本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備大豆肽的方法。
背景技術(shù)：
：大豆多肽即“肽基大豆蛋白水解物”的簡(jiǎn)稱，是大豆蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶作用再經(jīng)特殊處理而得到的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。而我們通常所說(shuō)的大豆多肽(soybeanpeptide)是指大豆蛋白經(jīng)水解后，形成具有3-6個(gè)氨基酸殘基的多肽混合物，它的分子量低于1000u，而且主要是集中在在300u-700u之間。據(jù)研究，大豆中含有將近40％的蛋白質(zhì)，人體中所需的必需氨基酸在大豆中都可以找到，而且其比例和含量都與人體必需氨基酸相似，所以說(shuō)大豆是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來(lái)源。大豆多肽的分子結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單以及相對(duì)分子質(zhì)量比較小，大豆多肽的消化率與大豆蛋白的消化率相比顯得更高，因此大豆多肽的生物學(xué)效價(jià)更高。大豆肽中含有大量的且比例均衡的氨基酸，不僅能加快微生物的發(fā)酵速度而且還可以降低血壓及降低血脂的作用，人體內(nèi)消化吸收蛋白質(zhì)大多以多肽的形式。因此，大豆肽比大豆蛋白質(zhì)更容易在腸道中消化吸收，還減少了脫水及腹瀉等不適應(yīng)的情況，另外，大豆肽比糖類、脂肪更容易加速能量代謝更高程度的滿足人體的正常生理需求，并具有防病、治病、調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的作用，被廣大的老年人和肥胖人群所接受。而且大豆多肽沒(méi)有大豆本身的腥味以及苦澀的味道、沒(méi)有其他殘留物，大豆多肽受熱不凝結(jié)成固態(tài)和多肽液體不濃稠等特性；并且大豆肽與大豆蛋白相比較大豆肽更易溶于水而且吸水能力更強(qiáng)。因此，大豆肽不僅克服了大豆蛋白所不具備的理化功能的缺點(diǎn)，而且還具有大豆蛋白的豐富營(yíng)養(yǎng)，是一種價(jià)格實(shí)惠的大豆深加工產(chǎn)品，是極具潛力的一種功能性食品基料，已逐漸成為21世紀(jì)的健康食品。由于大豆肽的諸多優(yōu)點(diǎn)所以在食品工業(yè)中大豆肽的應(yīng)用比較廣泛。如對(duì)于一些特殊的病人由于他們的消化功能健全或衰退，例如，一些老年人、嬰幼兒以及康復(fù)期的病人，他們的消化系統(tǒng)需要的營(yíng)養(yǎng)品應(yīng)具有易消化吸收且吸收速度快的特點(diǎn)，因此大豆肽可作為特殊病人的營(yíng)養(yǎng)劑。大豆肽與其他材料搭配加工可以制成加工還可以與其他的輔料相互結(jié)合制成各種食品，如高蛋白、高果糖、低動(dòng)物性脂肪、易消化的速溶性老年奶粉。在發(fā)酵工業(yè)中大豆肽還可以作為催化劑，大豆肽可以加速微生物生長(zhǎng)發(fā)育促進(jìn)微生物的代謝。在酸奶的加工、醬油的生產(chǎn)和火腿的發(fā)酵中等，大豆肽都發(fā)揮著功不可沒(méi)的功能。伴隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們已越來(lái)越重視自身的健康問(wèn)題，對(duì)大豆肽的營(yíng)養(yǎng)功了解已普遍加深，在最近的幾年里市場(chǎng)的需求對(duì)大豆肽不斷的增加，并亟需開(kāi)發(fā)出更適合、更有營(yíng)養(yǎng)、有利人們健康的大豆肽產(chǎn)品。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備大豆肽的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所述的利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備大豆肽的方法，包括如下步驟：(1)取豆粕粉加水溶解得豆粕粉溶液，并將所述豆粕粉進(jìn)行滅菌處理；(2)取滅菌后的豆粕粉溶液接種入枯草芽孢桿菌，并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(3)取發(fā)酵液濾除殘?jiān)?，取濾液并調(diào)節(jié)濾液pH值至4-4.2，離心并收集上清液；(4)將所述上清液蒸發(fā)濃縮至黏稠狀少許液體，隨后冷凍至凝固態(tài)，并冷凍干燥至粉狀，即得大豆肽粉。所述步驟(1)中，所述豆粕粉和水的料液比為1：10-30。所述步驟(2)中，所述枯草芽孢桿菌的接種量為1wt％-5wt％。所述步驟(2)中，所述發(fā)酵溫度為25-45℃。所述步驟(2)中，所述發(fā)酵時(shí)間為16-48h。所述步驟(2)中，還包括在接種步驟前將所述豆粕粉溶液的pH值調(diào)節(jié)至6.0-8.0的步驟。所述步驟(3)中，所述離心步驟為3000-4000rpm低速離心。所述步驟(2)中，所述發(fā)酵步驟具體為：在發(fā)酵過(guò)程的后1/2發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，其發(fā)酵溫度相比于前1/2發(fā)酵時(shí)間內(nèi)提升5℃。本發(fā)明還公開(kāi)了由所述方法制備得到的大豆肽。本發(fā)明還公開(kāi)了所述大豆肽用于制備抗氧化制劑的用途。本發(fā)明所述利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備大豆肽的方法，以發(fā)酵豆粕為發(fā)酵原料，并優(yōu)選各項(xiàng)工藝參數(shù)，所得大豆肽產(chǎn)品的水解度高達(dá)24.51％，更有效提高了大豆肽的得率。并且所得大豆肽產(chǎn)品的DPPH自由基清除率的IC50高達(dá)13.29mg/mL，超氧陰離子自由基清除率IC50高達(dá)3.99mg/mL。同時(shí)對(duì)發(fā)酵所得大豆肽粉的理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明所得的大豆肽粉中粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)80.14％，比未發(fā)酵豆粕中的蛋白質(zhì)含量高出一倍多，大豆肽粉中多肽含量更高達(dá)73.61％。通過(guò)枯草芽孢桿菌對(duì)豆粕進(jìn)行發(fā)酵，提高了大豆多肽的提取率，增強(qiáng)大豆肽的抗氧化能力，為大豆粕的綜合利用提供理論技術(shù)依據(jù)。本發(fā)明優(yōu)選在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，采用分段控溫的方式，更進(jìn)一步的提高了大豆肽的提取率。附圖說(shuō)明為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中，圖1為繪制的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為繪制的大豆肽標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3-A為樣品的超氧陰離子自由基清除率測(cè)定結(jié)果；圖3-B為谷胱甘肽對(duì)超氧陰離子的清除能力測(cè)定結(jié)果；圖4-A為樣品的DPPH自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果；圖4-B為谷胱甘肽對(duì)DPPH自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1取清洗干凈的三角瓶，稱取10g豆粕粉(取豆粕放入粉碎機(jī)中多次粉碎，并置于40目的篩子過(guò)濾3-4遍制得，下同)放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入200mL的去離子水，將裝有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高溫高壓滅菌鍋中，于120℃殺菌20min，取出溫度降到常溫，并將溶液pH值調(diào)為7.0。向三角瓶中按照接種量為2％的計(jì)量接入直投式枯草芽孢桿菌，將雙顯恒溫振蕩器調(diào)為30℃、180r/min，培養(yǎng)發(fā)酵24h。發(fā)酵結(jié)束后，將三角瓶從搖床取出，用4層紗布過(guò)濾掉發(fā)酵液中的殘?jiān)?，用去離子水清洗濾渣，再次過(guò)濾，如此重復(fù)兩遍，用鹽酸將濾液的pH值調(diào)至4.2，將調(diào)節(jié)好的濾液放入低速大容量離心機(jī)中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為4000r/min離心20min，取上清液測(cè)量其肽得率。同時(shí)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液蒸發(fā)至黏稠狀少許液體，取出蒸發(fā)后的液體倒入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的液體不宜過(guò)厚以免干燥不完全，將裝有液體的培養(yǎng)基放入冰箱中直到液體被凍住，取出放入冷凍干燥機(jī)中干燥，得大豆肽粉。實(shí)施例2取清洗干凈的三角瓶，稱取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入100mL的去離子水，將裝有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高溫高壓滅菌鍋中，于120℃殺菌20min，取出溫度降到常溫，并將溶液pH值調(diào)為6.5。向三角瓶中按照接種量為1％的計(jì)量接入直投式枯草芽孢桿菌，將雙顯恒溫振蕩器調(diào)為25℃、180r/min，培養(yǎng)發(fā)酵16h。發(fā)酵結(jié)束后，將三角瓶從搖床取出，用4層紗布過(guò)濾掉發(fā)酵液中的殘?jiān)?，用去離子水清洗濾渣，再次過(guò)濾，如此重復(fù)兩遍，用鹽酸將濾液的pH值調(diào)至4.2，將調(diào)節(jié)好的濾液放入低速大容量離心機(jī)中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為4000r/min離心20min，取上清液測(cè)量其肽得率。同時(shí)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液蒸發(fā)至黏稠狀少許液體，取出蒸發(fā)后的液體倒入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的液體不宜過(guò)厚以免干燥不完全，將裝有液體的培養(yǎng)基放入冰箱中直到液體被凍住，取出放入冷凍干燥機(jī)中干燥，得大豆肽粉。實(shí)施例3取清洗干凈的三角瓶，稱取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入300mL的去離子水，將裝有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高溫高壓滅菌鍋中，于120℃殺菌20min，取出溫度降到常溫，并將溶液pH值調(diào)為8.0。向三角瓶中按照接種量為5％的計(jì)量接入直投式枯草芽孢桿菌，將雙顯恒溫振蕩器調(diào)為35℃、180r/min，培養(yǎng)發(fā)酵40h。發(fā)酵結(jié)束后，將三角瓶從搖床取出，用4層紗布過(guò)濾掉發(fā)酵液中的殘?jiān)?，用去離子水清洗濾渣，再次過(guò)濾，如此重復(fù)兩遍，用鹽酸將濾液的pH值調(diào)至4.2，將調(diào)節(jié)好的濾液放入低速大容量離心機(jī)中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為4000r/min離心20min，取上清液測(cè)量其肽得率。同時(shí)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液蒸發(fā)至黏稠狀少許液體，取出蒸發(fā)后的液體倒入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的液體不宜過(guò)厚以免干燥不完全，將裝有液體的培養(yǎng)基放入冰箱中直到液體被凍住，取出放入冷凍干燥機(jī)中干燥，得大豆肽粉。實(shí)施例4取清洗干凈的三角瓶，稱取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入150mL的去離子水，將裝有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高溫高壓滅菌鍋中，于120℃殺菌20min，取出溫度降到常溫，并將溶液pH值調(diào)為7.5。向三角瓶中按照接種量為3％的計(jì)量接入直投式枯草芽孢桿菌，將雙顯恒溫振蕩器調(diào)為40℃、180r/min，培養(yǎng)發(fā)酵32h。發(fā)酵結(jié)束后，將三角瓶從搖床取出，用4層紗布過(guò)濾掉發(fā)酵液中的殘?jiān)?，用去離子水清洗濾渣，再次過(guò)濾，如此重復(fù)兩遍，用鹽酸將濾液的pH值調(diào)至4.2，將調(diào)節(jié)好的濾液放入低速大容量離心機(jī)中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為4000r/min離心20min，取上清液測(cè)量其肽得率。同時(shí)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液蒸發(fā)至黏稠狀少許液體，取出蒸發(fā)后的液體倒入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的液體不宜過(guò)厚以免干燥不完全，將裝有液體的培養(yǎng)基放入冰箱中直到液體被凍住，取出放入冷凍干燥機(jī)中干燥，得大豆肽粉。實(shí)施例5取清洗干凈的三角瓶，稱取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入250mL的去離子水，將裝有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高溫高壓滅菌鍋中，于120℃殺菌20min，取出溫度降到常溫，并將溶液pH值調(diào)為6.0。向三角瓶中按照接種量為4％的計(jì)量接入直投式枯草芽孢桿菌，將雙顯恒溫振蕩器調(diào)為45℃、180r/min，培養(yǎng)發(fā)酵48h。發(fā)酵結(jié)束后，將三角瓶從搖床取出，用4層紗布過(guò)濾掉發(fā)酵液中的殘?jiān)萌ルx子水清洗濾渣，再次過(guò)濾，如此重復(fù)兩遍，用鹽酸將濾液的pH值調(diào)至4.2，將調(diào)節(jié)好的濾液放入低速大容量離心機(jī)中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為4000r/min離心20min，取上清液測(cè)量其肽得率。同時(shí)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液蒸發(fā)至黏稠狀少許液體，取出蒸發(fā)后的液體倒入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的液體不宜過(guò)厚以免干燥不完全，將裝有液體的培養(yǎng)基放入冰箱中直到液體被凍住，取出放入冷凍干燥機(jī)中干燥，得大豆肽粉。實(shí)施例6取清洗干凈的三角瓶，稱取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入250mL的去離子水，將裝有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高溫高壓滅菌鍋中，于120℃殺菌20min，取出溫度降到常溫，并將溶液pH值調(diào)為7.5。向三角瓶中按照接種量為2％的計(jì)量接入直投式枯草芽孢桿菌，將雙顯恒溫振蕩器調(diào)為35℃、180r/min，培養(yǎng)發(fā)酵48h。發(fā)酵結(jié)束后，將三角瓶從搖床取出，用4層紗布過(guò)濾掉發(fā)酵液中的殘?jiān)?，用去離子水清洗濾渣，再次過(guò)濾，如此重復(fù)兩遍，用鹽酸將濾液的pH值調(diào)至4.2，將調(diào)節(jié)好的濾液放入低速大容量離心機(jī)中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為4000r/min離心20min，取上清液測(cè)量其肽得率。同時(shí)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液蒸發(fā)至黏稠狀少許液體，取出蒸發(fā)后的液體倒入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的液體不宜過(guò)厚以免干燥不完全，將裝有液體的培養(yǎng)基放入冰箱中直到液體被凍住，取出放入冷凍干燥機(jī)中干燥，得大豆肽粉。實(shí)施例7取清洗干凈的三角瓶，稱取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入300mL的去離子水，將裝有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高溫高壓滅菌鍋中，于120℃殺菌20min，取出溫度降到常溫，并將溶液pH值調(diào)為7.0。向三角瓶中按照接種量為2％的計(jì)量接入直投式枯草芽孢桿菌，將雙顯恒溫振蕩器調(diào)為35℃、180r/min，培養(yǎng)發(fā)酵48h。發(fā)酵結(jié)束后，將三角瓶從搖床取出，用4層紗布過(guò)濾掉發(fā)酵液中的殘?jiān)?，用去離子水清洗濾渣，再次過(guò)濾，如此重復(fù)兩遍，用鹽酸將濾液的pH值調(diào)至4.2，將調(diào)節(jié)好的濾液放入低速大容量離心機(jī)中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為4000r/min離心20min，取上清液測(cè)量其肽得率。同時(shí)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液蒸發(fā)至黏稠狀少許液體，取出蒸發(fā)后的液體倒入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的液體不宜過(guò)厚以免干燥不完全，將裝有液體的培養(yǎng)基放入冰箱中直到液體被凍住，取出放入冷凍干燥機(jī)中干燥，得大豆肽粉。實(shí)施例8取清洗干凈的三角瓶，稱取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入250mL的去離子水，將裝有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高溫高壓滅菌鍋中，于120℃殺菌20min，取出溫度降到常溫，并將溶液pH值調(diào)為8.0。向三角瓶中按照接種量為2％的計(jì)量接入直投式枯草芽孢桿菌，將雙顯恒溫振蕩器調(diào)為35℃、180r/min，培養(yǎng)發(fā)酵24h。發(fā)酵結(jié)束后，將三角瓶從搖床取出，用4層紗布過(guò)濾掉發(fā)酵液中的殘?jiān)?，用去離子水清洗濾渣，再次過(guò)濾，如此重復(fù)兩遍，用鹽酸將濾液的pH值調(diào)至4.2，將調(diào)節(jié)好的濾液放入低速大容量離心機(jī)中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為4000r/min離心20min，取上清液測(cè)量其肽得率。同時(shí)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液蒸發(fā)至黏稠狀少許液體，取出蒸發(fā)后的液體倒入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的液體不宜過(guò)厚以免干燥不完全，將裝有液體的培養(yǎng)基放入冰箱中直到液體被凍住，取出放入冷凍干燥機(jī)中干燥，得大豆肽粉。實(shí)施例9取清洗干凈的三角瓶，稱取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入300mL的去離子水，將裝有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高溫高壓滅菌鍋中，于120℃殺菌20min，取出溫度降到常溫，并將溶液pH值調(diào)為7.0。向三角瓶中按照接種量為2％的計(jì)量接入直投式枯草芽孢桿菌，將雙顯恒溫振蕩器調(diào)為35℃、180r/min，培養(yǎng)發(fā)酵24h，隨后將雙顯恒溫振蕩器調(diào)為40℃、180r/min，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵24h。發(fā)酵結(jié)束后，將三角瓶從搖床取出，用4層紗布過(guò)濾掉發(fā)酵液中的殘?jiān)萌ルx子水清洗濾渣，再次過(guò)濾，如此重復(fù)兩遍，用鹽酸將濾液的pH值調(diào)至4.2，將調(diào)節(jié)好的濾液放入低速大容量離心機(jī)中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為4000r/min離心20min，取上清液測(cè)量其肽得率。同時(shí)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液蒸發(fā)至黏稠狀少許液體，取出蒸發(fā)后的液體倒入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的液體不宜過(guò)厚以免干燥不完全，將裝有液體的培養(yǎng)基放入冰箱中直到液體被凍住，取出放入冷凍干燥機(jī)中干燥，得大豆肽粉。實(shí)施例10取清洗干凈的三角瓶，稱取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入250mL的去離子水，將裝有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高溫高壓滅菌鍋中，于120℃殺菌20min，取出溫度降到常溫，并將溶液pH值調(diào)為8.0。向三角瓶中按照接種量為2％的計(jì)量接入直投式枯草芽孢桿菌，將雙顯恒溫振蕩器調(diào)為35℃、180r/min，培養(yǎng)發(fā)酵24h，隨后將雙顯恒溫振蕩器調(diào)為40℃、180r/min，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵24h。發(fā)酵結(jié)束后，將三角瓶從搖床取出，用4層紗布過(guò)濾掉發(fā)酵液中的殘?jiān)萌ルx子水清洗濾渣，再次過(guò)濾，如此重復(fù)兩遍，用鹽酸將濾液的pH值調(diào)至4.2，將調(diào)節(jié)好的濾液放入低速大容量離心機(jī)中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為4000r/min離心20min，取上清液測(cè)量其肽得率。同時(shí)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上清液蒸發(fā)至黏稠狀少許液體，取出蒸發(fā)后的液體倒入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的液體不宜過(guò)厚以免干燥不完全，將裝有液體的培養(yǎng)基放入冰箱中直到液體被凍住，取出放入冷凍干燥機(jī)中干燥，得大豆肽粉。實(shí)驗(yàn)例實(shí)驗(yàn)例1、大豆肽得率測(cè)定1.1測(cè)定方法(1)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制蛋白質(zhì)在范德華作用下能與考馬斯亮藍(lán)G250成一種藍(lán)色染料，反應(yīng)后的溶液在波長(zhǎng)為595nm處有最大吸收值，吸光值的與蛋白質(zhì)含量成正比。因此可通過(guò)對(duì)溶液顏色變化進(jìn)行比色分析，來(lái)測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)含量?？捡R斯亮藍(lán)使用前需進(jìn)行過(guò)濾處理以防有沉淀，對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生較大影響。準(zhǔn)確配好100μg/mL的牛血清蛋白溶液。取6支試管，分別從0到5標(biāo)上序號(hào)，按下表1中計(jì)量加入不同的試劑。繪制蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，豆粕及大豆肽粉中的蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。表1蛋白質(zhì)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試劑012345去離子水/mL1.00.80.60.40.20牛血清蛋白溶液/(100μg/mL)00.20.40.60.81.0考馬斯亮藍(lán)G-250染液/mL5.05.05.05.05.05.0以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝0.0058x+0.0499，R2＝0.9977。(2)大豆肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支試管按下表2的添加量分別加入牛血清蛋白、水和雙縮脲試劑，在540nm處測(cè)量各試管吸光度，繪制大豆肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)酵液及大豆肽粉中的多肽含量用雙縮脲法測(cè)定。表2大豆肽含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試劑012345去離子水/mL5.04.03.02.01.00牛血清蛋白溶液/(5mg/mL)01.02.03.04.05.0雙縮脲試劑/mL2.02.02.02.02.02.0以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝0.0987x+0.0123，R2＝0.9971。(3)大豆肽得率的測(cè)定稱取一定量的發(fā)酵液，加入2毫升雙縮脲試劑，然后在540nm處測(cè)量吸光度，重復(fù)3次，把結(jié)果代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到大豆肽含量。按照公式如下計(jì)算大豆肽得率：T＝X/X1×100％式中：T――大豆肽提取率，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)％；X1――豆粕中蛋白質(zhì)含量，單位為克每毫升(mg/mL)；X――發(fā)酵液中大豆肽含量，單位為克每毫升(mg/mL)。1.2測(cè)定結(jié)果按照上述1.1中方法測(cè)定上述實(shí)施例1-10中所述方法制得發(fā)酵液中大豆肽的得率，記錄于下表3中。表3各實(shí)施例中大豆肽含量測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)，本發(fā)明所述利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備大豆肽的方法，可有效利用豆粕為原料提取大豆肽，且大豆肽的提取效率較高。實(shí)驗(yàn)例2抗氧化性能測(cè)定2.1水解度的測(cè)定--甲醛滴定法氨基酸為兩性電解質(zhì)，氨基酸的羧基不能直接用堿來(lái)滴定。常溫狀態(tài)下甲醛可以與氨基快速結(jié)合，形成羥甲基化合物，促使-NH3釋放出H+，當(dāng)H+釋放之后就可用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液去滴定H+，我們可以根據(jù)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積計(jì)算出氨基酸的含量。蛋白質(zhì)在酶的作用下，其水解包括下面三個(gè)過(guò)程①肽鍵斷裂：②質(zhì)子交換過(guò)程：-CHR'-COOH-NH2-CHR"→-CHR'-COO-+NH3+-CHR"；③氨基滴定階段：將3mL的水解液(100℃的滅菌鍋中滅菌10min)放入100mL燒杯中，加入60mL去離子水，用0.05mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH為8.2，加入10mL中性甲醛溶液，繼續(xù)滴定至pH為9.2，記下加入甲醛后消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積V1?？瞻捉M以相同體積未經(jīng)水解的豆粕溶液做實(shí)驗(yàn)，V0為加入中性甲醛后所耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。以上的滴定需在磁力攪拌器上進(jìn)行保證溶液的充分混勻。水解度的計(jì)算見(jiàn)下式：式中，C--樣品蛋白濃度(mg/mL)；V--用于甲醛滴定的水解液的體積數(shù)(mL)；0.05--氫氧化鈉摩爾濃度(mol/L)；htot--每克黑豆蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)(7.8mmol/g)。按照上述方法對(duì)實(shí)施例7和8中所得大豆肽產(chǎn)物的水解度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)下表4。表4大豆肽水解度測(cè)定結(jié)果編號(hào)大豆肽得率/％實(shí)施例724.51實(shí)施例819.472.2超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定當(dāng)鄰苯三酚處在弱堿性的環(huán)境中時(shí)(pH為8.2的Tris-HCL緩沖液)它自身能夠迅速氧化分解，產(chǎn)生超氧陰離子自由基和黃棕色的中間產(chǎn)物，黃棕色的中間產(chǎn)物在325nm處有最大吸收波長(zhǎng)，可根據(jù)黃棕色中間產(chǎn)物生成量來(lái)判斷Pyrogallol自氧化程度。反應(yīng)體系有抗氧化劑的存在時(shí)，超氧陰離子被清除，黃棕色中間產(chǎn)物的生成減少，吸光度降低。在325nm最大吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光度測(cè)定，可以檢測(cè)抗氧化劑清除超氧陰離子自由基的能力。取質(zhì)量濃度2％的大豆肽溶液0.1mL，然后加入0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液和0.45mol/L焦性沒(méi)食子酸溶液0.1mL，空白組以相同體積的去離子水代替樣品溶液。放于漩渦混勻器混勻，待反應(yīng)至4分鐘后時(shí)立即加入2％的鹽酸溶液0.1mL，依舊放于漩渦混勻器混勻，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A。鹽酸溶液可以改變Pyrogallol的堿性環(huán)境，為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，在本實(shí)驗(yàn)中鹽酸作為Pyrogallol氧化分解的促停劑來(lái)使用。以空白的吸光度為A0，加大豆肽樣品時(shí)吸光度為AS，按照如下公式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。取上述實(shí)施例7和實(shí)施例8中發(fā)酵所得的大豆肽，分別配置成濃度為1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL和1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL溶液，按照上述方法測(cè)其超氧陰離子清除率，結(jié)果見(jiàn)圖3-A、3-B所示。實(shí)施例7中大豆肽對(duì)自由基清除能力IC50為3.99mg/mL，實(shí)施例8中大豆肽對(duì)自由基清除能力IC50為5.25mg/mL。2.3DPPH·清除率的測(cè)定DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，在有機(jī)溶劑乙醇中呈現(xiàn)紫紅色，在波長(zhǎng)為517nm處有最大吸收值。當(dāng)反應(yīng)體系中有自由基清除劑的存在時(shí)存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其紫紅色逐漸消失吸光度減小，其減小的程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系。DPPH法是一種測(cè)定大豆肽抗氧化能力的簡(jiǎn)單有效的方法，在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用。試劑配制：準(zhǔn)確稱取4mgDPPH置于100mL的棕色容量瓶中，加入95％的乙醇定容至刻度線，將配好后的0.1mmol/LDPPH乙醇溶液，放入冰箱中避光保存?zhèn)溆?。取相同質(zhì)量濃度的大豆肽溶液0.5mL，在100℃的滅菌鍋中滅菌10min，加入3.5mL0.1mmol/LDPPH乙醇溶液混合均勻后，在室溫反應(yīng)20min后，以4000r/min離心10min，于517nm處測(cè)量其吸光值A(chǔ)i。空白組不加入DPPH·溶液而加入3.5mL95％的乙醇溶液，在相同的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值A(chǔ)j。將樣品溶液換為相同體積的去離子水是對(duì)照組，并在相同波長(zhǎng)處測(cè)量的吸光值A(chǔ)0，空白管是加入0.5mL去離子水和3.5mL95％的乙醇溶液，按如下公式計(jì)算DPPH·清除率。重復(fù)測(cè)量三次，取平均值。DPPH·清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％。分別取實(shí)施例7和8中所制得的含大豆肽，都配置成濃度為5mg/mL，10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL溶液，按照上述方法測(cè)其DPPH·清除率，結(jié)果見(jiàn)圖4-A、4-B所示。實(shí)施例7中大豆肽對(duì)DPPH自由基清除能力IC50為13.29mg/mL，實(shí)施例8中大豆肽對(duì)自由基清除能力IC50為15.52mg/mL。可見(jiàn)，本發(fā)明所述制備大豆肽的方法所得大豆肽產(chǎn)品的抗氧化性能較好。實(shí)施例3大豆肽粉感官評(píng)定3.1大豆肽粉的理化指標(biāo)以GB/T22492-2008大豆肽粉的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)冷凍干燥后的大豆肽粉進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定，其檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。表5大豆肽粉的理化指標(biāo)項(xiàng)目含量/％GB/T22492—2008標(biāo)準(zhǔn)大豆肽粉中粗蛋白含量/％80.14≥80.0大豆肽粉中多肽含量/％73.61≥55.03.2大豆肽粉的感官評(píng)定對(duì)冷凍干燥后的大豆肽粉進(jìn)行感官評(píng)定，以GB/T22492-2008大豆肽粉中的感官要求為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將實(shí)施例7和8中經(jīng)冷凍干燥后得到的大豆肽粉進(jìn)行各項(xiàng)感官指標(biāo)測(cè)定，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)及測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表6。表6大豆肽粉的感官指標(biāo)及結(jié)果由表6數(shù)據(jù)可知本發(fā)明所述方法發(fā)酵制備出的大豆肽粉達(dá)到GB/T22492--2008大豆肽粉要求的三級(jí)指標(biāo)，感官指標(biāo)亦達(dá)到其要求。顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3