本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種控制水稻雄性育性的基因及該基因的用途。

背景技術(shù)：

水稻(Oryza sativa L.)是最重要的糧食作物之一。全世界一半左右的人口以水稻作為主食，尤其是人口總數(shù)超過世界總?cè)丝跀?shù)60％的亞洲各國(guó)。提高水稻的產(chǎn)量是全世界水稻育種家的長(zhǎng)期目標(biāo)。

目前水稻育種有兩種主要途徑。一種是通過雜交和回交等手段，選育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的常規(guī)稻品種。常規(guī)稻無需雜交制種，方便省力；一般地，常規(guī)稻的米質(zhì)好于常見的雜交稻。但是常規(guī)稻自留種連年種植經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生品種混雜衰退，影響水稻產(chǎn)量。而雜交稻是另外一種水稻育種的成功方法。雜交水稻是指用兩個(gè)遺傳背景不同的水稻親本，經(jīng)過雜交得到的F₁代的種子，將F₁代種子直接提供給農(nóng)民種植。F₁代具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，田間種植后表現(xiàn)出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和多抗等優(yōu)良性狀。

目前常用的雜交水稻系統(tǒng)有三系雜交稻和兩系雜交稻兩種。三系雜交稻包括不育系、保持系和恢復(fù)系三系。雄性不育系的雄性器官發(fā)育不正常，不能自交結(jié)實(shí)，雌性器官卻發(fā)育正常能接受外來花粉而受精結(jié)實(shí)。雄性不育系接受恢復(fù)系的花粉授給后，結(jié)實(shí)正常，而且新產(chǎn)生的雜種一代育性恢復(fù)正常，能自交結(jié)實(shí)，并具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。不育系自交不結(jié)實(shí)，需要通過保持系為其授粉結(jié)實(shí)，而后代仍保持雄性的不育特性。目前，三系雜交水稻種的不育系均為細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其中野敗型、紅蓮型和包臺(tái)型是國(guó)際公認(rèn)的3種細(xì)胞質(zhì)雄性不育水稻主要類型。

兩系雜交水稻中，不育系通常為光溫敏不育系。在某些光溫等外界條件下，不育系的育性得到恢復(fù)，可以收獲自交種子，用于下年的制種，因而不再需要額外的保持系。三系雜交稻的不育系一般選自細(xì)胞質(zhì)雄性不育株系，而光溫敏不育系一般為核基因控制育性。

雜交水稻已經(jīng)在生產(chǎn)廣泛應(yīng)用。經(jīng)過多年的努力，科學(xué)們?cè)谒炯?xì)胞質(zhì)雄性不育的調(diào)控機(jī)制方面已經(jīng)取得較多進(jìn)展，同時(shí)也克隆了數(shù)十個(gè)調(diào)控雄性不育的核基因。已經(jīng)鑒定出的調(diào)控水稻雄性不育的核基因主要作用于水稻雄蕊發(fā)育的中后期，影響了包括減數(shù)分裂的進(jìn)程、絨氈層的發(fā)育和降解、花粉外壁的沉積、花粉囊的開裂和藥室內(nèi)的氧化還原狀態(tài)等在內(nèi)的多個(gè)過程。盡管已取得上述研究進(jìn)展，但控制水稻育性的分子機(jī)理仍然不很清楚，尤其是調(diào)控水稻早期雄蕊發(fā)育的基因，更是鮮有報(bào)道。

現(xiàn)有的研究證明，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合新近開發(fā)的植物基因組編輯技術(shù)，將有助于揭示控制重要農(nóng)業(yè)性狀的基因功能，從而有助于更加快速地挖掘潛在的可能用于育種實(shí)踐的基因，高效地培育出具有實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的優(yōu)良水稻新品種。但現(xiàn)有的成果還極少能夠直接投入到生產(chǎn)應(yīng)用中，更多的參與調(diào)控水稻雄性不育的基因還有待發(fā)現(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種控制水稻雄性育性的蛋白及其編碼基因，用于闡明水稻雄性不育的調(diào)控機(jī)制，為雜交水稻的培育提供潛在的育種資源。

本發(fā)明通過遺傳研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)調(diào)控水稻雄蕊早期發(fā)育的蛋白，當(dāng)該編碼基因敲除后，可使水稻的雄蕊發(fā)育異常，并且完全不能產(chǎn)生花粉，最終導(dǎo)致雄性不育。

本發(fā)明所提供的控制水稻雄性育性的蛋白，命名為OsMPL，來源于水稻(Oryza sativa)品種日本晴，具有下述氨基酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：3；

2)序列表中的SEQ ID NO：3氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的具有同等功能的氨基酸序列。

序列表中的SEQ ID NO：3由349個(gè)氨基酸殘基組成。對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行取代、缺失或添加的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通常是利用基因工程的手段對(duì)其編碼基因進(jìn)行突變，然后再表達(dá)出相應(yīng)的蛋白。通過在植物中表達(dá)所述蛋白，并測(cè)試這些植物的花藥和花粉的發(fā)育情況，可以判斷發(fā)生這些變化后的蛋白是否還具有控制水稻雄性育性的功能。

本發(fā)明提供的控制水稻雄性育性的蛋白OsMPL的表達(dá)量和/或活性會(huì)影響花藥和花粉的發(fā)育，從而可調(diào)控水稻的雄性育性。

編碼上述控制水稻育性蛋白的編碼基因OsMPL可以是所述基因的cDNA序列，也可以是所述基因的基因組DNA序列，或者是與這些序列具有90％以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQ ID NO：1所示的基因組DNA序列和SEQ ID NO：2所示的cDNA序列。

敲除或改變所述編碼基因的核苷酸序列，使之不能表達(dá)所述控制水稻育性的蛋白或降低表達(dá)水平，或者使表達(dá)的氨基酸序列發(fā)生缺失或變異，進(jìn)而使得該氨基酸序列對(duì)應(yīng)的多肽喪失活性，可導(dǎo)致花粉和花藥發(fā)育異常。

本發(fā)明所提供的控制水稻雄性育性的蛋白或其編碼基因的用途，包括但不限于下述幾個(gè)方面：

1)控制水稻雄性器官的育性；

2)作為水稻雄性育性的分子標(biāo)記；

3)創(chuàng)制水稻雄性不育株系；

4)創(chuàng)造新的雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑，培育新品種。

本發(fā)明創(chuàng)制水稻雄性不育株系的方法，包括：敲除目的水稻的OsMPL基因，或使目的水稻的該基因突變導(dǎo)致表達(dá)的蛋白失活，或者抑制目的水稻中OsMPL基因的表達(dá)，得到水稻雄性不育株系；其中所述目的水稻為攜帶OsMPL基因的水稻。

采用常規(guī)的基因工程方法即可實(shí)現(xiàn)OsMPL基因的敲除或突變，以及抑制或降低的OsMPL基因的表達(dá)。可以通過任意已知的基因定點(diǎn)突變或干擾系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)，例如CRISPR/Cas9系統(tǒng)、TALEN系統(tǒng)、鋅指酶系統(tǒng)、RNA干擾和人工小RNA技術(shù)(artificialmicroRNA)等技術(shù)手段。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，將靶標(biāo)OsMPL基因的CRISPR/Cas9載體導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官，再將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株，得到雄性不育的轉(zhuǎn)基因植物。

能夠在水稻基因組上對(duì)所述OsMPL基因進(jìn)行定點(diǎn)突變的表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明定點(diǎn)突變水稻基因OsMPL或其同源序列的元件可通過植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官。用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，還可為可在原核生物中復(fù)制的載體，如pUC系列載體或pBluescript系列載體等。

為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、羧芐青霉素標(biāo)記物或卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。

攜帶有突變本發(fā)明控制雄性育性的水稻基因OsMPL的植物表達(dá)載體可通過使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca²⁺、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。

此外，通過突變本發(fā)明控制雄性育性的水稻基因OsMPL的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可從中進(jìn)一步篩選出基因純合的突變植株。

本發(fā)明獲得的水稻雄性不育株系可以作為母本進(jìn)行雜交育種。采用常規(guī)遺傳手段將所述OsMPL基因轉(zhuǎn)入該水稻雄性不育株系的細(xì)胞或組織中，再生，可以培育成恢復(fù)雄性育性的植株。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了水稻中調(diào)控其雄性育性的蛋白及其編碼基因OsMPL，突變?cè)摶颢@得雄性不育的表型。因此，本發(fā)明涉及的OsMPL基因在植物雜交育種中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1顯示了實(shí)施例3中通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)突變OsMPL基因的序列變化情況，與野生型相比，在兩個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)的代表性的株系中，目標(biāo)位點(diǎn)處均存在1個(gè)堿基的不同插入，造成翻譯移碼。

圖2顯示了實(shí)施例3中野生型(左)和Osmpl-1功能缺失突變體(右)外觀的表型，Osmpl-1表現(xiàn)為不能結(jié)種子，但其他器官與野生型對(duì)照比沒有明顯差異。比例尺＝10厘米。

圖3顯示了實(shí)施例3中Osmpl-1和Osmpl-2功能缺失突變體的花藥表型。其中，A為掃描電鏡照片：左側(cè)為野生型，中間為Osmpl-1突變體，右側(cè)為Osmpl-2突變體；B為I₂-KI染色后顯微照片：左側(cè)為野生型，中間為Osmpl-1突變體；右側(cè)為Osmpl-2突變體。比例尺＝100微米。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell,David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。

實(shí)施例1、OsMPL基因的定點(diǎn)突變

(一)構(gòu)建OsMPL定點(diǎn)突變的入門載體：

根據(jù)序列特異性選擇兩對(duì)能夠靶標(biāo)OsMPL基因的特異性spacer序列，合成如下兩對(duì)引物：

F1：5’-GGCAAGCAAGAGGGCGCCGCAGCG-3’(SEQ ID NO：4)；

R1：5’-AAACCGCTGCGGCGCCCTCTTGCT-3’(SEQ ID NO：5)；

F2：5’-GGCACGGCGTTGAGGTCGCGGAAC-3’(SEQ ID NO：6)；

R2：5’-AAACGTTCCGCGACCTCAACGCCG-3’(SEQ ID NO：7)。

分別將兩對(duì)引物退火后，連入經(jīng)過BsaI酶切后的pOs-sgRNA質(zhì)粒(Miao et al.,2013，Cell Research 23(10):1233-1236.)中。篩選spacer插入方向正確的載體(使用R1和M13R測(cè)序引物能夠擴(kuò)增出目標(biāo)條帶)并測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pOs-sgRNA-MPL-1和pOs-sgRNA-MPL-2用于構(gòu)建OsMPL定點(diǎn)突變終載體。

(二)OsMPL定點(diǎn)突變終載體的構(gòu)建：

為了構(gòu)建OsMPL定點(diǎn)突變終載體，首先將pOs-sgRNA-MPL-1和pOs-sgRNA-MPL-2載體與pH-Ubi-cas9-7載體(Miao et al.,2013，Cell Research 23(10):1233-1236.)進(jìn)行LR反應(yīng)(Invitrogen公司)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行PCR篩選陽(yáng)性克隆，提取含有能夠靶標(biāo)OsMPL基因的元件的質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證正確后用于水稻的愈傷轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例2、定點(diǎn)突變OsMPL基因的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得：

(一)水稻愈傷誘導(dǎo)：

選取飽滿的日本晴水稻種子，剝?nèi)シN皮，滅菌洗滌后，均勻的點(diǎn)入在帶有2毫克/升2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的滅菌MS固體培養(yǎng)基，32℃持續(xù)光照5天誘導(dǎo)愈傷形成。

(二)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：

將OsMPL定點(diǎn)突變終載體的質(zhì)粒用電激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，涂布帶有50微克/升壯觀霉素和50微克/升利福平的固體LB培養(yǎng)基，28℃黑暗培養(yǎng)2天后，用基因特異引物U1和C1篩選陽(yáng)性克隆。得到的陽(yáng)性克隆在含50微克/升壯觀霉素和50微克/升利福平的液體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.8，用于水稻轉(zhuǎn)化。

U1：5’-GCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCG-3’(SEQ ID NO：8)；

C1：5’-AGTTGGGCGATCAGATTCTC-3’(SEQ ID NO：9)。

(三)水稻愈傷轉(zhuǎn)化：

選取生長(zhǎng)狀況良好的愈傷組織，在菌液中浸泡2分鐘，之后在無菌濾紙上晾干，再將愈傷組織移至含有100微摩爾/升乙酰丁香酮的NB共培養(yǎng)培養(yǎng)基，25℃黑暗下共培養(yǎng)3天。

(四)篩選水稻愈傷：

共培養(yǎng)3天后，用無菌水洗滌愈傷5次，再用200毫升的含有500毫克/升羧芐青霉素鈉的無菌水洗一遍，小心倒去液體，用無菌鑷子將愈傷組織夾取至無菌濾紙上，晾干后轉(zhuǎn)移至NB篩選培養(yǎng)基上(含有2毫克/升的2,4-D、50毫克/升的潮霉素和400毫克/升的羧芐青霉素鈉)，32℃持續(xù)光照2周。

(五)陽(yáng)性愈傷的分化：

選取生長(zhǎng)良好呈嫩黃色的陽(yáng)性愈傷組織，用無菌鑷子移至NB預(yù)分化培養(yǎng)基(含有1毫克/升萘乙酸(NAA)、5毫克/升脫落酸(ABA)、2毫克/升激動(dòng)素(kinetin)、25毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧芐青霉素鈉)，32℃持續(xù)光照培養(yǎng)。2周后挑選生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織轉(zhuǎn)入MS分化培養(yǎng)基(含有0.02毫克/升NAA、2毫克/升kinetin、50毫克/升的潮酶素和200毫克/升的羧芐青霉素鈉)，32℃持續(xù)光照培養(yǎng)。待分化出來的幼苗長(zhǎng)至2至5毫米，轉(zhuǎn)入不含激素和抗生素的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)2到3周，之后移入土中置于溫室中生長(zhǎng)(溫度28-30℃，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)。

實(shí)施例3、OsMPL功能缺失突變體的分子鑒定和表型鑒定

(一)轉(zhuǎn)基因水稻中OsMPL基因的定點(diǎn)突變：

剪取轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的葉片，用植物總DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)提取植物總DNA。根據(jù)OsMPL基因的基因座DNA序列設(shè)計(jì)基因特異性引物MPL-F和MPL-R進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增含有OsMPL目標(biāo)突變位點(diǎn)的片段，并測(cè)序檢查OsMPL基因的突變情況：

MPL-F：5'-GGAGACAGCCTCCCTTCGAGTACACTA-3'(SEQ ID NO：10)；

MPL-R：5'-GGCAGGAGGAGGAGGAAGAAGAAGA-3'(SEQ ID NO：11)。

測(cè)序檢測(cè)OsMPL基因的突變情況，發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)位點(diǎn)處檢測(cè)到一個(gè)堿基的不同插入的兩類該基因的突變體，分別命名為Osmpl-1和Osmpl-2，如圖1所示。Osmpl-1和Osmpl-2除了不結(jié)種子，外觀與野生型的水稻沒有明顯差異，如圖2所示。

(二)OsMPL定點(diǎn)突變轉(zhuǎn)基因水稻花藥表型的觀察：

本研究采用掃描電鏡觀察花藥外觀，并拍照記錄；用I₂-KI染色觀察花粉囊內(nèi)部的劃分情況；并對(duì)OsMPL功能缺失突變體授以野生型水稻的花粉，觀察突變體子房是否發(fā)育正常。如圖3所示，掃描電鏡分析表明Osmpl-1和Osmpl-2功能缺失突變體花藥外觀都扭曲，與野生型的很不相同(見圖3中A)。I₂-KI染色后顯微鏡觀察表明Osmpl-1和Osmpl-2功能缺失突變體花藥的內(nèi)部不含花粉粒，而野生型的花藥中充滿可被I₂-KI染色的成熟花粉粒(見圖3中B)。當(dāng)授以野生型花粉時(shí)，Osmpl-1和Osmpl-2突變體都可以正常結(jié)實(shí)，說明OsMPL的功能缺失導(dǎo)致水稻雄性不育，而雌蕊發(fā)育正常，說明敲除OsMPL可導(dǎo)致水稻雄性不育。