本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種山羊TLR4基因敲除載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

Toll樣受體(TLRs)是天然免疫系統(tǒng)中的一種重要模式識(shí)別受體，可選擇性識(shí)別病原微生物而啟動(dòng)天然免疫,在宿主天然免疫和獲得性免疫中具有重要作用。TLR4是TLRs家族的重要成員之一，是內(nèi)毒素脂多糖(LPS)最重要的模式識(shí)別受體，在介導(dǎo)陰性菌及其LPS的宿主反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細(xì)菌在噬菌體長(zhǎng)期的選擇壓力下進(jìn)化出來(lái)的一種有效抵御外源DNA入侵的免疫機(jī)制之一。在菌體內(nèi)，CRISPR簇在其前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下轉(zhuǎn)錄成precrRNA，并在tracrRNA和Cas9參與下加工成成熟的crRNA，引導(dǎo)crRNA/tracrRNA/Cas9復(fù)合體識(shí)別結(jié)合外源DNA特定序列，剪切DNA雙鏈，從而沉默外源基因的表達(dá)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)成了一種新型的基因打靶系統(tǒng)。相對(duì)于較早的RNAi、ZFN和TALEN系統(tǒng)，這種新型打靶系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高、可同時(shí)沉默任意數(shù)量基因等優(yōu)點(diǎn)。目前，該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于細(xì)菌、斑馬魚(yú)、小鼠、大鼠、家蠶以及哺乳動(dòng)物和人類(lèi)細(xì)胞系等，且都表現(xiàn)出較強(qiáng)的基因組編輯活性。Hu等(2014)應(yīng)用該技術(shù)對(duì)山羊成纖維細(xì)胞中NUP155基因進(jìn)行了敲除，發(fā)現(xiàn)23個(gè)單細(xì)胞克隆中有5個(gè)發(fā)生了NUP155基因突變。Wang等(2015)采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)山羊MSTN和FGF5基因進(jìn)行了敲除。以上研究提示該技術(shù)可以成功用于山羊基因敲除。

目前采用ZFNs或TALENs進(jìn)行基因敲除，對(duì)每個(gè)基因位點(diǎn)編輯都需要設(shè)計(jì)和組裝兩個(gè)核酸酶,構(gòu)建技術(shù)難度較大、構(gòu)建組裝時(shí)間較長(zhǎng)。另外，傳統(tǒng)基因敲除，主要是應(yīng)用基因重組原理通過(guò)插入突變和靶向技術(shù)使目的基因功能喪失。

然而，目前在山羊上關(guān)于TLR4基因敲除及相關(guān)功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種山羊TLR4基因敲除載體及其構(gòu)建方法，旨在解決目前采用ZFNs或TALENs進(jìn)行基因敲除，對(duì)每個(gè)基因位點(diǎn)編輯都需要設(shè)計(jì)和組裝兩個(gè)核酸酶,因而構(gòu)建技術(shù)難度較大、構(gòu)建組裝時(shí)間較長(zhǎng)；而且傳統(tǒng)基因敲除，主要是應(yīng)用基因重組原理通過(guò)插入突變和靶向技術(shù)使目的基因功能喪失的問(wèn)題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種山羊TLR4基因敲除載體，該山羊TLR4基因敲除載體的sgRNA核苷酸序列為：

TLR4-gRNA-Lg1：GACTCATATTCAGCACCTGAAGG；

TLR4-gRNA-Rg1：TCACAACAAACTCTTGTCATTGG。

一種引物Oligo，該引物Oligo序列為：

F-TLR4-gRNA-L1：CACCGACTCATATTCAGCACCTGA；

R-TLR4-gRNA-L1：AAACTCAGGTGCTGAATATGAGTC；

F-TLR4-gRNA-R1：CACCGTCACAACAAACTCTTGTCAT；

R-TLR4-gRNA-R1：AAACATGACAAGAGTTTGTTGTGAC。

一種表達(dá)sgRNA核苷酸的質(zhì)粒PYSY-sgRNA，該質(zhì)粒PYSY-sgRNA為：pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-L2-SV40-Neo質(zhì)粒和pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-R2-EF1a-eGFP質(zhì)粒。

本發(fā)明另一目的在于提供一種山羊TLR4基因敲除載體的構(gòu)建方法，該山羊TLR4基因敲除載體的構(gòu)建方法包括：

采用CRISPR/cas9系統(tǒng)，首先設(shè)計(jì)TLR4基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列；

構(gòu)建同時(shí)表達(dá)sgRNA和Cas9D10A的質(zhì)粒PYSY-sgRNA，連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；

最后對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。

進(jìn)一步，該山羊TLR4基因敲除載體的構(gòu)建方法具體包括：

引物退火：將1ul 100uM的F-Oligo、1ul的100uM R-Oligo、8ul YSY oligo退火緩沖液混合于PCR管內(nèi)，在PCR儀中以每分鐘1.5℃逐漸從95℃降至22℃；

連接：0.5ul退火產(chǎn)物，1ul YSY線性化三合一CRISPR/Cas9n質(zhì)粒，1ul T4連接酶，2ul 5*T4Buffer，5.5ul Milli Q；

轉(zhuǎn)化：室溫15min后用pfu≥10⁸的大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化；

轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證：轉(zhuǎn)化涂板后挑取單克隆進(jìn)行10ul體系菌液PCR驗(yàn)證；

經(jīng)PCR初步鑒定后進(jìn)行測(cè)序；

菌液37℃過(guò)夜培養(yǎng)，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，并采用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度。

進(jìn)一步，所述轉(zhuǎn)化涂板后挑取單克隆進(jìn)行10ul體系菌液PCR驗(yàn)證，具體包括：挑取單克隆0.5ul菌液，0.5ul YSY驗(yàn)證正向引物，0.5ul R-Oligo，5ulMastermix，3.5ul MilliQ；PCR反應(yīng)條件為：1)：95℃預(yù)變性2mim；2)：94℃變性30s；3)：56℃退火30s；4)：72℃延伸30s；步驟2)到步驟4)運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；5)：72℃再延伸10min；6)：4℃保存。

本發(fā)明提供的山羊TLR4基因敲除載體及其構(gòu)建方法中CRISPR/Cas9系統(tǒng)，是新開(kāi)發(fā)的一種新型的基因打靶系統(tǒng)，利用細(xì)菌或古生菌中存在的的CRISPR簇，在其前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下轉(zhuǎn)錄成precrRNA，并在tracrRNA和Cas9參與下加工成成熟的crRNA，cRNA和tracrRNA二者結(jié)合形成的復(fù)合物成為，sgRNA與Cas9核酸內(nèi)切酶結(jié)合,并引導(dǎo)其識(shí)別結(jié)合外源DNA特定序列，剪切DNA雙鏈，從而沉默外源基因的表達(dá)。

本發(fā)明采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建TLR4基因敲除載體，方法簡(jiǎn)單快捷，只需針對(duì)該基因敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)一個(gè)長(zhǎng)約20bp左右的sgRNA，然后連接通用的Cas9基因即可，而采用ZFNs或TALENs進(jìn)行基因敲除，對(duì)每個(gè)基因位點(diǎn)編輯都需要設(shè)計(jì)和組裝兩個(gè)核酸酶,構(gòu)建技術(shù)難度較大、構(gòu)建組裝時(shí)間較長(zhǎng)。因此，與傳統(tǒng)的ZFNs、TALENs等基因敲除技術(shù)比較而言，采用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因敲除載體更為簡(jiǎn)單快捷，便于進(jìn)一步推廣和應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

另外，傳統(tǒng)基因敲除，主要是應(yīng)用基因重組原理通過(guò)插入突變和靶向技術(shù)使目的基因功能喪失，與ZFN和TALEN這兩種人工核酸酶相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的Cas9作為切口酶，具有單鏈切割活性，可以在特定位置制造單鏈切口，這樣基本不會(huì)引起非同源末端連接，從而高效地介導(dǎo)外源基因的定點(diǎn)敲入，或?qū)蚪M進(jìn)行點(diǎn)突變，大大降低了非同源末端連接所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明構(gòu)建的載體，利用RNA導(dǎo)向的CRISPR-Cas9系統(tǒng)形成雙切口，在未影響靶向切割效率的前提下大大降低了脫靶效應(yīng)，提高基因敲除效率。

本發(fā)明采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建TLR4敲除載體，為后續(xù)獲得山羊TLR4基因缺失型肺泡上皮細(xì)胞系、研究山羊肺炎支原體感染的免疫應(yīng)答分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的山羊TLR4基因敲除載體的構(gòu)建方法流程圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的PCR驗(yàn)證克隆電泳圖片示例一；

圖中：Marker：Trans 2K Plus DNA Marker，從下到上依次為100bp,250bp,500bo,750bp,1000bp,3000bp,5000bp；2:陰性對(duì)照；3-6:TLR4-gRNA-Rg1克隆。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的PCR驗(yàn)證克隆電泳圖片示例二；

圖中：Marker：Trans 2K Plus DNA Marker，從下到上依次為100bp,250bp,500bo,750bp,1000bp,3000bp,5000bp；2:陰性對(duì)照；3-6:TLR4-gRNA-Lg1克隆。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

本發(fā)明實(shí)施例提供的山羊TLR4基因敲除載體，該山羊TLR4基因敲除載體的sgRNA核苷酸序列為：

SEQ ID NO1：TLR4-gRNA-Lg1：GACTCATATTCAGCACCTGAAGG；

SEQ ID NO2：TLR4-gRNA-Rg1：TCACAACAAACTCTTGTCATTGG。

一種引物Oligo，該引物Oligo序列為：

SEQ ID NO3：F-TLR4-gRNA-L1：CACCGACTCATATTCAGCACCTGA；

SEQ ID NO4：R-TLR4-gRNA-L1：AAACTCAGGTGCTGAATATGAGTC；

SEQ ID NO5：F-TLR4-gRNA-R1：CACCGTCACAACAAACTCTTGTCAT；

SEQ ID NO6：R-TLR4-gRNA-R1：AAACATGACAAGAGTTTGTTGTGAC。

本發(fā)明提供的一種表達(dá)sgRNA核苷酸的質(zhì)粒PYSY-sgRNA，該質(zhì)粒PYSY-sgRNA為：pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-L2-SV40-Neo質(zhì)粒和pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-R2-EF1a-eGFP質(zhì)粒。

如圖1所示：本發(fā)明實(shí)施例提供的山羊TLR4基因敲除載體的構(gòu)建方法，該山羊TLR4基因敲除載體的構(gòu)建方法包括：

S101：采用CRISPR/cas9系統(tǒng)，首先設(shè)計(jì)TLR4基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列；

S102：構(gòu)建同時(shí)表達(dá)sgRNA和Cas9D10A的質(zhì)粒PYSY-sgRNA，連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；

S103：最后對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證。

進(jìn)一步，該山羊TLR4基因敲除載體的構(gòu)建方法具體包括：

引物退火：將1ul 100uM的F-Oligo、1ul的100uM R-Oligo、8ul YSY oligo退火緩沖液混合于PCR管內(nèi)，在PCR儀中以每分鐘1.5℃逐漸從95℃降至22℃；

連接：0.5ul退火產(chǎn)物，1ul YSY線性化三合一CRISPR/Cas9n質(zhì)粒，1ul T4連接酶，2ul 5*T4Buffer，5.5ul Milli Q；

轉(zhuǎn)化：室溫15min后用pfu≥10⁸的大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化；

轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證：轉(zhuǎn)化涂板后挑取單克隆進(jìn)行10ul體系菌液PCR驗(yàn)證：0.5ul菌液，0.5ul YSY驗(yàn)證正向引物，0.5ul R-Oligo，5ul Mastermix，3.5ul MilliQ；

PCR反應(yīng)條件為：

1)：95℃預(yù)變性2mim；

2)：94℃變性30s；

3)：56℃退火30s；

4)：72℃延伸30s；步驟2)到步驟4)運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；

5)：72℃再延伸10min；

6)：4℃保存；

經(jīng)PCR初步鑒定后進(jìn)行測(cè)序；

菌液37℃過(guò)夜培養(yǎng)，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，并采用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度。

下面結(jié)合試驗(yàn)方法對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述

1材料和方法

1.1材料

Trans2K Plus DNA Marker購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司，CRISPR/Cas9n質(zhì)粒購(gòu)自南京堯舜禹公司，大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞、T4連接酶、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒均購(gòu)自天根生化有限公司。陽(yáng)離子脂質(zhì)體2000(Invitrogen)。PCR引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1sgRNA靶點(diǎn)確定和引物設(shè)計(jì)

根據(jù)山羊TLR4基因(GenBank:HQ263215.1)，找到CDS序列并分析其結(jié)構(gòu)，根據(jù)該基因結(jié)構(gòu)確定敲除位點(diǎn)，選擇外顯子序列輸入到軟件中，得到gRNA序列。并根據(jù)設(shè)計(jì)生成的sgRNA，設(shè)計(jì)并合成對(duì)應(yīng)的引物Oligo如下：

F-TLR4-gRNA-L1：CACCGACTCATATTCAGCACCTGA；

R-TLR4-gRNA-L1：AAACTCAGGTGCTGAATATGAGTC；

F-TLR4-gRNA-R1：CACCGTCACAACAAACTCTTGTCAT；

R-TLR4-gRNA-R1：AAACATGACAAGAGTTTGTTGTGAC；

1.2.2CRISPR/Cas9基因敲除載體的構(gòu)建

引物退火：1ul F-Oligo(100uM)，1ul R-Oligo(100uM)，8ul YSY oligo退火緩沖液，以上溶液混合于PCR管內(nèi)，在PCR儀中以每分鐘1.5℃逐漸從95℃降至22℃。

連接：0.5ul退火產(chǎn)物，1ul YSY線性化三合一CRISPR/Cas9n質(zhì)粒，1ul T4連接酶，2ul 5*T4Buffer，5.5ul Milli Q。

轉(zhuǎn)化：室溫15min后用大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(pfu≥10⁸)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證：轉(zhuǎn)化涂板后挑取單克隆進(jìn)行10ul體系菌液PCR驗(yàn)證。

0.5ul菌液，0.5ul YSY驗(yàn)證正向引物，0.5ul R-Oligo，5ul Mastermix，3.5ulMilliQ；

PCR反應(yīng)條件：Seg1：95℃預(yù)變性2mim；Seg2：94℃變性30s；Seg3：56℃退火30s；Seg4：72℃延伸30s；Seg2to Seg4運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；Seg5：72℃再延伸10min；Seg6：4℃保存。

經(jīng)PCR初步鑒定為陽(yáng)性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

菌液37℃過(guò)夜培養(yǎng)，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，并采用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度。

2.結(jié)果

2.1sgRNA設(shè)計(jì)

在U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下設(shè)計(jì)的sgRNA轉(zhuǎn)錄本RNA序列分別為：

TLR4-gRNA-Lg1：GACTCATATTCAGCACCTGAAGG；

TLR4-gRNA-Rg1：TCACAACAAACTCTTGTCATTGG；

2.2PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆電泳圖片如圖2、3所示。

2.3送檢測(cè)序結(jié)果

將之前驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆菌液送至金斯瑞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序部分序列比對(duì)結(jié)果具體如下：

2.3.1pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-L2-SV40-Neo；

通過(guò)對(duì)比，其同源性達(dá)到100％。

2.3.2pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-R2-EF1a-Egfp；

其同源性達(dá)到100％。因此，通過(guò)以上序列比對(duì)，可確定目標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4山羊TLR4MC1R基因的敲除質(zhì)粒對(duì)提取及濃度測(cè)定：

pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-L2-SV40-Neo質(zhì)粒：4ug濃度:130ng/ul；

pYSY-CMV-Cas9n-U6-TLR4-gRNA-R2-EF1a-eGFP質(zhì)粒：4ug濃度:209ng/ul。

下面結(jié)合原理分析對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)，是新開(kāi)發(fā)的一種新型的基因打靶系統(tǒng)，利用細(xì)菌或古生菌中存在的的CRISPR簇，在其前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下轉(zhuǎn)錄成precrRNA，并在tracrRNA和Cas9參與下加工成成熟的crRNA，cRNA和tracrRNA二者結(jié)合形成的復(fù)合物成為，sgRNA與Cas9核酸內(nèi)切酶結(jié)合,并引導(dǎo)其識(shí)別結(jié)合外源DNA特定序列，剪切DNA雙鏈，從而沉默外源基因的表達(dá)。

本發(fā)明采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建TLR4基因敲除載體，方法簡(jiǎn)單快捷，只需針對(duì)該基因敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)一個(gè)長(zhǎng)約20bp左右的sgRNA，然后連接通用的Cas9基因即可，而采用ZFNs或TALENs進(jìn)行基因敲除，對(duì)每個(gè)基因位點(diǎn)編輯都需要設(shè)計(jì)和組裝兩個(gè)核酸酶,構(gòu)建技術(shù)難度較大、構(gòu)建組裝時(shí)間較長(zhǎng)。因此，與傳統(tǒng)的ZFNs、TALENs等基因敲除技術(shù)比較而言，采用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因敲除載體更為簡(jiǎn)單快捷，便于進(jìn)一步推廣和應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

另外，傳統(tǒng)基因敲除，主要是應(yīng)用基因重組原理通過(guò)插入突變和靶向技術(shù)使目的基因功能喪失，與ZFN和TALEN這兩種人工核酸酶相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的Cas9作為切口酶，具有單鏈切割活性，可以在特定位置制造單鏈切口，這樣基本不會(huì)引起非同源末端連接，從而高效地介導(dǎo)外源基因的定點(diǎn)敲入，或?qū)蚪M進(jìn)行點(diǎn)突變，大大降低了非同源末端連接所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明構(gòu)建的載體，利用RNA導(dǎo)向的CRISPR-Cas9系統(tǒng)形成雙切口，在未影響靶向切割效率的前提下大大降低了脫靶效應(yīng)，提高基因敲除效率。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110> 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120> 一種山羊TLR4基因敲除載體的構(gòu)建方法

<160> 6

<210> 1

<211>23

<212> RNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

GACTCATATTCAGCACCTGAAGG

<210> 2

<211>23

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

TCACAACAAACTCTTGTCATTGG

<210> 3

<211>24

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

CACCGACTCATATTCAGCACCTGA

<210> 4

<211>24

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

AAACTCAGGTGCTGAATATGAGTC

<210> 5

<211>24

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

CACCGTCACAACAAACTCTTGTCAT

<210> 6

<211>24

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

AAACATGACAAGAGTTTGTTGTGAC