本發(fā)明涉及分子生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體來說是一種體外維護(hù)人淋巴細(xì)胞基因組穩(wěn)定性葉酸濃度檢測方法。
背景技術(shù)：
：基因組攜帶著構(gòu)成和維持人類生命形式必需的所有生物信息，使人類在長期的進(jìn)化過程中不僅能夠正常進(jìn)行各項(xiàng)生命活動(dòng)，而且可將適應(yīng)環(huán)境的各種性狀穩(wěn)定地遺傳給后代，這些都以人類基因組的相對(duì)穩(wěn)定作為前提。隨著對(duì)表觀遺傳現(xiàn)象的深入研究和基因組信息知識(shí)的不斷拓展，人們發(fā)現(xiàn)除了基因突變、染色體畸變、非整倍體引起的基因劑量改變、及染色體斷裂-融合-橋(breakage-fusion-bridge,BFB)循環(huán)導(dǎo)致基因擴(kuò)增等造成基因組損傷外，DNA甲基化、基因組印跡等不涉及DNA序列改變的轉(zhuǎn)錄調(diào)控修飾現(xiàn)象亦會(huì)影響基因組的穩(wěn)定性。這些遺傳損傷和表觀遺傳現(xiàn)象往往是癌癥早期的關(guān)鍵事件，而基因組穩(wěn)定性的下降還可能與發(fā)育異常、糖尿病、心血管病、早老性癡呆和神經(jīng)退行性疾病等慢性疾病有關(guān)。引起基因組不穩(wěn)定的誘因，除接觸外源性物理(如輻射)和化學(xué)因素(如致癌物或誘變劑)能夠直接引起人類體細(xì)胞與生殖細(xì)胞基因組重大改變外，膳食中微量營養(yǎng)素(micronutrients)通過其攝入狀態(tài)、參與活化/解毒過程、DNA合成及修復(fù)、細(xì)胞凋亡及表觀遺傳修飾模式改變等多種途徑來影響基因組的穩(wěn)定性。對(duì)微量營養(yǎng)素的適當(dāng)補(bǔ)充，能夠保證機(jī)體正常生理功能的發(fā)揮，有助于克服維持DNA穩(wěn)定性關(guān)鍵途徑中遺傳性代謝障礙，同時(shí)影響DNA甲基化模式改變，減少基因組內(nèi)源性因素的損傷，降低腫瘤的易感性。一碳單位代謝是膳食中營養(yǎng)組分與遺傳物質(zhì)作用研究機(jī)制的重要切入點(diǎn)。葉酸(Folate)正是人體一碳代謝反應(yīng)必需的一組微量營養(yǎng)素，除穩(wěn)定性最高的氧化態(tài)葉酸(Folicacid，F(xiàn)A)外，各種還原態(tài)葉酸在機(jī)體一碳單位的代謝和甲基傳遞的過程發(fā)揮了不可或缺的作用。葉酸代謝主要涉及DNA合成、修復(fù)與DNA甲基化兩個(gè)重要的生化過程：前者主要包括尿嘧啶脫氧核苷酸(dUMP)到胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTMP)的合成，后者通過合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)影響DNA、蛋白質(zhì)等分子的甲基化。人體自身不能合成葉酸，必須通過飲食從外界攝入。倘若葉酸攝入不足會(huì)導(dǎo)致dTMP合成受阻，dUMP過量積累摻入DNA，影響繼后的DNA復(fù)制和修復(fù)過程，并誘發(fā)堿基錯(cuò)配、基因突變、DNA單雙鏈斷裂、染色體的斷裂等遺傳結(jié)構(gòu)損傷；同時(shí)引起機(jī)體絕大多數(shù)甲基化反應(yīng)的主要甲基供體-SAM的儲(chǔ)量變化，而使全基因組DNA甲基化程度和DNA特殊位點(diǎn)甲基化模式改變，導(dǎo)致基因表達(dá)方式改變、著絲粒異染色質(zhì)凝聚水平下降等遺傳毒性和表觀遺傳毒性事件發(fā)生。胞質(zhì)阻斷微核細(xì)胞組分析(CBMNCyt)為主要實(shí)驗(yàn)方法，除了可以評(píng)價(jià)染色體斷裂、DNA錯(cuò)配、染色體丟失、染色體不分離、細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡等各個(gè)指標(biāo)外，“細(xì)胞組”概念更意味著基于機(jī)體中單個(gè)細(xì)胞的水平來綜合評(píng)價(jià)這些細(xì)胞的生活狀態(tài)(包括細(xì)胞壞死和凋亡)，分裂狀況(包括單核、雙核及多核細(xì)胞的計(jì)數(shù))，以及細(xì)胞的染色體損傷或不穩(wěn)定的情況(以微核、核質(zhì)橋、核芽為主要標(biāo)志)，還可結(jié)合雙核細(xì)胞中細(xì)胞核與微核著絲粒探針信號(hào)分析。利用該方法探討在體外培養(yǎng)體系中，葉酸維持人體外周血淋巴細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的最適濃度。CBMN方法評(píng)價(jià)指標(biāo)包括遺傳毒性(微核、核質(zhì)橋及核芽)，細(xì)胞毒性(壞死與凋亡細(xì)胞率)，和細(xì)胞生長抑制(單核、雙核、多核細(xì)胞比例，NDI指數(shù))，遺傳毒性指標(biāo)為尋找維持離體培養(yǎng)人類淋巴細(xì)胞基因組穩(wěn)定的最佳葉酸濃度提供依據(jù)，該方法利用人體的外周血分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，得到的數(shù)據(jù)比傳統(tǒng)的動(dòng)物模型試驗(yàn)更貼近人類活體狀況，為進(jìn)行個(gè)體營養(yǎng)干預(yù)，從而有針對(duì)地提高個(gè)體基因組穩(wěn)定性，減少相關(guān)疾病的發(fā)生有積極意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的旨在設(shè)計(jì)一種方法能有效的檢測在體外培養(yǎng)的條件下，維護(hù)人淋巴細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的葉酸最適濃度，進(jìn)而為后續(xù)的營養(yǎng)干預(yù)，以及有效維護(hù)個(gè)體基因組穩(wěn)定性提供重要的科學(xué)依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種體外維護(hù)人淋巴細(xì)胞基因組穩(wěn)定性葉酸濃度檢測方法，步驟包括：(1)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基：根據(jù)人體血液中葉酸含量，設(shè)置30nM、60nM、120nM、240nM的葉酸濃度并配置成10ml，培養(yǎng)基其他成分及濃度與RPMI-1640培養(yǎng)基一致；(2)淋巴細(xì)胞分離：①靜脈取血5ml于干凈無菌有肝素的試管中，加入等體積的HBSS液混合均勻；②再另取兩只離心管分別加入2ml淋巴細(xì)胞分離液，將5ml稀釋血樣加入鋪在淋巴細(xì)胞分離液表面，使血液與淋巴細(xì)胞分離液形成明顯的分離界面，蓋緊離心管蓋；③2000r/min，離心30min后將細(xì)胞液吸出，將同一樣本淋巴細(xì)胞移入另一離心管中；室溫下加入細(xì)胞液體積3倍的HBSS混勻，1000r/min，離心10min，棄上清后加入細(xì)胞液體積2倍的HBSS混勻，1000r/min，離心10min，棄上清后加入細(xì)胞液體積2倍的HBSS混勻，1000r/min，離心10min，去上清后加入沒有葉酸的培養(yǎng)基0.2ml；④取10ul的細(xì)胞液加至EP管中，再取10ul的體積濃度為0.4％苔酚蘭加至EP管中，充分混合，放置2min，取20ul的混合液滴加到細(xì)胞記數(shù)板與蓋片的縫隙間，讓細(xì)胞液自動(dòng)進(jìn)入記數(shù)板內(nèi)，在顯微鏡下直接進(jìn)行記數(shù)，4個(gè)大方格的活細(xì)胞數(shù)A，細(xì)胞總算＝A/4×稀釋倍數(shù)×104×離心管中細(xì)胞懸浮液的體積；(3)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：①計(jì)算并培養(yǎng)：將分離的淋巴細(xì)胞分到不同的培養(yǎng)體系中，使細(xì)胞終濃度保持在0.5-1×106個(gè)/ml，加入設(shè)置的特殊培養(yǎng)基800-1000ul，向培養(yǎng)基中加入終濃度為30ug/ml的PHA，將淋巴細(xì)胞放在37℃下培養(yǎng)；②計(jì)數(shù)并換培養(yǎng)基：將培養(yǎng)離心管中的細(xì)胞液混勻，吸取10ul細(xì)胞混合液按上述計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)，計(jì)算后按1000rpm/min，離心10min去上清，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果按照0.5×106個(gè)/ml的比例加入新鮮培養(yǎng)液，但不加PHA，繼續(xù)培養(yǎng)；③CB培養(yǎng)：取濃度為600ug/ml的CB儲(chǔ)備液100ul，加入900ul無葉酸培養(yǎng)基，并將CB加入培養(yǎng)物中使其CB濃度為4.5ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)28h后收集細(xì)胞；(4)細(xì)胞收集及制片：用含DMSO為7％的培養(yǎng)基處理細(xì)胞10min后，每個(gè)離心孔加入80ul混合細(xì)胞液，800rpm，5min的條件下TXD3細(xì)胞涂片離心機(jī)涂片，涂片后的載玻片在室溫條件下干燥10min，將片子放入新配置的甲醇：冰醋酸為3:1的固定液中，固定10min后空氣干燥，將干燥的片子在Giemmsa染液中染色5min后空氣干燥，干燥的片子在二甲苯中透明處理5min，干燥后用中性樹膠封片；(5)片子分析：在光學(xué)顯微鏡×1000鏡頭下，計(jì)數(shù)CBMN各項(xiàng)指標(biāo)，每例樣本的各葉酸受試濃度組分析2000-3000個(gè)雙核細(xì)胞，設(shè)相應(yīng)對(duì)照；(6)統(tǒng)計(jì)方法：葉酸對(duì)基因組穩(wěn)定性影響用SPSS15.0軟件的ANOVA進(jìn)行分析，結(jié)果為體外維護(hù)人體淋巴細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的濃度是120nmol/L。本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明利用體外培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞，設(shè)置不同的葉酸濃度，以CBMNCyt檢測體外維護(hù)人淋巴細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的最適濃度，測得的體外維護(hù)人體淋巴細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的最適濃度是120nmol/L，所得結(jié)果更貼近活體，為個(gè)體的營養(yǎng)干預(yù)，以及有效維護(hù)個(gè)體基因組穩(wěn)定性提供重要依據(jù)。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例一種體外維護(hù)人淋巴細(xì)胞基因組穩(wěn)定性葉酸濃度檢測方法，步驟包括：(1)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基：根據(jù)人體血液中葉酸含量，設(shè)置30nM、60nM、120nM、240nM的葉酸濃度并配置成10ml，培養(yǎng)基其他成分及濃度與RPMI-1640培養(yǎng)基(表1)一致；表1不含葉酸的RPMI-1640培養(yǎng)基配制配制體積100(ml)RPMI1640培養(yǎng)液(無葉酸)90透析小牛血清(ml)8L-谷氨酰胺儲(chǔ)備液(200mM)使用終濃度：0.3mg/ml1雙抗儲(chǔ)備液(100000U/ml)使用終濃度：100U/ml0.1IL-2儲(chǔ)備液(10000U/ml)使用終濃度：10U/ml0.1(2)淋巴細(xì)胞分離：①靜脈取血5ml于干凈無菌有肝素的試管中，加入等體積的HBSS液混合均勻；②再另取兩只離心管分別加入2ml淋巴細(xì)胞分離液，將5ml稀釋血樣加入鋪在淋巴細(xì)胞分離液表面，使血液與淋巴細(xì)胞分離液形成明顯的分離界面，蓋緊離心管蓋；③2000r/min，離心30min后將細(xì)胞液吸出，將同一樣本淋巴細(xì)胞移入另一離心管中；室溫下加入細(xì)胞液體積3倍的HBSS混勻，1000r/min，離心10min，棄上清后加入細(xì)胞液體積2倍的HBSS混勻，1000r/min，離心10min，棄上清后加入細(xì)胞液體積2倍的HBSS混勻，1000r/min，離心10min，去上清后加入沒有葉酸的培養(yǎng)基0.2ml；④取10ul的細(xì)胞液加至EP管中，再取10ul的體積濃度為0.4％苔酚蘭加至EP管中，充分混合，放置2min，取20ul的混合液滴加到細(xì)胞記數(shù)板與蓋片的縫隙間，讓細(xì)胞液自動(dòng)進(jìn)入記數(shù)板內(nèi)，在顯微鏡下直接進(jìn)行記數(shù)，4個(gè)大方格的活細(xì)胞數(shù)A，細(xì)胞總算＝A/4×稀釋倍數(shù)×104×離心管中細(xì)胞懸浮液的體積；(3)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：①計(jì)算并培養(yǎng)：將分離的淋巴細(xì)胞分到不同的培養(yǎng)體系中，使細(xì)胞終濃度保持在0.5-1×106個(gè)/ml，加入設(shè)置的特殊培養(yǎng)基800-1000ul，向培養(yǎng)基中加入終濃度為30ug/ml的PHA，將淋巴細(xì)胞放在37℃下培養(yǎng)；②計(jì)數(shù)并換培養(yǎng)基：將培養(yǎng)離心管中的細(xì)胞液混勻，吸取10ul細(xì)胞混合液按上述計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)，計(jì)算后按1000rpm/min，離心10min去上清，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果按照0.5×106個(gè)/ml的比例加入新鮮培養(yǎng)液，但不加PHA，繼續(xù)培養(yǎng)；③CB培養(yǎng)：取濃度為600ug/ml的CB儲(chǔ)備液100ul，加入900ul無葉酸培養(yǎng)基，并將CB加入培養(yǎng)物中使其CB濃度為4.5ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)28h后收集細(xì)胞；(4)細(xì)胞收集及制片：用含DMSO為7％的培養(yǎng)基處理細(xì)胞10min后，每個(gè)離心孔加入80ul混合細(xì)胞液，800rpm，5min的條件下TXD3細(xì)胞涂片離心機(jī)涂片，涂片后的載玻片在室溫條件下干燥10min，將片子放入新配置的甲醇：冰醋酸為3:1的固定液中，固定10min后空氣干燥，將干燥的片子在Giemmsa染液中染色5min后空氣干燥，干燥的片子在二甲苯中透明處理5min，干燥后用中性樹膠封片；(5)片子的分析：在光學(xué)顯微鏡×1000鏡頭下，計(jì)數(shù)CBMN各項(xiàng)指標(biāo)，每例樣本的各葉酸受試濃度組分析2000-3000個(gè)雙核細(xì)胞，設(shè)相應(yīng)對(duì)照；(6)統(tǒng)計(jì)方法：葉酸對(duì)基因組穩(wěn)定性影響用SPSS15.0軟件的ANOVA進(jìn)行分析，結(jié)果為體外維護(hù)人體淋巴細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的濃度是120nmol/L。本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會(huì)用理想化或過于正式的含義來解釋。最后所應(yīng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁1 2 3