苦味功能的影響。

針對上述問題，本發(fā)明立足于毛霉型豆豉苦味肽的關(guān)鍵問題，研究并優(yōu)化毛霉型豆豉中苦味肽的分離與純化方法，達到制備豆豉苦味肽以及探討毛霉型豆豉苦味肽的結(jié)構(gòu)及其苦味特性的目的。通過發(fā)明的試驗研究，達到通過提取、分離、純化，最終得到影響毛霉型豆豉特征滋味表達的苦味肽的目的，并通過對其進行感官與電子舌分析，進一步了解其苦味特性，為毛霉型豆豉苦味肽的結(jié)構(gòu)研究提供理論依據(jù)與參考，為了解苦味肽的苦味效果及其苦味機理提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。本領(lǐng)域傳統(tǒng)的做法可制備具有較好苦味效果的產(chǎn)品，但產(chǎn)品中雜質(zhì)較多，目標(biāo)產(chǎn)物不明確，純度低，應(yīng)用領(lǐng)域狹隘。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種毛霉型豆豉苦味肽的制備方法及應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有的毛霉型豆豉苦味肽的制備方法制得的苦味肽產(chǎn)品穩(wěn)定性差、純度低等的問題。

一種毛霉型豆豉苦味肽的制備方法，該毛霉型豆豉苦味肽的制備方法包括以下步驟：

(1)、粗肽的制備：精確稱取一定量(10.00g-20.00g)的豆豉樣品，液氮速凍，凍結(jié)狀態(tài)研磨成粉；按料液比1:8-16加去離子水；冰浴勻漿6min-12min；60W-120W下超聲提取20min-40min；調(diào)整pH為5.5-6.5；45℃下攪拌50min-90min；4℃下離心(2000g)15min-30min；取上清液，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液；4℃下離心(10500g)15min-30min；上清液經(jīng)100Da-200Da的透析袋流水透析18h-30h；收集提取液冷凍干燥得粗肽粉末A；

(2)、將粉末A溶于去離子水中使粉末A溶液濃度達到5mg/mL-40mg/mL；采用NKA-II大孔樹脂柱進行純化；首先以去離子水洗脫至平衡；再以20-30％乙醇溶液為洗脫液進行洗脫；收集洗脫組分，濃縮凍干，得粉末B；

(3)、將粉末B溶于去離子水中使粉末B溶液濃度達到5mg/mL-40mg/mL；再采用Sephadex G-25凝膠柱進行純化；以去離子水為洗脫液進行洗脫；收集目標(biāo)峰，濃縮凍干，得粉末C；

(4)、將粉末C溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％TFA三氟乙酸的水溶液中使粉末C溶液濃度達到5mg/mL～10mg/mL；以A相質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％TFA水溶液，B相質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％TFA乙腈溶液為洗脫液；采用半制備型HPLC反相C18柱進行純化和梯度洗脫；收集目標(biāo)峰，濃縮凍干得粉末D；

(5)、將粉末D溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％TFA三氟乙酸的水溶液中使粉末D溶液濃度達到1mg/mL；以A相質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％TFA水溶液，B相質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％TFA乙腈溶液為洗脫液；采用分析型HPLC反相C18柱進行純化和梯度洗脫；收集目標(biāo)峰，濃縮凍干得粉末E，E為豆豉苦味肽I。

進一步，所述的步驟(4)中半制備型HPLC反相C18柱洗脫液的檢測波長為214nm。

進一步，所述的步驟(4)中梯度洗脫程序如下：

0-5min,0-5％B；

5min-20min,5％-20％B；

20min-40min,20％-35％B。

進一步，所述的步驟(5)中梯度洗脫程序如下：

初次分離為：

0-4min,0-0％B；

4min-29min,0-100％B；

29min-35min,100％-100％B；

二次分離為：

0-4min,0-0％B；

4min-14min,0％-40％B；

14min-17min,40％-40％B。

進一步，所述的步驟(5)中分析型HPLC反相C18柱洗脫液的檢測波長為280nm。

進一步，所述的苦味肽I為具有Ala-Phe-Asp-Glu-Lys所示的氨基酸序列的活性肽。

一種所述的豆豉苦味肽I在食品中的應(yīng)用。提供食品豆豉特征的苦味，增加食品的鮮味。

本發(fā)明的毛霉型豆豉苦味肽的制備方法及應(yīng)用所制得的苦味肽I應(yīng)用于食品中，提供食品豆豉特征的苦味，并增加食品的鮮味。該苦味肽易于化學(xué)合成，且合成的產(chǎn)品純度高，穩(wěn)定性好，可擴寬該苦味肽的應(yīng)用領(lǐng)域。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的毛霉型豆豉苦味肽的制備方法的流程示意圖。

具體實施方式

為能進一步了解本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容、特點及功效，茲例舉以下實施例，并配合附圖詳細(xì)說明如下。

如圖1所示，本發(fā)明實施例的毛霉型豆豉苦味肽的制備方法包括以下步驟：

S101：粗肽的制備：精確稱取一定量的豆豉樣品(10.00g)→液氮速凍→凍結(jié)狀態(tài)研磨成粉→按料液比1:8-16加去離子水(如50mL)→冰浴勻漿6min-12min→60W-120W下超聲提取20min-40min→調(diào)整pH為5.5-6.5→45℃下攪拌50min-90min→4℃下離心(2000g)15min-30min→取上清液→重復(fù)提取一次→合并兩次提取液→4℃下離心(10500g)15min-30min→上清液經(jīng)100Da-200Da的透析袋流水透析18h-30h→收集提取液冷凍干燥得粗肽粉末A；

S102：將粉末A溶于去離子水中使其濃度達到5mg/mL-40mg/mL，采用NKA-II大孔樹脂柱進行純化，首先以去離子水洗脫至平衡，再以20-30％乙醇溶液為洗脫液進行洗脫，收集洗脫組分，濃縮凍干，得粉末B；

S103：將粉末B溶于去離子水中使其濃度達到5mg/mL-40mg/mL，再采用Sephadex G-25凝膠柱進行純化，以去離子水為洗脫液進行洗脫，收集目標(biāo)峰，濃縮凍干，得粉末C；

S104：將粉末C溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％TFA三氟乙酸的水溶液中使其濃度達到5mg/mL～10mg/mL，以A相質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％TFA水溶液，B相質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％TFA乙腈溶液為洗脫液，采用半制備型HPLC反相C18柱進行純化和梯度洗脫，收集目標(biāo)峰，濃縮凍干得粉末D；

S105：將粉末D溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％TFA三氟乙酸的水溶液中使其濃度達到1mg/mL，以A相質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％TFA水溶液，B相質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％TFA乙腈溶液為洗脫液，采用分析型HPLC反相C18柱進行純化和梯度洗脫，收集目標(biāo)峰，濃縮凍干得粉末E，E為豆豉苦味肽I。

所述的S104中梯度洗脫程序如下：

0-5min,0-5％B；

5min-20min,5％-20％B；

20min-40min,20％-35％B。

進一步，所述的S105中梯度洗脫程序如下：

初次分離為：

0-4min,0-0％B；

4min-29min,0-100％B；

29min-35min,100％-100％B；

二次分離為：

0-4min,0-0％B；

4min-14min,0％-40％B；

14min-17min,40％-40％B。

所述的步驟S104中半制備型HPLC反相C18柱洗脫液的檢測波長為214nm。

所述的步驟S105中分析型HPLC反相C18柱洗脫液的檢測波長為280nm。

所述的苦味肽I為具有Ala-Phe-Asp-Glu-Lys所示的氨基酸序列的活性肽。

所述的苦味肽I應(yīng)用于食品中，提供食品豆豉特征的苦味，增加食品的鮮味。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步的描述。

實施例1：

粗肽的制備：精確稱取豆豉樣品(10.00g)→液氮速凍→凍結(jié)狀態(tài)研磨成粉→加去離子水(50mL)，冰浴勻漿(8min)→超聲提取(80W,30min)→調(diào)整pH為6.0→攪拌(45℃,60min)→離心(2,000g,4℃,20min)→取上清液→重復(fù)提取一次，合并兩次提取液→離心(10,500g,4℃,20min)→上清液經(jīng)100Da的透析袋流水透析24h→收集提取液冷凍干燥得粗肽粉末A；

粉末A溶于去離子水中使其濃度達到5mg/mL，采用NKA-II大孔樹脂柱進行純化，首先以去離子水洗脫至平衡，再以25％乙醇溶液為洗脫液進行洗脫，收集洗脫組分，濃縮凍干，得粉末B；

將粉末B溶于去離子水中使其濃度達到5mg/mL，再采用Sephadex G-25凝膠柱進行純化，以去離子水為洗脫液進行洗脫，收集目標(biāo)峰，濃縮凍干，得粉末C；

將粉末C溶于0.05％TFA(三氟乙酸)的水溶液中，使其濃度達到5mg/mL～10mg/mL，以A相0.05％TFA水溶液，B相0.05％TFA乙腈溶液為洗脫液，采用半制備型HPLC反相C18柱進行純化和梯度洗脫(梯度洗脫程序如下：0-5min,0-5％B；5-20min,5-20％B；20-40min,20-35％B)，收集目標(biāo)峰，濃縮凍干得粉末D；

將粉末D溶于0.05％TFA(三氟乙酸)的水溶液中使其濃度達到1mg/mL，以A相0.05％TFA水溶液，B相0.05％TFA乙腈溶液為洗脫液，采用分析型HPLC反相C18柱進行純化和梯度洗脫(梯度洗脫程序如下：初次分離為0-4min,0-0％B；4-29min,0-100％B；29-35min,100-100％B；二次分離為0-4min,0-0％B；4-14min,0-40％B；14-17min,40-40％B)，收集目標(biāo)峰，濃縮凍干得粉末E，E為豆豉苦味肽I。

實施例2

粗肽的制備：精確稱取豆豉樣品(20.00g)→液氮速凍→凍結(jié)狀態(tài)研磨成粉→加去離子水(320mL)，冰浴勻漿(12min)→超聲提取(120W,30min)→調(diào)整pH為6.5→攪拌(45℃,90min)→離心(2,000g,4℃,30min)→取上清液→重復(fù)提取一次，合并兩次提取液→離心(10,500g,4℃,30min)→上清液經(jīng)200Da的透析袋流水透析32h→收集提取液冷凍干燥得粗肽粉末A；

將粉末A溶于去離子水中使其濃度達到40mg/mL，采用NKA-II大孔樹脂柱進行純化，首先以去離子水洗脫至平衡，再以30％乙醇溶液為洗脫液進行洗脫，收集洗脫組分，濃縮凍干，得粉末B；

將粉末B溶于去離子水中使其濃度達到40mg/mL，再采用Sephadex G-25凝膠柱進行純化，以去離子水為洗脫液進行洗脫，收集目標(biāo)峰，濃縮凍干，得粉末C；

將粉末C溶于0.05％TFA(三氟乙酸)的水溶液中使其濃度達到10mg/mL，以A相0.05％TFA水溶液，B相0.05％TFA乙腈溶液為洗脫液，采用半制備型HPLC反相C18柱進行純化和梯度洗脫(梯度洗脫程序如下：0-5min,0-5％B；5-20min,5-20％B；20-40min,20-35％B)，收集目標(biāo)峰，濃縮凍干得粉末D；

將粉末D溶于0.05％TFA(三氟乙酸)的水溶液中使其濃度達到1mg/mL，以A相0.05％TFA水溶液，B相0.05％TFA乙腈溶液為洗脫液，采用分析型HPLC反相C18柱進行純化和梯度洗脫(梯度洗脫程序如下：初次分離為0-4min,0-0％B；4-29min,0-100％B；29-35min,100-100％B；二次分離為0-4min,0-0％B；4-14min,0-40％B；14-17min,40-40％B)，收集目標(biāo)峰，濃縮凍干得粉末E，E為豆豉苦味肽I；

實施例3

挑選經(jīng)過培訓(xùn)的8名感官評價員(4名男性，4名女性)，感官評價實驗在23±2℃的感官評價室進行。

通過滋味稀釋分析(TDA)法對樣品進行感官評價以確定其的呈味閾值：取提取物凍干樣品0.1g，溶于9.9mL水中，再每次加10mL水稀釋，進行1:1(體積比)的逐步稀釋，各個組分逐步稀釋的溶液按照濃度增加的順序呈給經(jīng)過訓(xùn)練的評價員，每個稀釋水平溶液采用三點測定法進行評定。當(dāng)某個稀釋水平的溶液與2個空白組之間的滋味差異剛好能被識別出來，記錄此時的稀釋倍數(shù)或者稀釋水平，即稀釋值(TD)。TD值采用各評價員評定結(jié)果的平均值，評定結(jié)果之間的差異應(yīng)低于或等于一個稀釋水平，之后綜合討論對樣品感官進行描述分析。

鮮味增強評價方法：配制含有20mmol/L食鹽和10mmol/L味精的模型溶液(1)以及含有20mmol/L食鹽和0.5mg/mL呈味核苷酸二鈉的模型溶液(2)。評定時將樣品配制成5mg/mL的溶液添加入模型溶液中與標(biāo)準(zhǔn)液進行比較，評價采用評分法，從0～10分表示鮮味從沒有檢出到非常強烈，模型溶液(1)鮮味為3分，模型溶液(2)鮮味為4分的評分標(biāo)準(zhǔn)。以評定小組所有人評分的平均值為樣品基本滋味強度評分，并綜合討論對樣品進行描述性分析。結(jié)果見表1。

表1

利用本發(fā)明所述的技術(shù)方案，或本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明技術(shù)方案的啟發(fā)下，設(shè)計出類似的技術(shù)方案，而達到上述技術(shù)效果的，均是落入本發(fā)明的保護范圍。