本發(fā)明屬于生物設(shè)備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來，糖尿病患病率在全球呈現(xiàn)快速增長的趨勢，我國人口患病率已達(dá)3％，該病給患者和社會帶來了巨大負(fù)擔(dān)。胰島和干細(xì)胞的深入研究，為糖尿病治療提出新的材料來源。
胰腺干細(xì)胞是干細(xì)胞的一個研究分支，干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制和多向分化能力的細(xì)胞，它們可以不斷地自我更新，并在特定條件下轉(zhuǎn)變成為一種或多種構(gòu)成人體組織或器官的細(xì)胞。干細(xì)胞是機體的起源細(xì)胞，是形成人體各種組織器官的始祖細(xì)胞。
胰腺組織存在一類具有多向分化潛力的細(xì)胞，即胰腺干細(xì)胞。胰腺干細(xì)胞具有較高的分化潛能。為滿足科學(xué)研究的需求，大量培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞成為主要的研究課題，目前專門用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒較少，而試驗人員進行分離培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的方式，培養(yǎng)用的各種試劑不盡相同，造成了培養(yǎng)的胰腺干細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量無法達(dá)到試驗的要求，并且現(xiàn)有技術(shù)有公開一些培養(yǎng)其他干細(xì)胞的試劑盒，例如CN104928238A公開的試劑盒，又如CN106047702公開的用于培養(yǎng)干細(xì)胞的試劑盒，以上試劑盒在培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞時，其存在安全性、穩(wěn)定性不高，細(xì)胞存活率和增殖率低等問題，為此，人們急需一種專門用于穩(wěn)定的大量擴增培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，由該試劑盒培養(yǎng)的胰腺干細(xì)胞具有穩(wěn)定性、活性高、增殖倍數(shù)顯著提高等優(yōu)點。
本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括保存液、培養(yǎng)液、培養(yǎng)液添加劑，所述保存液為含有5-10μg/mL雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基水溶液，所述雙抗為重量份數(shù)比為1:1的青霉素和鏈霉素的混合物，所述培養(yǎng)液為L-DMEM培養(yǎng)基水溶液。
進一步的改進，試劑盒還包括生長因子a、生長因子b、第一組織分解液、第二組織分解液、細(xì)胞消化液、洗滌液和凍存液，所述第一組織分解液為含1-3mg/mL膠原酶IV型的PBS緩沖液或基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述第二組織分解液為含1-3mg/mL膠原酶V型的PBS緩沖液或基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述細(xì)胞消化液為含0.25-0.5mg/mL胰酶和0.02-0.05mg/mL乙二胺四乙酸的PBS緩沖液，所述洗滌液為PBS緩沖液。
本發(fā)明的培養(yǎng)液、培養(yǎng)液添加劑、生長因子a、生長因子b組成的溶液成為全培養(yǎng)液，配置方法為：將生長因子a、生長因子b和培養(yǎng)基添加劑溶于培養(yǎng)液中配置成全培養(yǎng)液，其中，生長因子a、生長因子b和培養(yǎng)基添加劑的濃度分別為10ng/mL、10ng/mL和50mg/mL。
本發(fā)明所指的L-DMEM培養(yǎng)基水溶液中L-DMEM培養(yǎng)基的濃度為10-20mg/mL。
本發(fā)明進一步為培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞提供一種試劑盒，該試劑盒能夠培養(yǎng)大量的胰腺干細(xì)胞，并且培養(yǎng)過程中能夠保持胰腺干細(xì)胞的存活率和活性。
進一步的改進，所述凍存液主要由35-45％的L-DMEM培養(yǎng)基水溶液，40-60％的人血白蛋白水溶液和5-15％的DMSO組成。
進一步的改進，所述保存液中還含有15-30μg/mL的原花青素和10-15μg/mL的維生素C。
在保存液中加入原花青素和維生素C可以逆轉(zhuǎn)分離的胰腺干細(xì)胞對青霉素和鏈霉素的耐藥性，進而提高整個保存液的抗菌性能，保證胰腺干細(xì)胞的活性。
進一步的改進，所述保存液中還含有1-3μg/mL的羥乙基-β-環(huán)糊精和5-10μg/mL的氯化鈉。
在保存液中加入乙基-β-環(huán)糊精和氯化鈉的混合物，可以有效提高保存液的穩(wěn)定性，避免保存液產(chǎn)生沉淀、分層和變色等問題。
進一步的改進，所述培養(yǎng)液添加劑包括如下重量份數(shù)的成分：木犀草素1-3份、小檗堿0.5-1份和枸櫞酸鈉5-10份。
在培養(yǎng)基添加劑中添加木犀草素、小檗堿和枸櫞酸鈉可以有效提高配置培養(yǎng)液的防止細(xì)菌、真菌和病毒感染的能力。
進一步的改進，所述培養(yǎng)液添加劑還包括重量份數(shù)如下的成分：β-胡蘿卜素0.5-1份、氯化硒2-5份、白藜蘆醇1-3份、聚甲基丙烯酸甲酯2-3份、麥芽糖醇1.3-2.5份和的谷氨酰胺2-3份。
在培養(yǎng)液添加劑中加入以上成分，可以提高培養(yǎng)液培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的增殖效率和擴增倍數(shù)。
進一步的改進，所述凍存液內(nèi)含5-10μg/mL的聚丙烯葡聚糖、1-3μg/mL的月桂酰肌氨酸和0.2-0.5μg/mL的果膠。
在凍存液中加入上述成分可以使凍存性能更好好，胰腺干細(xì)胞復(fù)蘇后存活率高，而且更利于胰腺干細(xì)胞凍存前后細(xì)胞形態(tài)的維持和穩(wěn)定
進一步的改進，所述第一組織分解液和第二組織分解液內(nèi)均含有1-3mg/mL透明質(zhì)酸酶和0.3-0.5mg/mL透明質(zhì)酸。
在第一組織分解液和第二組織分解液內(nèi)加入透明質(zhì)酸酶和透明質(zhì)酸可顯著縮短組織分解時間，提高分解效率，可以分解時間降低到8min以內(nèi)。
進一步的改進，所述生長因子a為堿性成纖維細(xì)胞生長因子，所述生長因子b為表皮細(xì)胞生長因子。
通過對試劑盒結(jié)構(gòu)的改變，使得該試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，操作方便。
本發(fā)明另一方面還提供一種培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的方法，包括如下步驟：
(1)將離體的胰腺，放入盛裝有保存液的試劑瓶，4℃保存；
(2)將生長因子a、生長因子b和培養(yǎng)基添加劑溶于培養(yǎng)液中配置成全培養(yǎng)液，其中，生長因子a、生長因子b和培養(yǎng)基添加劑的濃度分別為10ng/mL、10ng/mL和50mg/mL，配好的全培養(yǎng)液放置在4℃的冰箱中保存；
(3)用75％的酒精清洗胰腺3遍，加入3倍含10％雙抗的洗滌液清洗3遍；
(4)用眼科鑷子分離出胰腺組織；
(5)用洗滌液反復(fù)清洗；
(6)將所述胰腺組織用眼科剪剪成1-2mm3大小的胰腺碎塊；
(7)將步驟(6)獲得的所述胰腺碎塊加入所述第一組織分解液和第二組織分解液中，水浴震蕩，每3-5min震蕩一次，持續(xù)20min，再加入步驟(2)配置的所述全培養(yǎng)液終止分解，過篩，離心；
(8)棄掉上層清液，得胰腺干細(xì)胞單細(xì)胞懸液，記為P0代胰腺干細(xì)胞，用步驟(2)配置的所述全培養(yǎng)液將P0代胰腺干細(xì)胞重懸，再按照1-2×106個/ml的密度接種在培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入37℃、5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)，每個三天換全培養(yǎng)液一次；
(9)將步驟(8)所得每三天更換全培養(yǎng)基一次，通過顯微鏡觀察到胰腺干細(xì)胞生長面積達(dá)到80％左右時，先用所述洗滌液清洗2次，然后加入所述細(xì)胞消化液，適當(dāng)震蕩搖晃培養(yǎng)瓶，使所述細(xì)胞消化液與細(xì)胞充分接觸，再放入培養(yǎng)箱中消化30-60s，最后加入步驟(2)配置的所述全培養(yǎng)基終止消化，所得胰腺干細(xì)胞記為P1代胰腺干細(xì)胞，取出一部分P1代胰腺干細(xì)胞放入所述凍存液中進行凍存，凍存密度為3-5×106個/ml凍存液，剩余P1代胰腺干細(xì)胞按照1：3比例進行傳代；
(10)重復(fù)步驟(9)，將胰腺干細(xì)胞進行多次的培養(yǎng)和傳代。
本發(fā)明提供的試劑盒為提供胰腺干細(xì)胞分離培養(yǎng)，擴增，傳代，凍存一體的試劑盒，該試劑盒可在維持多能性和表面性同時減少的批量差異，并且節(jié)約時間和精力，可以更快得獲得大量的胰腺干細(xì)胞，解決了胰腺干細(xì)胞分離數(shù)量少且純度低、培養(yǎng)存活率低、培養(yǎng)效率不高、凍存復(fù)活率不理想等問題，使胰腺干細(xì)胞在理想營養(yǎng)平衡狀態(tài)下進行多代擴增培養(yǎng)，為利用胰腺干細(xì)胞進行進一步實驗研究提供了豐富的來源。
具體實施方式
實施例1
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括保存液、培養(yǎng)液、培養(yǎng)液添加劑，所述保存液為含有5μg/mL雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基水溶液，所述雙抗為重量份數(shù)比為1:1的青霉素和鏈霉素的混合物，所述培養(yǎng)液為L-DMEM培養(yǎng)基水溶液。
實施例2
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括保存液、培養(yǎng)液、培養(yǎng)液添加劑、生長因子a、生長因子b、第一組織分解液、第二組織分解液、細(xì)胞消化液、洗滌液和凍存液，所述保存液為含有5μg/mL雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基水溶液，所述雙抗為重量份數(shù)比為1:1的青霉素和鏈霉素的混合物，所述培養(yǎng)液為L-DMEM培養(yǎng)基水溶液；所述生長因子a為堿性成纖維細(xì)胞生長因子，所述生長因子b為表皮細(xì)胞生長因子，所述第一組織分解液為含1mg/mL膠原酶IV型的PBS緩沖液或基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述第二組織分解液為含1mg/mL膠原酶V型的PBS緩沖液或基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述細(xì)胞消化液為含0.25mg/mL胰酶和0.02mg/mL乙二胺四乙酸的PBS緩沖液，所述洗滌液為PBS緩沖液，所述凍存液由40％的L-DMEM培養(yǎng)基水溶液、50％的人血白蛋白水溶液和10％的DMSO組成。
實施例3
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括保存液、培養(yǎng)液、培養(yǎng)液添加劑、生長因子a、生長因子b、第一組織分解液、第二組織分解液、細(xì)胞消化液、洗滌液和凍存液，所述保存液為含有10μg/mL雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基水溶液，所述雙抗為重量份數(shù)比為1:1的青霉素和鏈霉素的混合物，所述培養(yǎng)液為L-DMEM培養(yǎng)基水溶液；所述生長因子a為堿性成纖維細(xì)胞生長因子，所述生長因子b為表皮細(xì)胞生長因子，所述第一組織分解液為含3mg/mL膠原酶IV型的PBS緩沖液或基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述第二組織分解液為含3mg/mL膠原酶V型的PBS緩沖液或基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述細(xì)胞消化液為含0.5mg/mL胰酶和0.05mg/mL乙二胺四乙酸的PBS緩沖液，所述洗滌液為PBS緩沖液，所述凍存液由40％的L-DMEM培養(yǎng)基水溶液、50％的人血白蛋白水溶液和10％的DMS O組成。
實施例4
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例1不同的是：所述保存液中還含有30μg/mL的原花青素和15μg/mL的維生素C。
實施例5
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述保存液中還含有15μg/mL的原花青素和10μg/mL的維生素C。
實施例6
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例4不同的是：所述保存液中還含有3μg/mL的羥乙基-β-環(huán)糊精和10μg/mL的氯化鈉。
實施例7
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例5不同的是：所述保存液中還含有1μg/mL的羥乙基-β-環(huán)糊精和5μg/mL的氯化鈉。
實施例8
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例1不同的是：所述培養(yǎng)液添加劑包括如下重量份數(shù)的成分：木犀草素1份、小檗堿0.5份和枸櫞酸鈉5份。
實施例9
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例4不同的是：所述培養(yǎng)液添加劑包括如下重量份數(shù)的成分：木犀草素3份、小檗堿1份和枸櫞酸鈉10份。
實施例10
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例8不同的是：所述培養(yǎng)液添加劑還包括重量份數(shù)如下的成分：0.5份的β-胡蘿卜素、2份的氯化硒、1份的白藜蘆醇、2份的聚甲基丙烯酸甲酯、1.3份的麥芽糖醇和2份的谷氨酰胺。
實施例11
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例9不同的是：所述培養(yǎng)液添加劑還包括重量份數(shù)如下的成分：1份的β-胡蘿卜素、5份的氯化硒、3份的白藜蘆醇、3份的聚甲基丙烯酸甲酯、2.5份的麥芽糖醇和3份的谷氨酰胺。
實施例12
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述凍存液內(nèi)含5μg/mL的聚丙烯葡聚糖、1μg/mL的月桂酰肌氨酸和0.2μg/mL的果膠。
實施例13
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述凍存液內(nèi)含10μg/mL的聚丙烯葡聚糖、3μg/mL的月桂酰肌氨酸和0.5μg/mL的果膠。
實施例14
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述第一組織分解液和第二組織分解液內(nèi)均含有1mg/mL透明質(zhì)酸酶和0.5mg/mL透明質(zhì)酸。
實施例15
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括保存液、培養(yǎng)液、培養(yǎng)液添加劑、生長因子a、生長因子b、第一組織分解液、第二組織分解液、細(xì)胞消化液、洗滌液和凍存液，所述保存液為含有7.5μg/mL雙抗、20μg/mL原花青素、12μg/mL維生素C、2μg/mL羥乙基-β-環(huán)糊精和7.5μg/mL氯化鈉的L-DMEM培養(yǎng)基水溶液，所述雙抗為重量份數(shù)比為1:1的青霉素和鏈霉素的混合物，所述培養(yǎng)液為L-DMEM培養(yǎng)基水溶液；所述培養(yǎng)液添加劑包括如下重量份數(shù)的成分：木犀草素2份、小檗堿0.75份、枸櫞酸鈉6份、β-胡蘿卜素0.8份、氯化硒3份、白藜蘆醇2份、聚甲基丙烯酸甲酯2.5份、麥芽糖醇2份和谷氨酰胺2.5份；所述生長因子a為堿性成纖維細(xì)胞生長因子，所述生長因子b為表皮細(xì)胞生長因子，所述第一組織分解液為含2mg/mL膠原酶IV型、2mg/mL透明質(zhì)酸酶和0.4mg/mL透明質(zhì)酸的PBS緩沖液，所述第二組織分解液為含2mg/mL膠原酶V型、2mg/mL透明質(zhì)酸酶和0.4mg/mL透明質(zhì)酸的PBS緩沖液，所述細(xì)胞消化液為含0.25mg/mL胰酶和0.02mg/mL乙二胺四乙酸的PBS緩沖液，所述洗滌液為PBS緩沖液，所述凍存液由含7μg/mL聚丙烯葡聚糖、2μg/mL月桂酰肌氨酸和0.4μg/mL果膠且40％的L-DMEM培養(yǎng)基水溶液、50％的人血白蛋白水溶液和10％的DMSO組成。
對照例1
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述保存液中還含有30μg/mL的原花青素。
對照例2
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述保存液中還含有30μg/mL的原花青素和15μg/mL的維生素E。
對照例3
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例4不同的是：所述保存液中還含有3μg/mL的羥乙基-β-環(huán)糊精和10μg/mL的抗壞血酸鈉。
對照例4
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例1不同的是：所述培養(yǎng)液添加劑包括如下重量份數(shù)的成分：小檗堿0.5份和枸櫞酸鈉5份。
對照例5
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例1不同的是：所述培養(yǎng)液添加劑包括如下重量份數(shù)的成分：青霉素1份、小檗堿0.5份和枸櫞酸鈉5份。
對照例6
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例8不同的是：所述培養(yǎng)液添加劑還包括重量份數(shù)如下的成分：2份的氯化硒、1份的白藜蘆醇、1.3份的麥芽糖醇和2份的谷氨酰胺。
對照例7
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例8不同的是：所述培養(yǎng)液添加劑還包括重量份數(shù)如下的成分：0.5份的β-胡蘿卜素、2份的氯化鉀、1份的甘露醇、2份的聚甲基丙烯酸甲酯、1.3份的葡萄糖和2份的谷氨酰胺。
對照例8
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述凍存液內(nèi)含5μg/mL的聚丙烯葡聚糖和0.2μg/mL的果膠。
對照例9
一種用于培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述凍存液內(nèi)含5μg/mL的聚丙烯酸樹脂、1μg/mL的月桂酰肌氨酸和0.2μg/mL的果膠。
試劑盒中保存液抗菌性能評價
取實施例1、實施例4、實施例15、對照例1-2的試劑盒中的保存液，均在溫度40℃±2℃下，相對濕度為75％±5％的條件下放置24個月，在試驗期間1個月、3個月、6個月、12個月、24個月分別取樣一次，檢測保存液中細(xì)菌、真菌和病毒的感染情況，檢驗結(jié)果見表1。
表1保存液抗菌性能評價結(jié)果
其中：“-”表示“沒有”，“√”表示“有”。
比較實施例4、實施例15、對照例1-2的試劑盒中的保存液內(nèi)的細(xì)菌、真菌和病毒的感染狀況可知，在保存液中添加原花青素和維生素C可以有效提高保存液防止細(xì)菌、真菌和病毒感染的能力，減少其中一個成分，或變化其中一個成分，不但不會提高抗菌效果，還會導(dǎo)致保存液抗細(xì)菌、真菌和病毒感染的能力減弱。
試劑盒中保存液對胰腺干細(xì)胞存活率評價
將相同數(shù)量的胰腺干細(xì)胞分別放入實施例1、實施例4、對照例1、對照例2的試劑盒和CN 106047702的試劑盒的保存液中，在4℃下保存240小時，期間分別于第12h、24h、48h、96h、240h時觀察胰腺干細(xì)胞形態(tài)，并用臺盼蘭染色計數(shù)胰腺干細(xì)胞存活率，試驗結(jié)果見表2。
表2保存液對胰腺干細(xì)胞存活率的評價結(jié)果
其中：A表示細(xì)胞分散度好、大小均勻、形態(tài)不變、輪廓清晰；
B表示細(xì)胞體積變大、大小不等、輪廓模糊、出現(xiàn)橢圓或不規(guī)則等異常形態(tài)。
上述試驗結(jié)果表明，采用本發(fā)明提供的保存液保存胰腺干細(xì)胞的效果與對比試驗1-2的保存液和CN106047702的胰腺保存液相比，其保存的胰腺干細(xì)胞存活率明顯較高，且胰腺干細(xì)胞的形態(tài)也保持得更好，由此可知本發(fā)明提供的的保存液可以有效保持胰腺干細(xì)胞活性、提高胰腺干細(xì)胞存活率。
試劑盒中保存液穩(wěn)定性評價
取實施例1、實施例6、實施例15、對照例3的試劑盒，均在溫度40℃±2℃下，相對濕度為75％±5％的條件下放置24個月，在試驗期間1個月、3個月、6個月、12個月和24個月末分別取樣一次，檢測保存有胰腺干細(xì)胞的保存液的性狀和色澤，試驗結(jié)果見表3。
表3保存液穩(wěn)定性評價結(jié)果
其中：“-”表示沒有，“√”表示有。
比較實施例6與實施例15和對照例3的試劑盒內(nèi)的保存液的穩(wěn)定性狀況可知，在保存液中添加羥乙基-β-環(huán)糊精和氯化鈉可以有效提高保存液的穩(wěn)定性，避免保存液產(chǎn)生沉淀、分層和變色等問題，減少其中一個成分，或變化其中一個成分，不但不會提高穩(wěn)定性，還會使保存液的穩(wěn)定性減弱。
試劑盒中全培養(yǎng)液抗菌性能的評價
取實施例8、對照例4和對照例5的試劑盒，分別將其中的培養(yǎng)液、培養(yǎng)基添加劑、生長因子a和生長因子b配置成全培養(yǎng)液，將上述全培養(yǎng)液均在溫度-4℃±2℃下，相對濕度為60％±5％的條件下放置24個月后，檢測全培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)量，檢測結(jié)果見表4。
表4保存液抗菌性能評價結(jié)果
由上述試驗結(jié)果可知，在培養(yǎng)基添加劑中增加木犀草素、小檗堿和枸櫞酸鈉可以有效提高全培養(yǎng)基防止細(xì)菌的能力，減少其中一個成分，或變化其中一個成分，都會導(dǎo)致配置的全培養(yǎng)夜抗細(xì)菌能力減弱。
試劑盒對胰腺干細(xì)胞增殖能力的評價
取實施例8、實施例10、對照例6、對照例7和CN106047702的試劑盒，培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞，采用臺盼藍(lán)經(jīng)典染色法對細(xì)胞進行計數(shù)，分別統(tǒng)計原代、第3代、第6代和第9代活胰腺干細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果見表5。
表5胰腺干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴增效果評價
由上述結(jié)果可以得出，采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基添加劑配置的全培養(yǎng)液培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞的增殖速度明顯高于CN106047702的細(xì)胞培養(yǎng)液，也優(yōu)于采用對照例6和對照例7的培養(yǎng)基添加劑配置的全培養(yǎng)液。
試劑盒對胰腺干細(xì)胞凍存性能的評價
收集實施例10培養(yǎng)得到的P3代胰腺干細(xì)胞，將細(xì)胞重懸混勻后，進行細(xì)胞計數(shù)，將所需的細(xì)胞懸液分裝至離心管中離心去除上清液，收集細(xì)胞沉淀，分別加入1.5mL實施例2、實施例12、對照例8-9的凍存液和CN106047702的凍存液中，并控制細(xì)胞數(shù)量為1×106個/mL；迅速將凍存液轉(zhuǎn)移至已加好異丙醇的細(xì)胞程序降溫盒中，放入-80℃超低溫冰箱2～3天后，將凍存液轉(zhuǎn)移至液氮保存；一個月后進行細(xì)胞復(fù)蘇，將保存于液氮中的凍存液取出，轉(zhuǎn)移至37℃水浴鍋中迅速解凍，用移液管將細(xì)胞轉(zhuǎn)入之前預(yù)溫好的10mL按照本發(fā)明公開的方法配置的全培養(yǎng)液中，取0.5mL細(xì)胞懸液檢測細(xì)胞存活率和細(xì)胞形態(tài)變化情況，結(jié)果見表6。
表6試劑盒對胰腺干細(xì)胞凍存性能的影響
將實施例2、實施例12的試劑盒的凍存性能與對照例8、對照例9和CN104928238A的試劑盒的凍存性能相比，可以得出本發(fā)明提供的試劑盒的凍存性能相對更好，胰腺干細(xì)胞復(fù)蘇后存活率較高，而且更利于胰腺干細(xì)胞凍存前后細(xì)胞形態(tài)的維持和穩(wěn)定。
最后應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。