本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表皮細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
人表皮細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合中起至關(guān)重要的作用，尤其是嚴(yán)重?zé)齻∪吮砥ぜ?xì)胞的匱乏與其病程長(zhǎng)短、并發(fā)癥的發(fā)生、后期瘢痕的形成均有密切關(guān)系，因此應(yīng)用組織工程技術(shù)在體外進(jìn)行表皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與保存并應(yīng)用于臨床始終都是燒傷工作者的一個(gè)研究熱點(diǎn)。
傳統(tǒng)的表皮培養(yǎng)基不僅需要昂貴的添加因子，而且其培養(yǎng)的表皮細(xì)胞擴(kuò)增速度緩慢，在時(shí)間上不能滿足燒燙傷治療的需求，這個(gè)因素嚴(yán)重束縛了組織工程表皮用于急性皮膚創(chuàng)傷的治療的臨床應(yīng)用。
中國專利申請(qǐng)(CN105950542A)提供了一種人皮膚表皮細(xì)胞培養(yǎng)基及其應(yīng)用，本發(fā)明培養(yǎng)基將K-SFM及DMEM和F12培養(yǎng)基按照2:1:1混合，添加BPE、EGF、SCGF、FGF、TGF-β、VEGF、CaCl2、谷氨酰胺、雙抗。此本發(fā)明培養(yǎng)基不含血清，可用于人皮膚表皮細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)，但培養(yǎng)基成本昂貴。
因此，目前亟需一種能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞快速擴(kuò)增、成本低廉的表皮細(xì)胞培養(yǎng)基。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種表皮細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法，其具有快速促進(jìn)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)，成分簡(jiǎn)單，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種表皮細(xì)胞培養(yǎng)基，其主要由以下成分及其濃度組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基10-15g/L，胰島素10-30mg/L，谷氨酰胺1-10mg/L，飛燕草素10-100μg/L，桑色素1-10ng/L，兒茶素45-65μM，表皮生長(zhǎng)因子5-10μg/L，糖皮質(zhì)激素50-300μg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1-3μg/L，亞硒酸鈉1-10μg/L，檸檬酸鐵銨0.2-1.5mg/L，硝酸鐵0.3-0.8mg/L和EDTA-2Na 4-10mg/L。
優(yōu)選地，所述表皮細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基12g/L，胰島素14.5mg/L，谷氨酰胺7.5mg/L，飛燕草素34μg/L，桑色素5.25ng/L，兒茶素63.5μM，表皮生長(zhǎng)因子8.2μg/L，糖皮質(zhì)激素150μg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2.6μg/L，亞硒酸鈉6μg/L，檸檬酸鐵銨1.35mg/L，硝酸鐵0.45mg/L和EDTA-2Na 6.25mg/L。
優(yōu)選地，所述表皮細(xì)胞培養(yǎng)基中基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Ham’s F12或DMEM-L。
一種表皮細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，由分為以下步驟：
(1)稱取相應(yīng)重量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、飛燕草素、桑色素、兒茶素、亞硒酸鈉、檸檬酸鐵銨、硝酸鐵和EDTA-2Na，溶于35℃，800mL超純水中，攪拌至完全溶解，得溶液I；
(2)將上述所得溶液I冷卻至15-16℃，加入相應(yīng)量的胰島素、谷氨酰胺、表皮生長(zhǎng)因子、糖皮質(zhì)激素和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，加入200mL超純水輕微攪拌至均勻，得溶液II。
(3)用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)溶液II的pH至7.2，得溶液III。
(4)將溶液III用0.22μm濾膜正壓過濾除菌，即得。
本發(fā)明培養(yǎng)基成分及其濃度是經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)篩選得到的，是一種組分配比合理、科學(xué)、有效的表皮細(xì)胞培養(yǎng)基。飛燕草素(C15H11ClO7，CAS NO.528530)、桑色素(C15Hl0O7·2H2O，CAS NO.480-16-0)屬于生物類黃酮化合物，均具有很強(qiáng)的抗養(yǎng)化與抑菌作用，如桑色素對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌和傷寒桿菌有較強(qiáng)的抗菌作用。與此同時(shí)，飛燕草素對(duì)彈性蛋白酶和膠原蛋白酶具有抑制作用。兒茶素(C15H14O6，CAS NO.7295-85-4)又稱兒茶精，茶單寧，為黃烷醇的衍生物，分子式C15H14O6。兒茶素最初由兒茶中提取出，為無色結(jié)晶形固體，能溶于水；兒茶素是天然的油脂抗氧化劑，并且可以清除人體產(chǎn)生的自由基，以保護(hù)細(xì)胞膜，可以抑制引起人類皮膚病的病菌，并且對(duì)治療濕疹有很好的療效。本發(fā)明培養(yǎng)基中加入飛燕草素、桑色素和兒茶素，不僅能夠起到很好的抑菌效果，同時(shí)對(duì)表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)有極大地促進(jìn)作用。
胰島素可以促進(jìn)RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑制細(xì)胞凋亡，是重要的細(xì)胞存活因子。檸檬酸鐵銨，硝酸鐵和EDTA-2Na組合能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)鐵蛋白的作用，能夠促進(jìn)鐵的運(yùn)輸。表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和糖皮質(zhì)激素分別是重要的促生長(zhǎng)因子和激素，對(duì)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。
本發(fā)明培養(yǎng)基與傳統(tǒng)表皮細(xì)胞培養(yǎng)基相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
(1)本發(fā)明表皮細(xì)胞培養(yǎng)基能使表皮細(xì)胞快速增殖，并意外發(fā)現(xiàn)本發(fā)明培養(yǎng)基表皮細(xì)胞的凋亡速度減慢，因而本發(fā)明培養(yǎng)基對(duì)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)有極大地促進(jìn)作用。
(2)本發(fā)明培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單、成本低廉，適合用于表皮細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。
附圖說明
圖1不同培養(yǎng)基中表皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。培養(yǎng)基分別為實(shí)施例1-3及對(duì)比例1制備得到的培養(yǎng)基。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1一種表皮細(xì)胞培養(yǎng)基
一種表皮細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：Ham’s F1212g/L，胰島素14.5mg/L，谷氨酰胺7.5mg/L，飛燕草素34μg/L，桑色素5.25ng/L，兒茶素63.5μM，表皮生長(zhǎng)因子8.2μg/L，糖皮質(zhì)激素150μg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2.6μg/L，亞硒酸鈉6μg/L，檸檬酸鐵銨1.35mg/L，硝酸鐵0.45mg/L和EDTA-2Na 6.25mg/L。
制備方法：
(1)稱取相應(yīng)重量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、飛燕草素、桑色素、兒茶素、亞硒酸鈉、檸檬酸鐵銨、硝酸鐵和EDTA-2Na，溶于35℃，800mL超純水中，攪拌至完全溶解，得溶液I；
(2)將上述所得溶液I冷卻至15℃，加入相應(yīng)量的胰島素、谷氨酰胺、表皮生長(zhǎng)因子、糖皮質(zhì)激素和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，加入200mL超純水輕微攪拌至均勻，得溶液II。
(3)用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)溶液II的pH至7.2，得溶液III。
(4)將溶液III用0.22μm濾膜正壓過濾除菌，即得。
實(shí)施例2一種表皮細(xì)胞培養(yǎng)基
一種表皮細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：DMEM-L 15g/L，胰島素30mg/L，谷氨酰胺10mg/L，飛燕草素100μg/L，桑色素10ng/L，兒茶素65μM，表皮生長(zhǎng)因子10μg/L，糖皮質(zhì)激素300μg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3μg/L，亞硒酸鈉10μg/L，檸檬酸鐵銨1.5mg/L，硝酸鐵0.8mg/L，EDTA-2Na 10mg/L。
制備方法與實(shí)施例1類似。
實(shí)施例3一種表皮細(xì)胞培養(yǎng)基
一種表皮細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：DMEM-L培養(yǎng)基10g/L，胰島素10mg/L，谷氨酰胺1mg/L，飛燕草素10μg/L，桑色素1ng/L，兒茶素45μM，表皮生長(zhǎng)因子5μg/L，糖皮質(zhì)激素50μg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1μg/L，亞硒酸鈉1μg/L，檸檬酸鐵銨0.2mg/L，硝酸鐵0.3mg/L，EDTA-2Na 4mg/L。
制備方法與實(shí)施例1類似。
對(duì)比例1一種表皮細(xì)胞培養(yǎng)基
一種表皮細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：Ham’s F 12g/L，胰島素14.5mg/L，谷氨酰胺7.5mg/L，飛燕草素97.5μg/L，桑色素5.25ng/L，表皮生長(zhǎng)因子8.2μg/L，糖皮質(zhì)激素150μg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2.6μg/L，亞硒酸鈉6μg/L，檸檬酸鐵銨1.35mg/L，硝酸鐵0.45mg/L和EDTA-2Na 6.25mg/L。
制備方法與實(shí)施例1類似。
與實(shí)施例1區(qū)別在于，不含有兒茶素而飛燕草素濃度提升至97.5μg/L。
試驗(yàn)例1細(xì)胞生長(zhǎng)檢測(cè)
取外科包皮手術(shù)切下的正常健康人的包皮組織加入含500U/mL雙抗的MEM取樣培養(yǎng)基中，盡快返回細(xì)胞室。剪除脂肪組織，將皮片剪成2mm×5mm的狹長(zhǎng)條，再在100U/ml的雙抗D-hanks液中浸泡3次，每次3min。用0.2％的胰酶冷消化過夜，然后在平皿內(nèi)分離表皮和真皮，盡量將皮片剪碎，37℃熱消化30min，加等量MEM終止消化，過銅網(wǎng)離心棄上清，分別加入3mL實(shí)施例1-3及對(duì)比例1培養(yǎng)液，均勻接種在無菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
利用MTT法檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，如表1所示。
表1不同培養(yǎng)基中表皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀況
由表1可知，實(shí)施例培養(yǎng)基中表皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于對(duì)比例，實(shí)施例細(xì)胞培養(yǎng)基中表皮細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，能夠快速達(dá)到平頂期，凋亡速度減慢，因此本發(fā)明培養(yǎng)基對(duì)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)有極大地促進(jìn)作用。
各培養(yǎng)基中表皮細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)，如圖1所示。