本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術領域，特別涉及一種循環(huán)利用米曲霉菌體生產(chǎn)低聚果糖的方法。

背景技術：

低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)是指果糖基經(jīng)β-2,1糖苷鍵連接而成的聚合度為2～9的功能性低聚糖，屬于食品配料。按結(jié)構(gòu)，低聚果糖可分為蔗-果型和果-果型兩種。工業(yè)上生產(chǎn)低聚果糖主要有兩種方法：以菊粉為原料的酶水解法和以蔗糖為原料的酶轉(zhuǎn)化法。前者所得低聚果糖聚合度范圍較大(DP₂-DP₉)，屬果-果型；后者所得低聚果糖聚合度范圍較小(DP₃-DP₆)，屬蔗-果型。研究顯示，動物或人體攝食低聚果糖，可改善腸道菌群、減輕便秘癥狀、改善脂質(zhì)代謝、抑制腸道腐敗、促進鈣鎂等礦質(zhì)元素的吸收、增強免疫力等。低聚果糖良好的理化特性和生理功效，使其在食品、保健品、飼料等行業(yè)中得到了廣泛應用。

工業(yè)上以蔗糖為原料生產(chǎn)低聚果糖的方法有微生物液體深層發(fā)酵法、游離酶法和固定化酶法。游離酶法雖后處理簡單，但酶只能利用一次且酶制劑成本較高；固定化酶法雖可實現(xiàn)酶的多次利用，但酶的固定化過程技術要求較高，酶經(jīng)固定化后轉(zhuǎn)化蔗糖所得低聚果糖的含量往往低于游離酶；微生物液體深層發(fā)酵法雖是一種傳統(tǒng)的方法，但因其生產(chǎn)工藝成熟且生產(chǎn)量大，仍然在低聚果糖生產(chǎn)上得到廣泛使用。

專利CN 103045489 B公布了一種黑曲霉及其全細胞催化生產(chǎn)低聚果糖的方法。該法是在傳統(tǒng)的微生物液體深層發(fā)酵法基礎上進行改進而來。全細胞加入到蔗糖溶液中催化合成低聚果糖，不需脫色離交只需簡單的過濾即可濃縮成終產(chǎn)品糖漿，這是該法的優(yōu)勢所在。該優(yōu)勢的獲得得益于前期對轉(zhuǎn)化用黑曲霉菌體的處理：發(fā)酵所得黑曲霉全細胞溶液，用無菌的濾布過濾、洗滌、再過濾、干燥，才得到具轉(zhuǎn)化活性的黑曲霉全細胞懸液。該過程操作繁雜、需專用的干燥設備，且該法所得糖漿中FOS含量不高。

專利CN 105524847 A公開了一種出芽短梗霉AP172-1B及利用其生產(chǎn)低聚果糖的方法，該法也屬于微生物發(fā)酵法。該法最終所得低聚果糖的純度不低于93％，這是本方法的優(yōu)勢所在。但該法生產(chǎn)低聚果糖的周期太長：出芽短梗霉接入到發(fā)酵罐中需60-72h才能獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液加熱到80℃，冷卻后要放置48-60h，脫色后酶反應還需10-15h，再加上菌種培養(yǎng)的24-36h，總用時達142-183h。另外，發(fā)酵液加熱到80℃，冷卻后在4℃放置，使用離心機收集上清，這些步驟能耗較大；后期還要加入果糖基轉(zhuǎn)移酶進行反應，酶的成本也較高。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明對傳統(tǒng)的微生物液體深層發(fā)酵法進行改進，提供了一種循環(huán)利用米曲霉菌體生產(chǎn)低聚果糖的方法。本專利所述方法是在傳統(tǒng)的微生物液體深層發(fā)酵法基礎上進行改進，在糖化結(jié)束后引入微濾設備，以實現(xiàn)微生物菌體的重復利用；微濾結(jié)束后引入超濾設備，對料液進一步精制并回收具有高附加值的蛋白(來源于培養(yǎng)基)等大分子物質(zhì)。傳統(tǒng)工藝過濾環(huán)節(jié)多采用板框過濾，該工序勞動強度大、操作體系開放(料液易受到污染)、工時較長；采用微濾設備后，可實現(xiàn)自動化操作，降低勞動強度，節(jié)約人工成本，因操作體系密閉，故可避免料液受到污染。

一種循化利用米曲霉菌體生產(chǎn)低聚果糖的方法，包括以下步驟：

(1)將培養(yǎng)好的米曲霉菌懸液與蔗糖溶液混合進行糖化，得到含低聚果糖的發(fā)酵液；

(2)發(fā)酵液經(jīng)微濾膜過濾，回收米曲霉菌體，濾得低聚果糖清夜；

(3)用戊二醛對第一次回收的米曲霉菌體進行處理，然后通過微濾膜進行洗滌與再回收，用于下一批糖化；后續(xù)糖化結(jié)束后所回收的菌體不再經(jīng)戊二醛處理，回收后調(diào)節(jié)菌懸液濃度至(1)中的菌懸液濃度，即用于下一批糖化；

(4)調(diào)節(jié)步驟(3)回收到的米曲霉懸液濃度至步驟(1)中的菌懸液濃度，回流至糖化罐開展下一批糖化，低聚果糖清夜經(jīng)后處理得低聚果糖糖漿。

所述的方法，優(yōu)選步驟(2)和(3)中的微濾膜為無機陶瓷膜，截留孔徑為0.1～1μm。

所述的方法，優(yōu)選微濾溫度為30～42℃，操作壓力0.05～0.2MPa。

所述的方法，優(yōu)選步驟(3)中用戊二醛對第一次回收的米曲霉菌體進行處理時，調(diào)節(jié)菌體濃度為5～15g/L，戊二醛加入后的終濃度為5～15g/L。

所述的方法，優(yōu)選步驟(3)中用戊二醛對第一次回收的米曲霉菌體進行處理時，反應溫度10～15℃，攪拌轉(zhuǎn)速30～60rpm，反應時間6～10h。

所述的方法，優(yōu)選步驟(3)中菌體與戊二醛的質(zhì)量比為1:0.8～1:1.2，優(yōu)選的菌體與戊二醛的質(zhì)量比為1:1。

所述的方法，優(yōu)選步驟(3)中通過微濾膜進行洗滌與再回收后酶活回收率為88-92％。

所述的方法，優(yōu)選步驟(4)中的后處理步驟包括超濾、活性炭脫色、離子交換脫鹽、真空濃縮。

所述的方法，優(yōu)選步驟(3)中直至酶活回收率小于或等于60％，不再進行回收。

有益效果

1、微濾膜的使用，成功解決了傳統(tǒng)工藝低聚果糖生產(chǎn)中利用板框過濾所導致的低聚果糖液易污染、勞動強度大、限制生產(chǎn)等問題；

2、傳統(tǒng)微生物液體深層發(fā)酵法中，微生物菌體只能利用一次；而本工藝采用微濾膜回收菌體，實現(xiàn)了菌體的循環(huán)利用(至少可使用8次)，減少了菌種培養(yǎng)的次數(shù)，降低了菌種培養(yǎng)過程中的能耗和原料消耗，從而降低生產(chǎn)成本，同時也減少了廢棄菌體的排放量；

3、調(diào)節(jié)第一次回收的菌體濃度并用戊二醛進行處理，可提高胞內(nèi)果糖基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性，增加所回收菌體的使用次數(shù)；

4、使用超濾對料液進行精制，在此過程中可從料液中回收蛋白質(zhì)等大分子，這些蛋白經(jīng)進一步處理可添加到動物飼料中。這些蛋白的回收利用可提高產(chǎn)品的附加值；

5、本發(fā)明制得的低聚果糖品質(zhì)高，低聚果糖的含量(占總固形物)≥56％。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。

實施例中的酶活測定方法參照《GB/T 23528-2009低聚果糖》；當酶活回收率低于60％，因后續(xù)糖化用時過長，故停止回收菌體，菌體經(jīng)滅活后排出。

實施例1

(1)將1噸培養(yǎng)好的米曲霉菌懸液與干基為5噸糖濃50％蔗糖溶液混合開展糖化，糖化溫度40～42℃，pH控制在6.0～6.5之間，糖化30h后，得到含低聚果糖的發(fā)酵液。

(2)將上述發(fā)酵液通過陶瓷膜，濾得低聚果糖清液，并回收米曲霉菌體，陶瓷膜孔徑為0.1～0.4μm，微濾溫度為30～33℃，操作壓力0.15～0.2Mpa，微濾速度為4.4m³/h。

(3)向第一次回收的菌體中加水，調(diào)節(jié)菌體濃度為5g/L，加入戊二醛使其終濃度達5g/L，在13～15℃、30rpm條件下反應6h；通過陶瓷膜充分洗滌并回收菌體，酶活回收率達88％。

(4)將微濾后所回收的菌懸液濃度調(diào)節(jié)至(1)中米曲霉懸液的濃度，回流至糖化罐，補入蔗糖溶液后開始下一批糖化，糖化條件同(1)，該批次及后續(xù)批次的糖化時間依檢測結(jié)果而定，當糖化液中FOS含量達56％以上時，即可結(jié)束相應批次的糖化；微濾所得清液通入超濾膜，獲得超濾后的低聚果糖液，并回收蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，超濾膜截留分子量范圍27000～30000D，操作壓力0.2～0.35Mpa，超濾溫度30～33℃；超濾所得低聚果糖液再經(jīng)活性炭脫色、離交脫鹽、真空濃縮，獲得精制的低聚果糖糖漿；經(jīng)高效液相檢測，糖漿中FOS含量(占總固形物)為57.0％。

(5)本次所培養(yǎng)的菌體循環(huán)使用8次后酶活回收率為55％。

實施例2

(1)將1.5噸培養(yǎng)好的米曲霉菌懸液與干基為7.5噸糖濃51％蔗糖溶液混合開展糖化，糖化溫度40～42℃，pH控制在6.0～6.5之間，糖化32h后，得到含低聚果糖的發(fā)酵液。

(2)將上述發(fā)酵液通過陶瓷膜，濾得低聚果糖清液，并回收米曲霉菌體，陶瓷膜孔徑為0.3～0.7μm，微濾溫度為34～37℃，操作壓力0.05～0.1Mpa，微濾速度為4.1m³/h。

(3)向第一次回收的菌體中加水，調(diào)節(jié)菌體濃度為15g/L，加入戊二醛使其終濃度為15g/L，在10～12℃、60rpm條件下反應10h；通過陶瓷膜充分洗滌并回收菌體，酶活回收率達90％。

(4)將微濾后所回收的菌懸液濃度調(diào)節(jié)至(1)中米曲霉懸液的濃度，回流至糖化罐，補入蔗糖溶液后開始下一批糖化，糖化條件同(1)，該批次及后續(xù)批次的糖化時間依檢測結(jié)果而定，當糖化液中FOS含量達56％以上時，即可結(jié)束相應批次的糖化；微濾所得清液通入超濾膜，獲得超濾后的低聚果糖液，并回收蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，超濾膜截留分子量范圍24000～27000D，操作壓力為0.35～0.5Mpa，超濾溫度34～37℃；超濾所得低聚果糖液再經(jīng)活性炭脫色、離交脫鹽、真空濃縮，獲得精制的低聚果糖糖漿；經(jīng)高效液相檢測，糖漿中FOS含量(占總固形物)為57.3％。

(5)本次所培養(yǎng)的菌體循環(huán)使用8次后酶活回收率為58％。

實施例3

(1)將3噸培養(yǎng)好的米曲霉菌懸液與干基為15噸糖濃53％蔗糖溶液混合開展糖化，糖化溫度40～42℃，pH控制在6.0～6.5之間，糖化36h后，得到含低聚果糖的發(fā)酵液。

(2)將上述發(fā)酵液通過陶瓷膜，濾得低聚果糖清液，并回收米曲霉菌體，陶瓷膜孔徑為0.7～1μm，微濾溫度為38～42℃，操作壓力0.1～0.15Mpa，微濾速度為5.2m³/h。

(3)向第一次回收的菌體中加水，調(diào)節(jié)菌體濃度為7g/L，加入戊二醛使其終濃度為7g/L，在12～14℃、45rpm條件下反應8h；通過陶瓷膜充分洗滌并回收菌體，酶活回收率達91％。

(4)將微濾后所回收的菌懸液濃度調(diào)節(jié)至(1)中米曲霉懸液的濃度，回流至糖化罐，補入蔗糖溶液后開始下一批糖化，糖化條件同(1)，該批次及后續(xù)批次的糖化時間依檢測結(jié)果而定，當糖化液中FOS含量達56％以上時，即可結(jié)束相應批次的糖化；微濾所得清液通入超濾膜，獲得超濾后的低聚果糖液，并回收蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，超濾膜截留分子量范圍21000～24000D，操作壓力為0.5～0.6Mpa，超濾溫度37～40℃；超濾所得低聚果糖液再經(jīng)活性炭脫色、離交脫鹽、真空濃縮，獲得精制的低聚果糖糖漿；經(jīng)高效液相檢測，糖漿中FOS含量(占總固形物)為58.1％。

(5)本次所培養(yǎng)的菌體循環(huán)使用8次后酶活回收率為60％。

實施例4

(1)將2噸培養(yǎng)好的米曲霉菌懸液與干基為10噸糖濃54％蔗糖溶液混合開展糖化，糖化溫度40～42℃，糖化pH控制在6.0～6.5之間，糖化35h后，得到含低聚果糖的發(fā)酵液。

(2)將上述發(fā)酵液通過陶瓷膜，濾得低聚果糖清液，并回收米曲霉菌體，陶瓷膜孔徑為0.7～1μm，微濾溫度為36～40℃，操作壓力0.15～0.2Mpa，微濾速度為5.5m³/h。

(3)向第一次回收的菌體中加水，調(diào)節(jié)菌體濃度為10g/L，加入戊二醛使其終濃度為10g/L，在13～15℃、40rpm條件下反應7h；通過陶瓷膜充分洗滌并回收菌體，酶活回收率達91％。

(4)將微濾后所回收的菌懸液濃度調(diào)節(jié)至(1)中米曲霉懸液的濃度，回流至糖化罐，補入蔗糖溶液后開始下一批糖化，糖化條件同(1)，該批次及后續(xù)批次的糖化時間依檢測結(jié)果而定，當糖化液中FOS含量達56％以上時，即可結(jié)束相應批次的糖化；微濾所得清液通入超濾膜，獲得超濾后的低聚果糖液，并回收蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，超濾膜截留分子量范圍18000～21000D，操作壓力為0.6～0.7Mpa，超濾溫度34～37℃；超濾所得低聚果糖液再經(jīng)活性炭脫色、離交脫鹽、真空濃縮，獲得精制的低聚果糖糖漿；經(jīng)高效液相檢測，糖漿中FOS含量(占總固形物)為58.3％。

(5)本次所培養(yǎng)的菌體循環(huán)使用8次后酶活回收率為62％。

實施例5

(1)將2.5噸培養(yǎng)好的米曲霉菌懸液與干基為12.5噸糖濃55％蔗糖溶液混合開展糖化，糖化溫度40～42℃，pH控制在6.0～6.5之間，糖化34h后，得到含低聚果糖的發(fā)酵液。

(2)將上述發(fā)酵液通過陶瓷膜，濾得低聚果糖清液，并回收米曲霉菌體，陶瓷膜孔徑為0.5～0.8μm，微濾溫度為35～38℃，操作壓力0.15～0.2Mpa，微濾速度為5.2m³/h。

(3)向第一次回收的菌體中加水，調(diào)節(jié)菌體濃度為13g/L，加入戊二醛使其終濃度達13g/L，在10～12℃、55rpm條件下反應9h；通過陶瓷膜充分洗滌并回收菌體，酶活回收率達92％。

(4)將微濾后所回收的菌懸液濃度調(diào)節(jié)至(1)中米曲霉懸液的濃度，回流至糖化罐，補入蔗糖溶液后開始下一批糖化，糖化條件同(1)，該批次及后續(xù)批次的糖化時間依檢測結(jié)果而定，當糖化液中FOS含量達56％以上時，即可結(jié)束相應批次的糖化；微濾所得清液通入超濾膜，獲得超濾后的低聚果糖液，并回收蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，超濾膜截留分子量范圍15000～18000D，操作壓力為0.7～0.8Mpa，超濾溫度30～34℃；超濾所得低聚果糖液再經(jīng)活性炭脫色、離交脫鹽、真空濃縮，獲得精制的低聚果糖糖漿；經(jīng)高效液相檢測，糖漿中FOS含量(占總固形物)為57.9％。

(5)本次所培養(yǎng)的菌體循環(huán)使用8次后酶活回收率為61％。

對比例1

同實施例5相比，向第一次回收的菌體中加水，調(diào)節(jié)菌體濃度為13g/L，加入戊二醛使其終濃度為5g/L，其余操作與實施例5相同，酶活回收率為84％，最終所培養(yǎng)的菌體循環(huán)使用6次后酶活回收率為57％。

對比例2

同實施例5相比，向第一次回收的菌體中加水，調(diào)節(jié)菌體濃度為13g/L，加入戊二醛使其終濃度為50g/L，其余操作與實施例5相同。因戊二醛的加入量較大，導致胞內(nèi)果糖基轉(zhuǎn)移酶受到較大限制，菌體間交聯(lián)過于密集。戊二醛處理后再經(jīng)陶瓷膜洗滌并回收，酶活回收率僅為64％，故未進一步開展循環(huán)糖化。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。