本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種酶標(biāo)記抗原抗體的制備方法 。
背景技術(shù)：
免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有檢測(cè)速度快、費(fèi)用低廉、儀器簡單易攜、靈敏度高和選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)。它將酶催化反應(yīng)的放大作用和抗原抗體親和反應(yīng)的高度專一性、特異性相結(jié)合，以酶標(biāo)記的抗原或抗體作為關(guān)鍵試劑進(jìn)行免疫測(cè)試，所以具有很高的靈敏度。用于標(biāo)記抗原或抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。當(dāng)前應(yīng)用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應(yīng)用最廣。辣根過氧化物酶（HRP）是從植物辣根中提取的一種酶，這種酶含有血紅素, 能利用H2O2 氧化許多有機(jī)和無機(jī)化合物。該酶有著廣泛的商業(yè)用途，例如可作為臨床診斷和免疫測(cè)定的試劑等。HRP含有308個(gè)氨基酸殘基，分子量約為40KD，含糖量約為18%（Nigel C.Veitch.Horseradish peroxidase:a modern view of a classic enzyme[J].ELSEVIER.65(2004) 249-259）。
用于蛋白質(zhì)分子交聯(lián)的方法制備酶標(biāo)記抗原抗體主要包括混合酸酐法、重氮化合物法、戊二醛法、過碘酸鈉法等等，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，具體交聯(lián)方法的選擇還需根據(jù)目標(biāo)分子可用活性官能團(tuán)（羧基、氨基、醛基、羥基、巰基等）進(jìn)行確定。根據(jù)HRP分子特點(diǎn)，大多利用過碘酸鈉法進(jìn)行酶標(biāo)抗原、抗體的制備。過碘酸鈉法基本原理是：利用過碘酸鈉的氧化性將HRP分子中鄰羥基氧化為醛基，然后再與伯氨基反應(yīng)生成西佛堿，通過還原劑將西佛堿還原為穩(wěn)定的碳氮單鍵。大多數(shù)抗原抗體都為蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)，表面具有賴氨酸殘基暴露出的伯氨基，可用來與HRP分子上活化后的醛基進(jìn)行反應(yīng)。
傳統(tǒng)過碘酸鈉法在對(duì)某些抗原、抗體進(jìn)行標(biāo)記時(shí)存在著一些弊端，例如實(shí)驗(yàn)周期長、交聯(lián)效率低、酶標(biāo)抗原抗體反應(yīng)性較差等，這就在一定程度上限制了其應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種酶標(biāo)記抗原抗體的制備方法，采用本發(fā)明方法制備酶標(biāo)記抗原、抗體，能夠縮短酶標(biāo)記抗原、抗體實(shí)驗(yàn)周期，同時(shí)提高酶分子與抗原、抗體的交聯(lián)效率，提升酶結(jié)合物的反應(yīng)性。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案：
本發(fā)明所述的酶標(biāo)記抗原抗體的制備方法如下：首先利用過碘酸鈉的氧化性將辣根過氧化物酶分子中鄰羥基氧化為醛基，透析除去小分子物質(zhì)后，在酶溶液中加入凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥處理，待用；
在進(jìn)行抗原、抗體標(biāo)記時(shí)，首先對(duì)抗原、抗體堿化處理，將其伯氨基暴露后，再加入上述冷凍干燥處理的醛基化后的辣根過氧化物酶分子進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間1~1.5h，反應(yīng)結(jié)束后加入防凍保護(hù)劑，-20℃低溫條件下長期保存。
所述過碘酸鈉氧化辣根過氧化物酶時(shí)，過碘酸鈉與辣根過氧化物酶之間的摩爾比為20:1，反應(yīng)時(shí)間為30min ；終止反應(yīng)后按照每毫克辣根過氧化物酶加入20ul終止液，終止反應(yīng)時(shí)間15 min。
所述終止液為乙二醇。
透析除去小分子物質(zhì)所用的透析液為酸性醋酸鹽緩沖液；所述酶溶液中加入的凍干保護(hù)劑為10%海藻糖。
所述抗原、抗體為表面含有氨基的蛋白質(zhì)分子，堿化處理是將待標(biāo)記樣本在pH 9.6 0.01~0.02 M 碳酸鹽緩沖液透析過夜或加入pH 9.6 0.5M 碳酸鹽啟動(dòng)劑，其中啟動(dòng)劑的加入量為待標(biāo)記樣本體積的1/5。
進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)溫度為室溫；交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后加入還原劑，將不穩(wěn)定的西佛堿還原為穩(wěn)定的碳氮雙鍵，其中所用還原劑為濃度4mg/ml的硼氫化鈉，加入量按1mg辣根過氧化物酶加25ul硼氫化鈉計(jì)。
交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后加入的防凍保護(hù)劑為與酶結(jié)合物等體積的丙三醇。
本發(fā)明通過將蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)與冷凍干燥技術(shù)相結(jié)合，并對(duì)傳統(tǒng)過碘酸鈉法進(jìn)行了改良優(yōu)化，大大縮短了酶標(biāo)抗原、抗體的實(shí)驗(yàn)周期，同時(shí)提高了辣根過氧化物酶（HRP）與抗原、抗體的交聯(lián)效率，提升了酶標(biāo)結(jié)合物的反應(yīng)性。具體來說，其優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：
1、交聯(lián)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)周期短。傳統(tǒng)過碘酸鈉法標(biāo)記抗原、抗體實(shí)驗(yàn)周期為4-5d；本發(fā)明利用冷凍干燥技術(shù)將醛基化之后的HRP冷藏保存?zhèn)溆?，在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，將抗原、抗體堿化處理后即可進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期僅為1-2d，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。
2、HRP與抗原、抗體偶聯(lián)后酶結(jié)合物的反應(yīng)性強(qiáng)于傳統(tǒng)過碘酸鈉法。采用本發(fā)明工藝制備的酶結(jié)合物與傳統(tǒng)過碘酸鈉法相比，在多個(gè)項(xiàng)目評(píng)價(jià)酶結(jié)合物效價(jià)至少提升2倍。
3、酶結(jié)合物穩(wěn)定性好。在-20℃條件下保存三年，酶結(jié)合物反應(yīng)性無明顯變化，與傳統(tǒng)工藝制備的酶結(jié)合物穩(wěn)定性基本一致。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明所述的酶標(biāo)記抗原、抗體的制備方法做更加詳細(xì)的說明。
一、酶標(biāo)記抗體的制備方法如下：
第一步，HRP的醛化反應(yīng)
用去離子水將HRP配制成5mg/ml的溶液，過碘酸鈉配制成30mg/ml的溶液，按照HRP : 過碘酸鈉 = 1:20（摩爾比）之比例將過碘酸鈉加入到HRP溶液中，4℃條件下反應(yīng)30min；按照20ul/1mg HRP量加入所需乙二醇作為醛化反應(yīng)終止液，在4℃條件下反應(yīng)30min；終止反應(yīng)結(jié)束后，用pH 5.0 2.0mM醋酸鹽緩沖液4℃透析12h，透析期間換液3次。
第二步，HRP冷凍干燥
準(zhǔn)確測(cè)量透析后的HRP濃度（可根據(jù)初始反應(yīng)稱量HRP質(zhì)量計(jì)算HRP濃度）。根據(jù)HRP體積，加入10%海藻糖（質(zhì)量體積比）作為凍干保護(hù)劑，海藻糖徹底溶解后，按照2mg/瓶量分裝至西林瓶中；采用快速預(yù)凍方式將HRP預(yù)凍4h，再迅速轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干。凍干結(jié)束后壓塞加蓋，-20℃以下避光干燥保存。
第三步，交聯(lián)反應(yīng)
酶標(biāo)抗體制備方法如下：
量取2mg 抗體在pH 9.6 0.02M 碳酸鹽緩沖液透析過夜進(jìn)行堿化處理；按抗體與HRP反應(yīng)質(zhì)量比為1:1之比例，在2mg凍干HRP中加入2mg堿化后的抗體，室溫避光反應(yīng)1h，再加入50ul 4mg/ml的硼氫化鈉溶液，室溫反應(yīng)1h后加入酶結(jié)合物等體積的丙三醇，-20℃低溫避光保存。
酶標(biāo)記抗原制備方法如下：
量取3mg 抗原，按照抗原體積1/5計(jì)算量加入啟動(dòng)劑（pH 9.6 0.5M 碳酸鹽）進(jìn)行堿化處理；按抗原與HRP反應(yīng)質(zhì)量比為3:2之比例，在2mg凍干HRP中加入3mg堿化后的抗原，室溫避光反應(yīng)1h，再加入50ul 4mg/ml的硼氫化鈉溶液還原劑，室溫反應(yīng)1h后加入酶結(jié)合物等體積的丙三醇，-20℃低溫避光保存。