本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及用于一種嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor,car)和所述嵌合抗原受體修飾的樹突狀細(xì)胞(car-dc)，及其制備方法，以及所述樹突狀細(xì)胞在制備用于治療腦膠質(zhì)瘤的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

樹突狀細(xì)胞是一類與粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞形態(tài)和功都不同的白細(xì)胞，其細(xì)胞膜向外伸出，形成與神經(jīng)細(xì)胞軸突相似的膜性樹狀突起，命名為樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，dc)。它是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，能夠高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原，dc通過表面的mhc分子與其捕獲加工的腫瘤抗原結(jié)合，形成肽-mhc分子復(fù)合物，并遞呈給t細(xì)胞，從而啟動(dòng)mhc-i類限制性ctl反應(yīng)和mhc-ⅱ類限制性的cd4+thl反應(yīng)。同時(shí)，dc還通過其高表達(dá)的共刺激分子(cd80/b7-1、cd86/b7-2、cd40等)提供t細(xì)胞活化所必須的第二信號(hào)，啟動(dòng)了免疫應(yīng)答(stumblespa.regulationofthelpercelldifferentiationbyrespiratorytractdendriticcells.immunologyandcellbiology(1999)77,428–433)。

目前dc細(xì)胞治療采用的是腫瘤患者自身的單個(gè)核細(xì)胞在體外增殖、培養(yǎng)、誘導(dǎo)生成dc，然后讓dc負(fù)載相應(yīng)的腫瘤抗原，經(jīng)嚴(yán)格篩選后制備成負(fù)載腫瘤抗原的dc，然后將這些dc細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，激活人體內(nèi)的天然抗腫瘤系統(tǒng)，dc在這一過程中將腫瘤細(xì)胞的信息傳遞給免疫系統(tǒng)，并引導(dǎo)人體自身抗癌免疫系統(tǒng)去識(shí)別、清除腫瘤細(xì)胞(turnisme,rooneycm.enhancementofdendriticcellsasvaccinesforcancer.immunotherapy2010；2(6):847–62)。多年臨床研究對(duì)比得出，dc細(xì)胞治療廣泛適用臨床各型腫瘤治療，尤其對(duì)惡性黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、各種肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等治療效果較好(constantinoj,gomesc,falcaoa,cruzmt,nevesbm.antitumordendriticcell-basedvaccines:lessonsfrom20yearsofclinicaltrialsandfutureperspectives.translres2016；168:74–95)。但是，單純靠體外活化dc、負(fù)載腫瘤抗原取得的療效是有限的，因此在dc細(xì)胞免疫治療腫瘤的方法上仍需進(jìn)一步改善。

egfrviii是在人腫瘤中最經(jīng)常出現(xiàn)的突變型egfr，并且在被稱為多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的腦腫瘤中尤為普遍。據(jù)報(bào)道，egfrviii存在于56％的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，16％的非小細(xì)胞肺癌和78％的乳腺癌中(carolj.wikstrand,laurap.hale,etal.monoclonalantibodiesagainstegfrviiiaretumorspecificandreactwithbreastandlungcarcinomasandmalignantgliomas.cancerres.1995jul15；55(14):3140-8)，而未在任何正常組織中發(fā)現(xiàn)該序列。因此，egfrviii是潛在的理想腫瘤靶標(biāo)。

隨著腫瘤免疫學(xué)理論和臨床技術(shù)的發(fā)展，嵌合抗原受體t細(xì)胞療法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，car-t)(junech,blazarbr,rileyjl.engineeringlymphocytesubsets:tools,trialsandtribulations.natrevimmunol.2009；9:704-16)成為目前最有發(fā)展前景的腫瘤免疫療法之一。嵌合抗原受體(car)由一個(gè)腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)域以及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)組成。car-t細(xì)胞療法通過外源基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，把識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的單鏈抗體(singlechainfragmentvariable，scfv)和t細(xì)胞活化序列的融合蛋白表達(dá)到t細(xì)胞表面，使可以特異識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的scfv通過跨膜區(qū)與t細(xì)胞胞內(nèi)的活化增殖信號(hào)域偶聯(lián)。表達(dá)car的t細(xì)胞以抗原依賴、但非mhc限制的方式結(jié)合腫瘤抗原，啟動(dòng)并活化特異性殺傷腫瘤反應(yīng)。但是，car-t會(huì)產(chǎn)生一定的脫靶毒性，影響其細(xì)胞免疫療效；而且更重要的是，由于腫瘤的異質(zhì)性，同一個(gè)腫瘤往往存在多種腫瘤抗原，因此針對(duì)單一腫瘤抗原的car-t療效有限，而且容易復(fù)發(fā)。

鑒于dc細(xì)胞是人體最重要的抗原遞呈細(xì)胞，我們通過將car結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)導(dǎo)至dc中，使dc更有效的識(shí)別遞呈腫瘤抗原，同時(shí)加入dc活化擴(kuò)增信號(hào)，進(jìn)一步促進(jìn)dc的激活；而且更重要的，靶向腫瘤的car-dc可以將同一個(gè)腫瘤的多種抗原有效的遞呈給效應(yīng)性t細(xì)胞，從而克服car-t的單靶點(diǎn)識(shí)別殺傷效應(yīng)。在本發(fā)明中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型的dc細(xì)胞治療腫瘤策略，利用慢病毒系統(tǒng)將cd40信號(hào)域與腫瘤相關(guān)嵌合抗原受體(anti-egfrviiiscfv)融合，轉(zhuǎn)導(dǎo)dc細(xì)胞，構(gòu)建egfrviiicar-dc。通過其腫瘤相關(guān)嵌合抗原受體與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞結(jié)合活化dc細(xì)胞，同時(shí)遞呈腫瘤抗原，刺激t細(xì)胞活化，從而起到抗腫瘤的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中體外活化dc細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用比較弱、特異殺傷活性有待提高的缺陷，本發(fā)明提供了以下方面。

本發(fā)明首先提供了一種嵌合抗原受體(car)，所述嵌合抗原受體由cd8α信號(hào)肽、抗egfrviiiscfv、人cd8α鉸鏈區(qū)、人cd40的跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)順次拼接構(gòu)成，稱為egfrviiicar。

進(jìn)一步的，所述單鏈抗體的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供了編碼所述嵌合抗原受體的基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明還提供了表達(dá)載體，其包含并能表達(dá)氨基酸序列為seqidno.1所示的嵌合抗原受體的編碼基因。

進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體為慢病毒載體pcdh-egfrviiicar。

本發(fā)明還提供了一種工程化的樹突狀細(xì)胞，其含有所述表達(dá)載體。

進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體為慢病毒載體pcdh-egfrviiicar。

本發(fā)明還提供了所述的工程化的dc細(xì)胞在制備用于治療腫瘤的藥物中的用途。

進(jìn)一步地，所述腫瘤選自：腦膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)嵌合抗原受體的樹突狀細(xì)胞的方法，其包括將所述嵌合抗原受體的表達(dá)載體進(jìn)入樹突狀細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述方法中的嵌合抗原受體為所述egfrviiicar，優(yōu)選為具有seqidno.1所示的氨基酸序列。

進(jìn)一步地，所述方法中的表達(dá)載體包含并能表達(dá)氨基酸序列為seqidno.1所示的嵌合抗原受體的編碼基因，優(yōu)選為慢病毒載體pcdh-egfrviiicar。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所使用的嵌合抗原受體egfrviiicar的結(jié)構(gòu)示意圖，其由cd8α信號(hào)肽(cd8αsp)、egfrviii抗體輕鏈可變區(qū)(egfrviiiscfv-vl)、接頭區(qū)、egfrviii抗體重鏈可變區(qū)(egfrviiiscfv-vh)、cd8α鉸鏈區(qū)(cd8αhinge)、cd40跨膜區(qū)(cd40tm)和cd40胞內(nèi)信號(hào)區(qū)組成。并設(shè)計(jì)其對(duì)照結(jié)構(gòu)，其對(duì)照結(jié)構(gòu)無cd40胞內(nèi)信號(hào)區(qū)，簡稱egfrviiicar’。

圖2為pcdh-egfrviiicar慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒信息圖。

圖3為體外情況下，本發(fā)明的egfrviiicar-dc細(xì)胞與egfrviii⁺腫瘤細(xì)胞u87(egfrviii⁺u87)共培養(yǎng)后活化情況。a：體外培養(yǎng)dc細(xì)胞；b：慢病毒空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞；c：慢病毒pcdh-egfrviiicar轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞；d：慢病毒pcdh-egfrviiicar’轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞。如圖所示，egfrviiicar-dc細(xì)胞在egfrviii⁺u87細(xì)胞刺激下，在體外實(shí)現(xiàn)更高程度的活化成熟。

圖4為t細(xì)胞活化情況。egfrviiicar-dc細(xì)胞與t細(xì)胞共孵育，在egfrviii⁺u87細(xì)胞刺激下，促進(jìn)了t細(xì)胞的活化。a：慢病毒pcdh-egfrviiicar轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞(無t細(xì)胞)；b：慢病毒pcdh空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞(+t細(xì)胞)；c：慢病毒pcdh-egfrviiicar轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞細(xì)胞(+t細(xì)胞)；d：慢病毒pcdh-egfrviiicar’轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞細(xì)胞(+t細(xì)胞)。

圖5為小鼠腦膠質(zhì)瘤模型中小鼠腫瘤體積變化。a：慢病毒egfrviiicar轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞(無t細(xì)胞)；b：慢病毒空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞(+t細(xì)胞)；c：慢病毒egfrviiicar’轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞(+t細(xì)胞)；d：慢病毒egfrviiicar轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞(+t細(xì)胞)。由圖可得，注射egfrviiicar-dc細(xì)胞+t細(xì)胞組的小鼠腫瘤得到明顯抑制，隨著時(shí)間延長，腫瘤體積明顯縮小直至消失。

圖6為小鼠腦膠質(zhì)瘤模型中小鼠生存曲線圖。a：慢病毒egfrviiicar轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞(無t細(xì)胞)；b：慢病毒空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞(+t細(xì)胞)；c：慢病毒egfrviiicar’轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞(+t細(xì)胞)；d：慢病毒egfrviiicar轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)dc細(xì)胞(+t細(xì)胞)。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所

用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到，其中：

dmem培養(yǎng)基、x-vivo15培養(yǎng)基購自takara公司。

t4dna連接酶購自takara公司。

限制性核酸內(nèi)切酶ecori、xbai購自thermofisherscientific公司。

瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒、普通dna產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技有限公司。

pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro(簡稱pcdh)及其包裝質(zhì)粒plp1、plp2、plp/vsvg購自addgene公司。

trans1-t1phageresistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

lipofectaminetm2000transfectionreagent轉(zhuǎn)染試劑購自invitrogen公司。

293t包裝細(xì)胞、bhk21乳倉鼠腎成纖維細(xì)胞和u87膠質(zhì)瘤細(xì)胞購自美國atcc。

胎牛血清購自gibco公司。

所有引物及基因合成均由上海生工生物科技有限公司合成。

peg6000和nacl均購自上海索萊寶生物科技有限公司。

人gm-csf、il-4、rhil-2、cd3/cd28抗體等購自ebioscience公司。

抗mhc-i，mhc-ii，cd80，cd86，cd3，cd25等流式抗體購自bd公司。

人dc細(xì)胞分選試劑盒、t細(xì)胞分選試劑盒購自stemcell公司。

nsg小鼠購自北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司。

實(shí)施例1

一、一種egfrviiicar基因序列的確定

1.1從美國國立醫(yī)學(xué)圖書館網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)genbank數(shù)據(jù)庫獲得人cd8α信號(hào)肽基因(seqidno.3)、人cd8α鉸鏈區(qū)基因(seqidno.7)、人cd40跨膜區(qū)(seqidno.8)和人cd40信號(hào)域基因(seqidno.9)序列。將人cd8α信號(hào)肽基因(seqidno.3)、egfrviiiscfv輕鏈基因(seqidno.4)、接頭區(qū)(gly4-ser)3(seqidno.5)、egfrviiiscfv重鏈基因(seqidno.6)、人cd8α鉸鏈區(qū)基因(seqidno.7)、人cd40跨膜區(qū)(seqidno.8)和人cd40信號(hào)域基因(seqidno.9)序列進(jìn)行連接，形成最終完整的egfrviiicar基因序列(seqidno.2)信息。

二、egfrviiicar表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

2.1全基因合成：

由上海生工生物科技有限公司合成完整的egfrviiicar序列(seqidno.2)，并在其5’端添加xbai酶切位點(diǎn)，3’端添加ecori酶切位點(diǎn)。

2.2通過pcr擴(kuò)增不包含有人cd40胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的egfrviiicar’區(qū)，5’端添加xbai酶切位點(diǎn)，3’端添加ecori酶切位點(diǎn)。f：gctctagaatggccctgcctgtg(seqidno.10)；r：ggaattctcaggtatcagaaacccctgtag(seqidno.11)。擴(kuò)增回收1005bp片段。

2.3將egfrviiicar及egfrviiicar’分別克隆到pcdh慢病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建

pcdh-egfrviiicar及pcdh-egfrviiicar’質(zhì)粒。具體如下：將pcdh載體、egfrviiicar片段、egfrviiicar’片段xbai/ecori酶切，分別回收8192bp、1186bp、1000bp片段。分別使用t4dna連接酶連接酶切后的pcdh載體與egfrviiicar、pcdh載體與egfrviiicar’，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化trans1-t1感受態(tài)過夜培養(yǎng)，挑取單克隆培養(yǎng)提取質(zhì)粒并測序，獲得pcdh-egfrviiicar及pcdh-egfrviii質(zhì)粒。egfrviiicar及egfrviiicar’結(jié)構(gòu)見圖1。pcdh-egfrviiicar慢病毒表達(dá)載體的信息見圖2。egfrviiicar’基因序列及氨基酸序列見序列表seqidno.12和seqidno.13。

三、慢病毒的包裝、濃縮和滴度測定

3.1慢病毒的包裝：

3.1.1細(xì)胞處理：轉(zhuǎn)染前24小時(shí)收集處于對(duì)數(shù)生長期的第3-10代293t細(xì)胞，將293t細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種量為5×10^5/孔，細(xì)胞在含有2ml10％fbs的dmem培養(yǎng)基中生長，置于37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)18小時(shí)，細(xì)胞密度達(dá)到60-80％即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3.1.2向293t細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染慢病毒載體質(zhì)粒(pcdh或pcdh-egfrviiicar或pcdh-egfrviiicar’)及其包裝質(zhì)粒(plp1，plp2，plp/vsvg)；

3.1.3轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，于熒光顯微鏡下觀察293t細(xì)胞轉(zhuǎn)染后gfp熒光表達(dá)情況。分別于轉(zhuǎn)染后48小時(shí)、72小時(shí)收集293t培養(yǎng)上清中，3000rpm離心15分鐘，分別收集細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融三次裂解細(xì)胞，離心收集上清；

3.1.4用0.45μm濾器過濾病毒上清，分別獲得pcdh空載體病毒、pcdh-egfrviiicar’病毒、pcdh-egfrviiicar病毒溶液。

3.2慢病毒的濃縮及病毒滴度測定

3.2.1分別收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，使用peg6000濃縮病毒，向病毒溶液中加入1/4體積的peg6000/nacl溶液(25％peg6000+4.4％nacl)，混勻，4℃靜置1小時(shí)；

3.2.24℃，5000rpm離心30分鐘；

3.2.3棄上清，加入2ml病毒溶解液(10mmtris-hcl(ph8.0)，2mmmgcl2，5％蔗糖)溶解慢病毒沉淀，并于-80℃儲(chǔ)存。

3.2.4測定病毒滴度。預(yù)先接種bhk21細(xì)胞至24孔板，10^5/孔，置于37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)18小時(shí)；

3.2.5溶解病毒，準(zhǔn)備從10^-2到10^-7的10倍稀釋病毒樣品；

3.2.6去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入含有不同病毒量的細(xì)胞培養(yǎng)液，并在培養(yǎng)液液中加入6ug/ml的聚凝胺(polybrene)，置于37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)；

3.2.7去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1％fbs的dmem培養(yǎng)液，置于37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)；

3.2.8去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入含2ug/ml嘌呤霉素、1％fbs的dmem培養(yǎng)液，置于37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)；

3.2.9去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入結(jié)晶紫染色液，計(jì)數(shù)被染色克隆數(shù)，并計(jì)算病毒滴度。

2.10將病毒稀釋至10^7tu/ml，于-80℃儲(chǔ)存。

四、樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)、感染和擴(kuò)增

4.1用樹突狀細(xì)胞分選試劑盒(購自stemcell公司)將cd14+細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞(pbmc)中分選出來。

4.2用x-vivo15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入200u/ml的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)溶液、500u/ml的il-4溶液和5％的自體血漿，誘導(dǎo)cd14+細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化。

4.3向培養(yǎng)6天的樹突狀細(xì)胞中分別加入pcdh或pcdh-egfrviiicar’或pcdh-egfrviiicar病毒濃縮液至病毒感染復(fù)數(shù)moi＝10，以及終濃度為6μg/ml的聚凝胺，混勻，置于37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24小時(shí)內(nèi)不換液；感染后24小時(shí)進(jìn)行第二次感染；

4.4感染后96小時(shí)，用熒光顯微鏡觀察樹突狀細(xì)胞的綠色熒光的表達(dá)。

4.5收集細(xì)胞后，1000rpm離心10分鐘，pbs洗滌1次，用200ul的pbs重懸細(xì)胞置于流式管中，用流式細(xì)胞儀檢測gfp陽性率。陽性細(xì)胞即為所得的egfrviiicar-樹突狀細(xì)胞。

五、體外共培養(yǎng)測定car-dc細(xì)胞的活化及激活t細(xì)胞作用

5.1分析樹突狀細(xì)胞活化

5.1.1細(xì)胞處理：分別對(duì)egfrviiicar-dc細(xì)胞及egfrviii⁺u87細(xì)胞(簡稱u87viii)進(jìn)行計(jì)數(shù)；

5.1.2將egfrviiicar-dc細(xì)胞與egfrviii⁺u87細(xì)胞按3：1比例混合，置于37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)；

5.1.3收集細(xì)胞后，1000rpm離心10min，pbs洗滌1次，用pbs重懸細(xì)胞，分別使用抗人mhc-i/mhc-ii/cd86/cd80抗體染色，檢測dc細(xì)胞表面的活化標(biāo)志mhc-i/mhc-ii/cd86/cd80的表達(dá)水平。結(jié)果見圖3，egfrviiicar-dc細(xì)胞的活化程度顯著升高。

5.2分析t細(xì)胞激活

5.2.1t細(xì)胞的分離培養(yǎng)，用t細(xì)胞分選試劑盒(購自stemcell公司)將t細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞(pbmc)中分選出來；

5.2.2用含10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^6/ml，將細(xì)胞接種到預(yù)先用抗人cd3和cd28抗體包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再加入200iu/ml重組人白細(xì)胞介素2(rhil-2)，置于37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

5.2.3將egfrviiicar-dc細(xì)胞、egfrviii⁺u87細(xì)胞和t細(xì)胞按3：1：3的比例混合，置于37℃5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)；

5.2.4收集細(xì)胞后，1000rpm離心10分鐘，pbs洗滌1次，用pbs重懸細(xì)胞，分別使用抗人cd3/cd25抗體染色，檢測t細(xì)胞表面的活化標(biāo)志cd25的表達(dá)水平。結(jié)果見圖4，僅egfrviiicar-dc細(xì)胞有效活化t細(xì)胞。

六、體內(nèi)car-dc細(xì)胞的抗腫瘤作用

將20只6-8周齡的nsg小鼠在皮下植入5x10^5egfrviii⁺u87細(xì)胞，觀察和測量腫瘤生長情況，直至腫瘤生長至200mm³，將小鼠隨機(jī)分為4組，分別通過尾靜脈注射10^6egfrviiicar-dc細(xì)胞、pcdh空載體-dc細(xì)胞+t細(xì)胞、pcdh-egfrviiicar’-dc細(xì)胞+t細(xì)胞、pcdh-egfrviiicar-dc細(xì)胞+t細(xì)胞(t細(xì)胞數(shù)為10^6/只)。

car-dc細(xì)胞治療腦膠質(zhì)瘤小鼠模型效果測定：在用car-dc細(xì)胞治療后，觀察和測量腫瘤的生長，并記錄小鼠存活率。腫瘤體積的測量結(jié)果參見圖5，pcdh-egfrviiicar-dc細(xì)胞+t細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組中，腫瘤體積增長緩慢，且一段時(shí)間后逐漸縮小直至消失。存活率參見圖6，egfrviiicar-dc細(xì)胞+t細(xì)胞組的荷瘤小鼠治療后28天生存率為100％，只用dc細(xì)胞治療及空載體dc細(xì)胞組小鼠全部死亡，egfrviiicar’-dc細(xì)胞+t細(xì)胞組小鼠治療后28天部分存活，腫瘤生長速度相對(duì)減緩。證實(shí)了cd40共刺激分子在dc細(xì)胞激活t細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用。

序列表

<110>時(shí)力生物科技（北京）有限公司

<120>治療腦膠質(zhì)瘤的嵌合抗原受體修飾的樹突狀細(xì)胞及其制備方法

<130>無

<160>13

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>391

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>egfrviiicar的氨基酸序列

<400>1

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargprogluileglnleuvalglnserglyalagluval

202530

lyslysproglygluserleuargilesercyslysglyserglyphe

354045

asnilegluasptyrtyrilehistrpvalargglnmetproglylys

505560

glyleuglutrpmetglyargileaspprogluasnaspgluthrlys

65707580

tyrglyproilepheglnglyhisvalthrileseralaaspthrser

859095

ileasnthrvaltyrleuglntrpserserleulysalaseraspthr

100105110

alamettyrtyrcysalapheargglyglyvaltyrtrpglyglngly

115120125

thrthrvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglygly

130135140

serglyglyglyglyseraspvalvalmetthrglnserproaspser

145150155160

leualavalserleuglygluargalathrileasncyslysserser

165170175

glnserleuleuaspseraspglylysthrtyrleuasntrpleugln

180185190

glnlysproglyglnproprolysargleuileserleuvalserlys

195200205

leuaspserglyvalproaspargpheserglyserglyserglythr

210215220

aspphethrleuthrileserserleuglnalagluaspvalalaval

225230235240

tyrtyrcystrpglnglythrhispheproglythrpheglyglygly

245250255

thrlysvalgluilelysthrthrthrproalaproargproprothr

260265270

proalaprothrilealaserglnproleuserleuargprogluala

275280285

cysargproalaalaglyglyalavalhisthrargglyleuaspphe

290295300

alacysaspvalleuhisargsercysserproglypheglyvallys

305310315320

glnilealathrglyvalseraspthrilecysgluprocysproval

325330335

glypheserasnvalserseralapheglulyscyshisprotrpthr

340345350

argserproglyseralagluserproglyglyaspprohishishis

355360365

leuargaspprovalcyshisproleuglyalaglyleuserglnlys

370375380

glyglyglnglualaasngln

385390

<210>2

<211>1173

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>egfrviiicar的核酸序列

<400>2

atggccctgcctgtgacagccctgctgctgcctctggctctgctgctgcatgccgctaga60

cccgagattcagctcgtgcaatcgggagcggaagtcaagaagccaggagagtccttgcgg120

atctcatgcaagggtagcggctttaacatcgaggattactacatccactgggtgaggcag180

atgccggggaagggactcgaatggatgggacggatcgacccagaaaacgacgaaactaag240

tacggtccgatcttccaaggccatgtgactattagcgccgatacttcaatcaataccgtg300

tatctgcaatggtcctcattgaaagcctcagataccgcgatgtactactgtgctttcaga360

ggaggggtctactggggacagggaactaccgtgactgtctcgtccggcggaggcgggtca420

ggaggtggcggcagcggaggaggagggtccgacgtcgtgatgacccagagccctgacagc480

ctggcagtgagcctgggcgaaagagctaccattaactgcaaatcgtcgcagagcctgctg540

gactcggacggaaaaacgtacctcaattggctgcagcaaaagcctggccagccaccgaag600

cgccttatctcactggtgtcgaagctggattcgggagtgcccgatcgcttctccggctcg660

ggatcgggtactgacttcaccctcactatctcctcgcttcaagcagaggacgtggccgtc720

tactactgctggcagggaacccactttccgggaaccttcggcggagggacgaaagtggag780

atcaagaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcag840

cccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagg900

gggctggacttcgcctgtgatgtcctgcaccgctcatgctcgcccggctttggggtcaag960

cagattgctacaggggtttctgataccatctgcgagccctgcccagtcggcttctccaat1020

gtgtcatctgctttcgaaaaatgtcacccttggacaaggtccccaggatcggctgagagc1080

cctggtggtgatccccatcatcatcttcgggatcctgtttgccatcctcttggtgctggt1140

ctttctcaaaaaggtggccaagaagccaaccaa1173

<210>3

<211>63

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人cd8α信號(hào)肽基因序列

<400>3

atggccctgcctgtgacagccctgctgctgcctctggctctgctgctgcatgccgctaga60

ccc63

<210>4

<211>342

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>egfrviiiscfv輕鏈的核酸序列

<400>4

gagattcagctcgtgcaatcgggagcggaagtcaagaagccaggagagtccttgcggatc60

tcatgcaagggtagcggctttaacatcgaggattactacatccactgggtgaggcagatg120

ccggggaagggactcgaatggatgggacggatcgacccagaaaacgacgaaactaagtac180

ggtccgatcttccaaggccatgtgactattagcgccgatacttcaatcaataccgtgtat240

ctgcaatggtcctcattgaaagcctcagataccgcgatgtactactgtgctttcagagga300

ggggtctactggggacagggaactaccgtgactgtctcgtcc342

<210>5

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>接頭區(qū)的核酸序列

<400>5

ggcggaggcgggtcaggaggtggcggcagcggaggaggagggtcc45

<210>6

<211>336

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>egfrviiiscfv重鏈的核酸序列

<400>6

gacgtcgtgatgacccagagccctgacagcctggcagtgagcctgggcgaaagagctacc60

attaactgcaaatcgtcgcagagcctgctggactcggacggaaaaacgtacctcaattgg120

ctgcagcaaaagcctggccagccaccgaagcgccttatctcactggtgtcgaagctggat180

tcgggagtgcccgatcgcttctccggctcgggatcgggtactgacttcaccctcactatc240

tcctcgcttcaagcagaggacgtggccgtctactactgctggcagggaacccactttccg300

ggaaccttcggcggagggacgaaagtggagatcaag336

<210>7

<211>135

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人cd8α鉸鏈區(qū)的核酸序列

<400>7

accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctg60

tccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctg120

gacttcgcctgtgat135

<210>8

<211>66

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人cd40跨膜區(qū)

<400>8

gtcctgcaccgctcatgctcgcccggctttggggtcaagcagattgctacaggggtttct60

gatacc66

<210>9

<211>186

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人cd40胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的核酸序列

<400>9

atctgcgagccctgcccagtcggcttctccaatgtgtcatctgctttcgaaaaatgtcac60

ccttggacaaggtccccaggatcggctgagagccctggtggtgatccccatcatcatctt120

cgggatcctgtttgccatcctcttggtgctggtctttctcaaaaaggtggccaagaagcc180

aaccaa186

<210>10

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr正向因?yàn)?/p>

<400>10

gctctagaatggccctgcctgtg23

<210>11

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr反向引物

<400>11

ggaattctcaggtatcagaaacccctgtag30

<210>12

<211>987

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>egfrviiicar’的核酸序列

<400>12

atggccctgcctgtgacagccctgctgctgcctctggctctgctgctgcatgccgctaga60

cccgagattcagctcgtgcaatcgggagcggaagtcaagaagccaggagagtccttgcgg120

atctcatgcaagggtagcggctttaacatcgaggattactacatccactgggtgaggcag180

atgccggggaagggactcgaatggatgggacggatcgacccagaaaacgacgaaactaag240

tacggtccgatcttccaaggccatgtgactattagcgccgatacttcaatcaataccgtg300

tatctgcaatggtcctcattgaaagcctcagataccgcgatgtactactgtgctttcaga360

ggaggggtctactggggacagggaactaccgtgactgtctcgtccggcggaggcgggtca420

ggaggtggcggcagcggaggaggagggtccgacgtcgtgatgacccagagccctgacagc480

ctggcagtgagcctgggcgaaagagctaccattaactgcaaatcgtcgcagagcctgctg540

gactcggacggaaaaacgtacctcaattggctgcagcaaaagcctggccagccaccgaag600

cgccttatctcactggtgtcgaagctggattcgggagtgcccgatcgcttctccggctcg660

ggatcgggtactgacttcaccctcactatctcctcgcttcaagcagaggacgtggccgtc720

tactactgctggcagggaacccactttccgggaaccttcggcggagggacgaaagtggag780

atcaagaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcag840

cccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagg900

gggctggacttcgcctgtgatgtcctgcaccgctcatgctcgcccggctttggggtcaag960

cagattgctacaggggtttctgatacc987

<210>13

<211>329

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>egfrviiicar’的氨基酸序列

<400>13

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargprogluileglnleuvalglnserglyalagluval

202530

lyslysproglygluserleuargilesercyslysglyserglyphe

354045

asnilegluasptyrtyrilehistrpvalargglnmetproglylys

505560

glyleuglutrpmetglyargileaspprogluasnaspgluthrlys

65707580

tyrglyproilepheglnglyhisvalthrileseralaaspthrser

859095

ileasnthrvaltyrleuglntrpserserleulysalaseraspthr

100105110

alamettyrtyrcysalapheargglyglyvaltyrtrpglyglngly

115120125

thrthrvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglygly

130135140

serglyglyglyglyseraspvalvalmetthrglnserproaspser

145150155160

leualavalserleuglygluargalathrileasncyslysserser

165170175

glnserleuleuaspseraspglylysthrtyrleuasntrpleugln

180185190

glnlysproglyglnproprolysargleuileserleuvalserlys

195200205

leuaspserglyvalproaspargpheserglyserglyserglythr

210215220

aspphethrleuthrileserserleuglnalagluaspvalalaval

225230235240

tyrtyrcystrpglnglythrhispheproglythrpheglyglygly

245250255

thrlysvalgluilelysthrthrthrproalaproargproprothr

260265270

proalaprothrilealaserglnproleuserleuargprogluala

275280285

cysargproalaalaglyglyalavalhisthrargglyleuaspphe

290295300

alacysaspvalleuhisargsercysserproglypheglyvallys

305310315320

glnilealathrglyvalseraspthr

325