本發(fā)明涉及生命科學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)體系。
背景技術(shù)：
：干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化為多種功能細(xì)胞，干細(xì)胞包括體細(xì)胞來源的干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，干細(xì)胞的分化培養(yǎng)可以采用成熟體細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)來誘導(dǎo)干細(xì)胞的定向分化。申請(qǐng)公布號(hào)為CN105132367A的中國專利《間充質(zhì)干細(xì)胞的三維共培養(yǎng)誘導(dǎo)方法》公開了一種間充質(zhì)干細(xì)胞的三維共培養(yǎng)誘導(dǎo)方法，包括以下步驟：分別獲取間充質(zhì)干細(xì)胞和目的細(xì)胞源；將間充質(zhì)干細(xì)胞與含有磁性氧化物包裹于凝膠球A中；將目的細(xì)胞源包裹于凝膠球B中；用誘導(dǎo)劑對(duì)凝膠球A內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞和凝膠球B中的目的細(xì)胞源進(jìn)行共培養(yǎng)至間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為目的細(xì)胞，然后將凝膠球A和凝膠球B置于磁場中進(jìn)行分離；其中，磁性氧化物顆粒的直徑為1-100nm。但是上述間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法存在以下缺點(diǎn)：在培養(yǎng)過程中間充質(zhì)干細(xì)胞被包裹在凝膠球A中，目標(biāo)細(xì)胞源被包裹在凝膠球B中，間充質(zhì)干細(xì)胞不會(huì)直接與目標(biāo)細(xì)胞源接觸，目標(biāo)細(xì)胞源僅僅只能通過旁分泌機(jī)制來對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，不能進(jìn)行細(xì)胞間接觸和縫隙連接，而縫隙連接在干細(xì)胞分化中是必須的，會(huì)影響干細(xì)胞分化效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)體系，具有分化率高的效果。本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)體系，包括培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)干細(xì)胞和體細(xì)胞；細(xì)胞載體，所述細(xì)胞載體包含中部的空腔、設(shè)置于所述細(xì)胞載體外表面的一層PIPAAm膜和貫穿所述細(xì)胞載體內(nèi)外的通孔。通過采用上述技術(shù)方案，細(xì)胞外微環(huán)境在干細(xì)胞誘導(dǎo)分化中具有重要作用，在干細(xì)胞研究領(lǐng)域，將干細(xì)胞和體細(xì)胞共培養(yǎng)，能促進(jìn)干細(xì)胞增值和誘導(dǎo)干細(xì)胞分化。首先將細(xì)胞載體放入培養(yǎng)有干細(xì)胞的培養(yǎng)基內(nèi)，動(dòng)物細(xì)胞具有貼壁生長的特性，干細(xì)胞會(huì)附著在細(xì)胞載體外表面上的PIPAAm膜上。將帶有體細(xì)胞的培養(yǎng)基放入到細(xì)胞載體的空腔內(nèi)，使得體細(xì)胞附著于細(xì)胞載體內(nèi)部的空腔內(nèi)貼壁生長。然后取下密封塞，使得細(xì)胞載體內(nèi)的體細(xì)胞和細(xì)胞載體外壁的干細(xì)胞接觸。共培養(yǎng)過程中，干細(xì)胞通過分泌一些細(xì)胞因子通過通孔后作用于干細(xì)胞，促進(jìn)干細(xì)胞的分化和增值，即旁分泌機(jī)制。除了旁分泌機(jī)制，體細(xì)胞和干細(xì)胞之間還能通過通孔直接接觸，實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞和體細(xì)胞之間的直接接觸和縫隙連接?？p隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞間反應(yīng)是干細(xì)胞分化中必需的。當(dāng)干細(xì)胞和體細(xì)胞共培養(yǎng)一端時(shí)間后，將干細(xì)胞和體細(xì)胞進(jìn)行分離，PIPAAm膜是一種用多聚物PIPAAm合成膜，在32攝氏度以下為親水性，不會(huì)與細(xì)胞發(fā)生粘結(jié)，在32攝氏度以上為疏水性，會(huì)與細(xì)胞發(fā)生粘結(jié)。干細(xì)胞和體細(xì)胞共培養(yǎng)是保持溫度在32攝氏度以上，干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，將培養(yǎng)基內(nèi)的溫度調(diào)整到30攝氏度以下，即可將附著在細(xì)胞載體外壁上的干細(xì)胞剝落，實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞和體細(xì)胞的分離。達(dá)到了干細(xì)胞誘導(dǎo)分化率高、增殖速度快的效果。本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：所述細(xì)胞載體由殼聚糖和磷酸鈣材料制作而成。通過采用上述技術(shù)方案，殼聚糖是一種帶正電荷的堿性多糖聚合物，生物相容性好，兼具無毒和抗菌的作用。同時(shí)殼聚糖表面分子帶有的親水性的功能基團(tuán)，使得在培養(yǎng)過程中便于細(xì)胞的粘附。但是殼聚糖無法單獨(dú)使用，在殼聚糖中加入鈴酸鈣以提高細(xì)胞載體的強(qiáng)度，使得細(xì)胞載體具有良好的生物相容性和降解性以及優(yōu)異的材料與細(xì)胞接觸面。本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：所述培養(yǎng)基包括胰島素、β-疏基乙醇、白血病抑制因子和基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基之間的一種。通過采用上述技術(shù)方案，在干細(xì)胞增殖時(shí)胰島素樣生長因子具有顯著的促進(jìn)作用，但是在實(shí)際過程中存在提取十分困難，胰島素與胰島素樣生長因子不僅結(jié)構(gòu)類似，功能上也一致，通過用胰島素代替胰島素樣生長因子，來實(shí)現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。白血病抑制因子,其為一種具有多種功能的細(xì)胞因子,能提高細(xì)胞的活性和促進(jìn)干細(xì)胞增值。β-疏基乙醇也能在干細(xì)胞分化時(shí)促進(jìn)干細(xì)胞的增值，通過向基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加胰島素、β-疏基乙醇和白血球抑制因子，再配合體細(xì)胞分泌的物質(zhì)，能起到協(xié)同促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和分化。本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基。通過采用上述技術(shù)方案，高糖DMEM培養(yǎng)基能在干細(xì)胞的增殖過程中提供原料，促進(jìn)干細(xì)胞的分化。本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：所述細(xì)胞載體包括上端開口的管體和用于密封所述管體開口的封蓋，所述管體豎直放置于所述培養(yǎng)基內(nèi)。通過采用上述技術(shù)方案，細(xì)胞載體設(shè)置為上端開口的管體和封蓋，向管體內(nèi)加入體細(xì)胞，再用封蓋封住開口即可。本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：所述干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)體系包括多個(gè)所述細(xì)胞載體。通過采用上述技術(shù)方案，干細(xì)胞多為貼壁細(xì)胞，最常見的培養(yǎng)為二維靜態(tài)培養(yǎng)，但是在常規(guī)的二維貼壁靜態(tài)培養(yǎng)體系中，當(dāng)需要較大規(guī)模分化培養(yǎng)時(shí)，不僅需要增加培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基，也增加了人工。采用在干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)體系中同時(shí)放入多個(gè)細(xì)胞載體，能夠?qū)崿F(xiàn)在同一培養(yǎng)體系下同時(shí)進(jìn)行分化培養(yǎng)，不需要額外增加培養(yǎng)容器，節(jié)省人工。綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：采用在細(xì)胞載體上設(shè)置通孔，使得細(xì)胞載體內(nèi)壁的體細(xì)胞和細(xì)胞載體外壁的干細(xì)胞在細(xì)胞間接觸，促進(jìn)干細(xì)胞的分化，同時(shí)在細(xì)胞載體外壁設(shè)置一層PIPAAm膜，使得在分離體細(xì)胞和分化后的干細(xì)胞時(shí)不需要采用生物酶處理，其次，細(xì)胞載體內(nèi)壁具有良好的接觸面，供體細(xì)胞附著生長，達(dá)到了分化后分離方便、干細(xì)胞分化率高的效果。具體實(shí)施方式具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的解釋，其并不是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對(duì)本實(shí)施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護(hù)。實(shí)施例1：一種干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)體系，包括培養(yǎng)容器、培養(yǎng)基和多個(gè)細(xì)胞載體。首先配置培養(yǎng)基，培養(yǎng)基包含β-疏基乙醇、胰島素、白血病抑制因子和基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中β-疏基乙醇濃度為0.1mmol/ml，白血病抑制因子濃度為1.5×103U/ml，胰島素濃度為10-50ng/ml，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為高糖型DMEM培養(yǎng)基。制作細(xì)胞載體，將固相的磷酸三鈣粉末以及液相的殼聚糖溶液在室溫下以0.7g:1mL的比例混合，攪拌均勻呈糊狀，置于模具中制作成上端開口的管體和用于插入開口中的封蓋。選用一張PIPAAm膜用無毒的膠水粘附固定于細(xì)胞載體外壁后，選用滅菌后的針扎穿細(xì)胞載體側(cè)壁，形成通孔，并選用適配于通孔的密封塞插入通孔內(nèi)進(jìn)行密封。密封塞選用橡膠。將細(xì)胞載體豎直放置于培容器內(nèi)，加入向培養(yǎng)其和細(xì)胞載體內(nèi)加入培養(yǎng)基，并向培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)基中加入干細(xì)胞，細(xì)胞載體內(nèi)加入體細(xì)胞，在37攝氏度下培養(yǎng)1天，等體細(xì)胞附著于細(xì)胞載體內(nèi)壁后，拔下通孔內(nèi)的密封塞，繼續(xù)培養(yǎng)2-7天。將培養(yǎng)容器溫度降低至30攝氏度，輕微振蕩將干細(xì)胞從細(xì)胞載體上脫落，取出微載體即可。干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)體系中的體細(xì)胞和干細(xì)胞可選自人、兔等哺乳動(dòng)物。為避免涉及倫理道德，上述體細(xì)胞選用大鼠心肌樣細(xì)胞，干細(xì)胞選用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。商購出生1-3天的Wistar大鼠乳鼠和4-6周的wistar大鼠，從wistar大鼠內(nèi)分離純化得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。將wistar大鼠乳鼠置于超凈臺(tái)內(nèi)無菌剪去心室肌部分，剪碎組織至1mm,加入0.125％胰蛋白酶，37攝氏度水浴消化5-6分鐘，收集消化后的液體至含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)，消化液過濾后再37攝氏度下水浴5分鐘，重復(fù)8次，離心7分鐘，接種在生長培養(yǎng)基內(nèi)孵育2小時(shí)，吸出細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)，在含有10％deDMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。吸出一部分細(xì)胞以2×104/cm2接種于放有玻片的6孔板中，采用間接免疫熒光鑒定所培養(yǎng)的心肌樣細(xì)胞。用熒光染液CM-Di標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，按上述方法與大鼠心肌樣細(xì)胞共培養(yǎng)后，共培養(yǎng)結(jié)束后，用間接免疫熒光方法檢測大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞是否表達(dá)心肌特異性抗原情況，所用抗體為小鼠抗大鼠肌球蛋白(myosin,購自Necmarkers公司)、小鼠抗大鼠肌球蛋白T(TroponinT,購自Necmarkers公司)，操作方法如下：棄去培養(yǎng)液，得到共培養(yǎng)后的干細(xì)胞，用PBS沖洗后，4％多聚甲醛室內(nèi)固定30分鐘，滴加3％H2O2，室溫放置15分鐘，加入50ul小鼠抗大鼠肌球蛋白或小鼠抗大鼠肌球蛋白T，4攝氏度處理12小時(shí)；加入100μLFITC-二抗，室溫富孵育40分鐘，DAPI染細(xì)胞核后PBS清洗，封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，如細(xì)胞同時(shí)顯示紅光及綠光，則說明該細(xì)胞為已分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。并將結(jié)果記錄在以下表1中。實(shí)施例2：一種干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)體系，與實(shí)施例1的不同之處在于，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基，并對(duì)共培養(yǎng)后的干細(xì)胞進(jìn)行檢測，將結(jié)果記錄在以下表1中。實(shí)施例3：一種干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)體系，與實(shí)施例1的不同之處在于，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，并對(duì)共培養(yǎng)后的干細(xì)胞進(jìn)行檢測，將結(jié)果記錄在以下表1中。對(duì)比例1：一種干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)體系，與實(shí)施例1的不同之處在于，細(xì)胞載體內(nèi)沒有添加體細(xì)胞。對(duì)比例2：一種干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)體系，與實(shí)施例1的不同之處在于，細(xì)胞載體內(nèi)添加干細(xì)胞。表1干細(xì)胞是否分化實(shí)施例1是實(shí)施例2是實(shí)施例3是對(duì)比例1否對(duì)比例2否當(dāng)前第1頁1 2 3