本發(fā)明涉及一種預(yù)處理細(xì)胞，特別涉及一種Adjudin預(yù)處理干細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

包括神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)在內(nèi)的干細(xì)胞對(duì)于腦損傷，脊髓損傷等各種疾病中具有較好的應(yīng)用前景。盡管如此，仍有許多問(wèn)題尚未解決，如干細(xì)胞存活率低，從而導(dǎo)致干細(xì)胞移植治療效果差，以及長(zhǎng)期來(lái)看，干細(xì)胞移植安全性等問(wèn)題。

Adjudin，又名AF-2364，現(xiàn)有技術(shù)中，Adjudin是作為男性避孕藥被發(fā)現(xiàn)，是化療藥氯尼達(dá)明(lonidamine)的衍生物，是一類(lèi)具有吲哚酸結(jié)構(gòu)的小分子藥物。Adjudin的化學(xué)機(jī)構(gòu)式是：

現(xiàn)有技術(shù)中，未有研究證實(shí)，Adjudin可應(yīng)用于提高干細(xì)胞存活率中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種Adjudin預(yù)處理干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)Adjudin預(yù)處理后，能提高干細(xì)胞在損傷部位的存活率進(jìn)而通過(guò)干細(xì)胞分化進(jìn)行治療，有效提高了干細(xì)胞移植治療效果。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種Adjudin預(yù)處理干細(xì)胞的制備方法。

本發(fā)明的目的，通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種Adjudin預(yù)處理干細(xì)胞的制備方法，其步驟包括，5-30μmol/L的Adjudin溶液預(yù)處理干細(xì)胞，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，35-39℃孵育20-30小時(shí)即可。

優(yōu)選的，10-20μmol/L的Adjudin溶液預(yù)處理干細(xì)胞，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃孵育24小時(shí)。進(jìn)一步優(yōu)選的，Adjudin溶液的濃度為10μmol/L。

所述干細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞。

通過(guò)上述制備方法可獲得Adjudin預(yù)處理干細(xì)胞。

上述Adjudin預(yù)處理干細(xì)胞在干細(xì)胞移植治療中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供了Adjudin預(yù)處理干細(xì)胞，通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明Adjudin預(yù)處理后，神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在損傷部位的存活率顯著提高，死亡率下降，從而提高了干細(xì)胞移植的治療效果。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中，Adjudin預(yù)處理神經(jīng)干細(xì)胞的存活率對(duì)比圖。

圖2是實(shí)施例2中，Adjudin預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率對(duì)比圖。

圖3是實(shí)施例3中，Adjudin預(yù)處理神經(jīng)干細(xì)胞移植治療效果對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：

Adjudin溶液的配制方法為：Adjudin為粉末狀制劑，將Adjudin溶解在DMSO中(或乙醇等溶劑)，配成30mmol/L的stock溶液(儲(chǔ)存濃度)保存，使用時(shí)按照需要的濃度用培養(yǎng)液稀釋到終濃度。

實(shí)施例1

小鼠神經(jīng)干細(xì)胞：取孕14.5天的孕鼠中的胎鼠，取腦，分離皮層之后消化成單細(xì)胞懸液，用NSC完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。

將小鼠神經(jīng)干細(xì)胞分別放入濃度為10及30μmol/L的Adjudin溶液中，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃孵育24小時(shí)，然后將神經(jīng)干細(xì)胞在0.1mmol/L的雙氧水刺激1小時(shí)，之后再換成正常培液培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。將CCK-8試劑以每孔10微升的量加入待測(cè)的96孔板細(xì)胞培養(yǎng)液中；37℃孵育1.5小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450納米波長(zhǎng)處的吸光光度值。

小鼠神經(jīng)干細(xì)胞在雙氧水刺激后存活率顯著下降，而這一現(xiàn)象可以由10μmol/L和30μmol/L的Adjudin預(yù)處理后得到明顯緩解，說(shuō)明Adjudin預(yù)處理后，提升了神經(jīng)干細(xì)胞的存活率，優(yōu)選的是濃度為10μmol/L的Adjudin溶液預(yù)處理，在合理的用量濃度內(nèi)，效果顯著。結(jié)果見(jiàn)圖1所示。

實(shí)施例2

人源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：取人骨髓，PBS沖洗，離心，得到細(xì)胞沉淀，再用PBS重懸離心，反復(fù)兩次后，用含有10％血清的DMEM培養(yǎng)。

將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別放入濃度為5、10及20μmol/L的Adjudin溶液中，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃孵育24小時(shí)，然后在將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在0.05mmol/L的雙氧水刺激后存活率顯著下降，而這一現(xiàn)象可以由10μmol/L的Adjudin溶液預(yù)處理后得到明顯緩解，說(shuō)明Adjudin預(yù)處理后，提升了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率，結(jié)果見(jiàn)圖2所示。

實(shí)施例3

1、動(dòng)物操作

本實(shí)施例中研究所使用的小鼠為雄性ICR小鼠。所有的給藥方式均為Adjudin預(yù)處理神經(jīng)干細(xì)胞，再將其定位注射打入小鼠紋狀體。3d后犧牲小鼠，取腦。

2、腦組織冰凍切片

小鼠麻醉后，進(jìn)行生理鹽水心臟灌注，然后取腦，取出的腦組織置于-80℃預(yù)冷的異戊烷中冷凍，然后用鋁箔紙包裹，凍存于-80℃冰箱。

3、焦油紫染色

在室溫風(fēng)干腦片后，用焦油紫染色，當(dāng)梗死側(cè)與周?chē)M織顏色對(duì)比較大時(shí)停止染色，沖去片子上多余的染料。晾干后掃描。

小鼠造模后在紋狀體定位注射Adjudin預(yù)處理的神經(jīng)干細(xì)胞，造模后，小鼠腦梗死明顯，移植干細(xì)胞后梗死面積減少，經(jīng)過(guò)Adjudin預(yù)處理的神經(jīng)干細(xì)胞相比未處理的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)于腦梗死面積的減少效果更為明顯。結(jié)果見(jiàn)圖3，其中,圖A為造模后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腦梗死體積示意圖,圖B為腦梗死體積示意圖。

所有數(shù)據(jù)按照平均值+標(biāo)準(zhǔn)差的方式給出。數(shù)據(jù)使用單因素方差分析進(jìn)行評(píng)估，然后使用Student-Newman-Keuls post hoc test。P值小于0.05認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。

綜上所述，Adjudin(AF-2364)預(yù)處理干細(xì)胞的存活率明顯上升，從而顯著加強(qiáng)在損傷后干細(xì)胞移植的治療效果。

以上所述為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于該實(shí)施例所公開(kāi)的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開(kāi)的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。