本發(fā)明涉及一種花青素的提取方法，尤其涉及一種從越橘中提取純化花青素的方法。

背景技術(shù)：

越橘(Vaccinium spp.)又名溫普、紅豆、牙疙瘩、小蘋果，屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium spp.)的灌木類漿果果樹，原產(chǎn)于北美和歐洲，是地球上少有的真正藍(lán)色食物之一，有“漿果之王”、“北國(guó)紅豆”之美譽(yù)。越橘果實(shí)味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，還含有VC、VA、VB等多種維生素以及K、Mg、Ca、Fe等大量礦物元素，并且富含酚酸、黃烷醇、類黃酮等酚類化合物。我國(guó)《本草綱目》中記載越橘果實(shí)成熟后，酸甜可食，可入藥，有強(qiáng)筋益氣、益腎固精之效；《吉林中草藥》記載越橘果可以止痛，治腸炎、痢疾。

越橘果實(shí)中花青素含量很高而且種類豐富，花青素屬于類黃酮化合物，其基本結(jié)構(gòu)母核是2-苯基苯并呋喃。由于B環(huán)R1、R2、R3上的取代基不同(OH或OCH3)，形成各種各樣的花色素。據(jù)美國(guó)Tufts大學(xué)的農(nóng)業(yè)部人類營(yíng)養(yǎng)研究中心發(fā)布的研究報(bào)告，越橘是他們研究過的40多種水果和蔬菜中含抗氧化成分最豐富的一種資源，因而其抗氧化能力很強(qiáng)，并具有促進(jìn)視紅素再合成，抗炎癥，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抗心血管疾病，清除自由基、抗衰老，抑制癌癥細(xì)胞發(fā)生等藥理學(xué)功效。越橘花青素受到國(guó)內(nèi)外專家的高度關(guān)注，目前成為越橘研究熱點(diǎn)之一。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于花青素生產(chǎn)技術(shù)的研究報(bào)告很多，現(xiàn)有越橘花青素的提取方法主要是采用大孔吸附樹脂和離子交換樹脂兩種方法共同實(shí)現(xiàn)的。經(jīng)查，現(xiàn)有專利號(hào)為CN201010503367.7的中國(guó)專利《一種蔓越橘果實(shí)中花色苷和原花青素類成分的提取方法》，包括以下步驟：先將蔓越橘果實(shí)破碎處理，用生物酶酶解后，在pH值1.0～5.5條件下進(jìn)行水浸提，得水提取液和殘?jiān)?；再將殘?jiān)M(jìn)行醇提萃取，濃縮萃取液回收醇，得醇提濃縮液；將水提取液與醇提濃縮液合并，通過大孔吸附樹脂吸附，用水洗滌大孔吸附樹脂后，用含水醇溶液解析，將解析液濃縮、干燥，得含花色苷和原花青素類成分的混合物；此方法采用乙醇水提，成本較高，使用磷酸調(diào)pH，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，并且得到的產(chǎn)品是花色苷和原花青素的混合物，原花青素含量低；另外現(xiàn)在藥學(xué)工作者多運(yùn)用水提醇沉法去除中藥材煎煮液中的無效成分，近年來，大量的研究及實(shí)踐證明醇沉法易造成有效成分的損失，存在較多問題。且存在成本較高，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)工時(shí)多，勞動(dòng)強(qiáng)度高，成品穩(wěn)定性差等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從越橘中提取純化花青素的方法，具有工藝簡(jiǎn)單、收率高、環(huán)境污染少、成本低的特點(diǎn)。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種從越橘中提取純化花青素的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)原料預(yù)處理：選取新鮮的越橘果實(shí)或低溫儲(chǔ)藏并解凍的凍果，揀選除雜備用；

2)微生物降解：將步驟1)預(yù)處理的越橘果實(shí)接種微生物進(jìn)行降解，接種量為0.5～2％，溫度40～60℃，初始含水量為20～40％，PH為4～6，降解時(shí)間3～6小時(shí)。

3)水提：向微生物降解后的越橘果實(shí)中加入料液比1:10～1:14的蒸餾水，室溫條件下避光攪拌2～3次，每次1.5～2.5小時(shí)，得到提取液；

4)絮凝除雜：向上述得到的提取液中加入一定量的絮凝劑，在30～50℃下攪拌均勻后靜置，然后通過過濾和離心除去提取液中的固型雜質(zhì)；

5)樹脂純化除雜：將步驟4)得到的越橘提取液用大孔樹脂進(jìn)行吸附并用體積分?jǐn)?shù)為5～15％、60～80％乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集60～80％洗脫液；

6)濃縮：將步驟5)得到的60～80％洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，回收乙醇；

7)噴霧干燥：濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，得到目標(biāo)成分精制越橘花青素。

作為優(yōu)選，所述步驟2)中的微生物為木霉、黑曲霉、青霉菌或者固氮菌。

作為優(yōu)選，所述步驟2)中微生物降解中其降解接種量為0.5％，溫度50℃，初始含水量為30％，PH值為5.0，降解時(shí)間為5小時(shí)。

優(yōu)選，所述步驟2)中微生物降解中培養(yǎng)基的主要成分為蔗糖12～13％、磷酸二氫鉀3～4％、硫酸鎂0.02～0.03％、硝酸銨0.1～0.3％、山芋粉3～4％。

再優(yōu)選，所述步驟2)中微生物降解中培養(yǎng)基的主要成分為蔗糖12.6％、磷酸二氫鉀3.85％、硫酸鎂0.026％、硝酸銨0.2％、山芋粉3.78％。

作為優(yōu)選，所述步驟3)中按料液比1:10加入蒸餾水，攪拌為2次，每次2小時(shí)。

再優(yōu)選，所述步驟4)的絮凝劑為ZTC1+1，添加量為提取液重量的2～3％，攪拌時(shí)間為10～30min，靜置時(shí)間為1～2小時(shí)。

再優(yōu)選，所述步驟5)中所述的大孔樹脂的型號(hào)為D101、D4020、AB-8、HPD-100、DA201中的一種，大孔樹脂吸附后用3～4倍柱體積純水除糖、蛋白質(zhì)。

作為改進(jìn)，所述步驟6)的減壓濃縮的真空度為0.075-0.095Mpa，溫度為60℃以下，濃縮至體積1/5-1/20，且無醇味。

最后，所述步驟7)中噴霧干燥前需對(duì)濃縮液進(jìn)行滅菌，噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)溫度為110～130℃，出風(fēng)溫度為45～55℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1.纖維素菌代謝的的主要產(chǎn)物乙酸，可以對(duì)花青素進(jìn)行分子修飾--?；磻?yīng)，?；苡行У刈璧K花青素隨溫度及PH變化而發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，對(duì)花色苷的穩(wěn)定起到很重要的作用；

2.花青素流動(dòng)的糖鏈將折疊好的?；p繞在2-苯并吡喃骨架表面，這種堆積作用不僅保護(hù)花色素的結(jié)構(gòu)，而且能保持系統(tǒng)色澤的穩(wěn)定性；

3.降解條件溫和，提取花青素穩(wěn)定性要好于常規(guī)提取方法；

4.纖維素降解菌的胞外代謝產(chǎn)物含有大量的纖維素酶，利用酶可以溫和的作用于植物組織，破壞細(xì)胞壁，從而促進(jìn)生物活性成分的釋放，提高越橘果實(shí)中花青素的出汁率，顯著提高提取率；

5.ZTC1+1為從食品中提取出的天然澄清劑，由A和B兩種組分構(gòu)成，采用“1+1”澄清技術(shù)，一組分起主絮凝作用，另一組分通過“搭橋”起輔助絮凝作用，大大加快了澄清過程。對(duì)膠體不穩(wěn)定成分的一步清除率在70％左右，二步清除率在90％以上；它可代替中藥水提醇沉工藝，提高有效成分的含量，保證中藥成品質(zhì)量的穩(wěn)定性。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

選取經(jīng)過揀選除雜后新鮮的越橘果實(shí)或低溫儲(chǔ)藏并解凍的凍果50g，裝入250mL三角瓶中，加入培養(yǎng)基，滅菌，培養(yǎng)基的主要成分為蔗糖12.6％、磷酸二氫鉀3.85％、硫酸鎂0.026％、硝酸銨0.2％、山芋粉3.78％。然后在無菌操作臺(tái)上按接種量0.5％將單一青霉菌接入瓶中，加入蒸餾水，使原料的含水量達(dá)到30％，PH值達(dá)到5.0，在智能培養(yǎng)箱中50℃條件下培養(yǎng)降解5小時(shí)；按料液比1:10(g/ML)加入蒸餾水，避光攪拌2次，每次2小時(shí)得到提取液；提取液中加入2％的ZTC1+1絮凝劑，在溫度40℃的條件下攪拌10min,后靜置1小時(shí)，然后通過過濾和離心除去提取液中的固型雜質(zhì)；將上述離心液用前處理好D101型大孔樹脂吸附，吸附飽和后，用3倍柱體積的純水洗脫糖蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再分別用5％、70％乙醇溶液梯度洗脫，收集70％乙醇溶液的洗脫液，上樣量15ml/min，洗脫流速3.5ml/min；收集的70％乙醇洗脫液減壓濃縮，減壓濃縮真空度為0.075-0.095Mpa,溫度為50℃以下，濃縮至體積1/5-1/20，且無醇味；濃縮液滅菌后，進(jìn)行噴霧干燥，得到目標(biāo)成分精制越橘花青素，得到含花青素為27.2％的產(chǎn)物0.21g，產(chǎn)品總收率為84％。噴霧干燥的的進(jìn)風(fēng)溫度120℃，出風(fēng)溫度50℃。

實(shí)施例2

選取除雜后新鮮的越橘果實(shí)或低溫儲(chǔ)藏并解凍的凍果50g，裝入250mL三角瓶中，加入培養(yǎng)基，滅菌，培養(yǎng)基的主要成分為蔗糖12％、磷酸二氫鉀3.5％、硫酸鎂0.02％、硝酸銨0.3％、山芋粉3％。然后在無菌操作臺(tái)上按接種量2％.將單一黑曲霉菌接入瓶中，加入蒸餾水，使原料的含水量達(dá)到20％，PH值達(dá)到4.0，在智能培養(yǎng)箱中60℃條件下培養(yǎng)降解3小時(shí)；按料液比1:12(g/ML)加入蒸餾水，避光攪拌3次，每次2小時(shí)得到提取液；提取液中加入3％的ZTC1+1絮凝劑，在溫度50℃的條件下攪拌20min，后靜置1.5小時(shí)，然后通過過濾和離心除去提取液中的固型雜質(zhì)；將上述離心液用前處理好AB-8型大孔樹脂吸附，吸附飽和后，用4倍柱體積的純水洗脫糖蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再分別用10％、60％乙醇溶液梯度洗脫，收集60％乙醇溶液洗脫液，上樣量15ml/min，洗脫流速3.5ml/min；收集的60％乙醇洗脫液減壓濃縮，減壓濃縮真空度為0.075-0.095Mpa,溫度為60℃以下，濃縮至體積1/5-1/20，且無醇味；濃縮液滅菌后，進(jìn)行噴霧干燥，得到目標(biāo)成分精制越橘花青素，得到含花青素為21.6％的產(chǎn)物0.16g，產(chǎn)品總收率為64.1％噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)溫度120℃，出風(fēng)溫度50℃。

實(shí)施例3

選取除雜后新鮮的越橘果實(shí)或低溫儲(chǔ)藏并解凍的凍果50g，按料液比1:14(g/ML)加入蒸餾水，避光攪拌3次，每次2小時(shí)得到提取液；液中加入2.5％的ZTC1+1絮凝劑，在溫度30℃的條件下攪拌30min,后靜置2小時(shí)，然后通過過濾和離心出去提取液中的固型雜質(zhì)；將上述離心液用前處理好D4020型大孔樹脂吸附，吸附飽和后，用4倍柱體積的純水洗脫糖蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再分別用15％、80％乙醇溶液梯度洗脫，收集80％乙醇溶液洗脫液，上樣量15ml/min，洗脫流速3.5ml/min；收集80％乙醇洗脫液減壓濃縮，減壓濃縮真空度為0.075-0.095Mpa,溫度為40℃以下，濃縮至體積1/5-1/20，且無醇味；濃縮液滅菌后，進(jìn)行噴霧干燥，得到目標(biāo)成分精制越橘花青素，得到含花素為18.7％的產(chǎn)物0.09g，產(chǎn)品總收率為36.7％。噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)溫度120℃，出風(fēng)溫度50℃。

實(shí)施例4

選取經(jīng)過揀選除雜后新鮮的越橘果實(shí)或低溫儲(chǔ)藏并解凍的凍果50g，裝入250mL三角瓶中，加入培養(yǎng)基，滅菌，培養(yǎng)基的主要成分為蔗糖12.6％、磷酸二氫鉀3.85％、硫酸鎂0.026％、硝酸銨0.2％、山芋粉3.78％。然后在無菌操作臺(tái)上按接種量0.5％將單一青霉菌接入瓶中，加入蒸餾水，使原料的含水量達(dá)到30％，PH值達(dá)到5.0，在智能培養(yǎng)箱中50℃條件下培養(yǎng)降解5小時(shí)；按料液比1:10(g/ML)加入蒸餾水，避光攪拌2次，每次2小時(shí)得到提取液；將上述提取液的離心液用前處理好D101型大孔樹脂吸附，吸附飽和后，用3倍柱體積的純水洗脫糖蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再分別用5％、70％乙醇溶液梯度洗脫，收集70％乙醇溶液的洗脫液，上樣量15ml/min，洗脫流速3.5ml/min；收集的70％乙醇洗脫液減壓濃縮，減壓濃縮真空度為0.075-0.095Mpa,溫度為50℃以下，濃縮至體積1/5-1/20，且無醇味；濃縮液滅菌后，進(jìn)行噴霧干燥，得到目標(biāo)成分精制越橘花青素，得到含花青素為15.7％的產(chǎn)物0.11g，產(chǎn)品總收率為44.2％。噴霧干燥的的進(jìn)風(fēng)溫度120℃，出風(fēng)溫度50℃。

實(shí)施例5

選取經(jīng)過揀選除雜后新鮮的越橘果實(shí)或低溫儲(chǔ)藏并解凍的凍果50g，裝入250mL三角瓶中，加入培養(yǎng)基，滅菌，培養(yǎng)基的主要成分為蔗糖13％、磷酸二氫鉀4％、硫酸鎂0.03％、硝酸銨0.1％、山芋粉4％。然后在無菌操作臺(tái)上按接種量2％將單一青霉菌接入瓶中，加入蒸餾水，使原料的含水量達(dá)到20％，pH值達(dá)到4.0，在智能培養(yǎng)箱中40℃條件下培養(yǎng)降解5小時(shí)；按料液比1:14(g/ML)加入蒸餾水，避光攪拌3次，每次2.5小時(shí)得到提取液；提取液中加入2.5％的ZTC1+1絮凝劑，在溫度30℃的條件下攪拌30min,后靜置2小時(shí)，然后通過過濾和離心除去提取液中的固型雜質(zhì)；將上述離心液用前處理好D101型大孔樹脂吸附，吸附飽和后，用3倍柱體積的純水洗脫糖蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再分別用15％、80％乙醇溶液梯度洗脫，收集80％乙醇溶液的洗脫液，上樣量15ml/min，洗脫流速3.5ml/min；收集的80％乙醇洗脫液減壓濃縮，減壓濃縮真空度為0.075-0.095Mpa,溫度為50℃以下，濃縮至體積1/5-1/20，且無醇味；濃縮液滅菌后，進(jìn)行噴霧干燥，得到目標(biāo)成分精制越橘花青素，得到含花青素為25.2％的產(chǎn)物0.17g，產(chǎn)品總收率為68％。噴霧干燥的的進(jìn)風(fēng)溫度120℃，出風(fēng)溫度50℃。