專利名稱：基于親水性蛋白質(zhì)的載有活性劑的納米顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及載有活性劑的納米顆粒，其基于 一種親水性蛋白質(zhì)或 者組合的多種親水性蛋白質(zhì)，其中功能蛋白或肽片段經(jīng)聚乙二醇-(X-馬
來酰亞胺-co-NHS酯類化合物與納米顆粒結(jié)合。更具體而言，為了穿越 血腦屏障(blood-brain barriers)轉(zhuǎn)運藥物或者生物活性劑，本發(fā)明涉 及載有活性劑的納米顆粒，其基于至少 一種親水性蛋白質(zhì)并且其中的 功能蛋白或者肽片段，優(yōu)選載脂蛋白，經(jīng)由聚乙二醇-a-馬來酰亞胺 -co-NHS酯類化合物與納米顆粒結(jié)合。
背景技術(shù)：
術(shù)語"納米顆粒"應(yīng)理解為平均尺寸在10納米和1000納米之間
并且由人工或者天然大分子物質(zhì)組成的顆粒，藥物或者其他的生物活 性物質(zhì)可以通過共價鍵、離子鍵或者吸附鍵與其結(jié)合，或者這些物質(zhì) 可以摻入其中。
借助于某些納米顆粒，可能將自身不能夠穿過血腦屏障的親水性 藥物穿越所述屏障轉(zhuǎn)運，使得這些親水性藥物能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)
(CNS)中成為治療有效的。
例如，借助于用聚山梨酯80 (吐溫80 )或其它表面活性劑包覆的 聚氰基丙烯酸丁酯納米顆粒已經(jīng)可以將許多藥物穿越血腦屏障轉(zhuǎn)運， 通過它們的作用在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生了顯著的藥理學(xué)效果。和這樣 的聚氰基丙蟑酸丁酯納米顆粒一起給藥的藥物的實例包括達(dá)拉根(dalargin )( —種內(nèi)啡肽六肽)、洛哌丁胺(loperamide )和筒箭毒堿 (tubocuarine )、分別為法蘭克福的默茲(Merz )公司的兩個NMDA 受體拮抗劑MRZ 2/576和MRZ 2/596,以及抗腫瘤活性劑阿霉素 (doxorubicin )。
這些納米顆粒穿越血腦屏障的轉(zhuǎn)運機理可能基于載脂蛋白E (ApoE)經(jīng)由聚山梨酯80包覆層被納米顆粒所吸附載脂蛋白。據(jù)推測， 這些顆粒由此模仿脂蛋白顆粒，其被腦內(nèi)皮細(xì)胞的受體識別并結(jié)合， 這保證了對腦的脂質(zhì)供應(yīng)。
但是，已知的穿越血腦屏障的聚氰基丙烯酸丁酯納米顆粒有以下 缺陷聚山梨酯80不是生理來源的，并且納米顆粒穿越血腦屏障的轉(zhuǎn) 運可能是由于聚山梨酯80的毒性效應(yīng)。另外，已知的聚氰基丙烯酸丁 酯納米顆粒也有與ApoE的結(jié)合只通過吸附發(fā)生的缺陷。因此，與納米 顆粒結(jié)合的ApoE與游離ApoE存在平衡，并且，在注射入人體后，可 能發(fā)生ApoE從納米顆粒上的快速脫附。而且，許多藥物不能與聚氰基 丙烯酸丁酯納米顆粒結(jié)合至足夠的程度，因此不能通過這種載體系統(tǒng) 被轉(zhuǎn)運穿越血腦屏障。
為了克服這些不足，WO 02/089776 Al主張使用人血清清蛋白納米 顆粒(HSA納米顆粒)，生物素化的載脂蛋白E經(jīng)過抗生物素蛋白-生 物素系統(tǒng)或者抗生物素蛋白衍生物與HSA納米顆粒結(jié)合。在靜脈注射 后，這些HSA納米顆粒可以穿越血腦屏障(BBB)轉(zhuǎn)運4^吸附或者共 價結(jié)合的藥物以及摻入在顆?；|(zhì)里的藥物。由于生化、化學(xué)或者物 理化學(xué)的原因不能夠穿越血腦屏障的活性劑，可以通過這種方式在中 樞神經(jīng)系統(tǒng)中用于藥理學(xué)和治療學(xué)上的用途。然而，抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)也有多種缺陷。例如，在納米顆 粒的生產(chǎn)方面它的使用是復(fù)雜的，并且還可能導(dǎo)致免疫效應(yīng)或者其它 副作用。而且，當(dāng)長時間貯存時，包含抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)的顆 粒系統(tǒng)趨向于凝集，這導(dǎo)致平均顆粒尺寸的增加并對顆粒的功效產(chǎn)生 副作用。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的目的是提供納米顆粒，借助于該納米顆粒，可以將 那些在沒有現(xiàn)有技術(shù)已知的聚氰基丙烯酸丁酯納米顆粒和包含抗生物
素蛋白-生物素系統(tǒng)的HSA納米顆粒的缺陷的那些納米顆粒的情況下， 由于生化、化學(xué)或者物理化學(xué)的原因不能穿越血腦屏障的藥物提供給 CNS。
這個目標(biāo)通過包含至少一種可藥用的和/或生物活性劑的、基于一 種親水性蛋白質(zhì)或者組合的多種親水性蛋白質(zhì)的納米顆粒實現(xiàn)，用作 功能性蛋白的載脂蛋白經(jīng)由聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-co-NHS酯類化合 物與該納米顆粒結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒所基于的親水性蛋白質(zhì)或者至少 一種親水 性蛋白質(zhì)優(yōu)選屬于包含血清清蛋白、明膠A、明膠B和酪蛋白的蛋白 質(zhì)組。人類來源的親水性蛋白質(zhì)是更優(yōu)選的。最優(yōu)選地，納米顆?；?于人血清清蛋白。
雙官能聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-oNHS酯類化合物包含一個馬來 酰亞胺基團和一個N-羥基琥珀酰亞胺酯，在它們之間為確定長度的聚 乙二醇鏈。優(yōu)選地，功能蛋白或者肽片段經(jīng)由聚乙二醇-a-馬來酰亞胺 -co-NHS酯類化合物與親水性蛋白質(zhì)結(jié)合，所述聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-co-NHS酯類化合物含有平均分子量為3400 Da或者5000 Da的聚乙二醇鏈。
經(jīng)由聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-co-NHS酯與親水性蛋白質(zhì)結(jié)合的載 脂蛋白優(yōu)選選自載脂蛋白E、載脂蛋白B(ApoB)和載脂蛋白 Al(ApoAl)。
在根據(jù)本發(fā)明納米顆粒的另外的優(yōu)選方式中，功能蛋白不是載脂 蛋白，而是選自由抗體、酶和肽類激素構(gòu)成的蛋白質(zhì)組。但是，也可 以經(jīng)由聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-co-NHS酯類化合物將幾乎任何所期望 的肽片段，優(yōu)選選自前述功能蛋白的官能活性片段的組的肽片段，與 所述納米顆粒結(jié)合。
因此本發(fā)明的主題是載有活性劑的納米顆粒，其基于一種親水性 蛋白質(zhì)或者組合的多種親水性蛋白質(zhì)，并且其特征為所述納米顆粒包 含至少一種功能蛋白或者肽片段，所述功能蛋白或者肽片段經(jīng)由聚乙 二醇-a-馬來酰亞胺-co-NHS酯類化合物與所述一種親水性蛋白質(zhì)或者 多種親水性蛋白質(zhì)結(jié)合。
將要被轉(zhuǎn)運的活性劑負(fù)載到納米顆粒上可以通過將活性劑吸附在 納米顆粒上、將活性劑摻入納米顆粒中或者經(jīng)由反應(yīng)基通過共價或者 配位一睫來實現(xiàn)。
通常，根據(jù)本發(fā)明納米顆粒可以負(fù)載幾乎任何所期望的活性劑/藥 物。然而，優(yōu)選用那些自身不能穿越血腦屏障的活性劑負(fù)載納米顆粒。 更優(yōu)選地，活性劑屬于下組細(xì)胞生長抑制劑；抗生素；抗病毒物質(zhì)； 和例如選自包含鎮(zhèn)痛劑、促智藥(nootropics),抗癲癇藥、鎮(zhèn)靜藥、精 神治療藥物、垂體激素、下丘腦激素、其它調(diào)節(jié)肽和其抑制劑的組的對神經(jīng)系統(tǒng)疾病有效的藥物，這個列出決不是限制性的。最優(yōu)選地， 活性劑選自包含達(dá)拉根，洛哌丁胺，筒箭毒堿和阿霉素的組。
根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒具有下列優(yōu)點不需要使用可能引起副作
用的抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)來將功能蛋白或者其肽片段與顆粒的親 水性蛋白質(zhì)結(jié)合。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒通過以下方法制備首先經(jīng)過去 溶劑化過程將一種親水性蛋白質(zhì)或者多種親水性蛋白質(zhì)的含水溶液轉(zhuǎn) 化為納米顆粒，然后通過交聯(lián)穩(wěn)定所述納米顆粒。
優(yōu)選通過添加乙醇來實現(xiàn)從含水溶劑的去溶劑化。通常，通過添 加其它親水性蛋白質(zhì)的水混溶性非溶劑，例如丙酮、異丙醇或曱醇， 也可以實現(xiàn)去溶劑化。由此，通過添加丙酮，明膠作為起始蛋白質(zhì)被 成功地去溶劑化。溶解在水相中的蛋白質(zhì)的去溶劑化也可能通過添加 結(jié)構(gòu)形成鹽類例如硫酸鎂或者硫酸銨來實現(xiàn)。這被稱為鹽析。
用于穩(wěn)定納米顆粒的適合交聯(lián)劑是雙官能團醛類化合物，優(yōu)選戊 二醛以及曱醛。而且，可以通過熱過程交聯(lián)納米顆粒基質(zhì)。在60。C超 過25小時或者在70。C超過2小時得到了穩(wěn)定的納米顆粒系統(tǒng)。
位于穩(wěn)定納米顆粒表面的官能團(氨基、羧基、羥基)可用于直 接共價結(jié)合載脂蛋白。這些官能團可以經(jīng)由對于氨基和游離硫醇基兩 者都有反應(yīng)性的雜雙官能的"間隔基"結(jié)合到之前已經(jīng)引入游離硫醇基 的載脂蛋白上。
為了制備根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒，顆粒表面的氨基用基于雜雙官 能聚乙二醇(PEG)的交聯(lián)劑聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-co-NHS酯轉(zhuǎn)化。 在這個過程中，聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-w-NHS酯的琥珀酰亞胺基團與顆粒表面的氨基反應(yīng)，釋放出N-羥基琥珀酰亞胺。通過這個反應(yīng)，可 以在顆粒表面上引入PEG基團，其又在鏈的另 一端含有馬來酰亞胺基 團，該馬來酰亞胺基團可以與硫醇化的物質(zhì)反應(yīng)，由此形成硫醚。
優(yōu)選用于制備根據(jù)本發(fā)明納米顆粒的聚乙二醇-(X-馬來酰亞胺
-co-NHS 酯的聚乙二醇鏈的平均分子量為 3400 Da (NHS-PEG3400-Mal )。然而，通常也可以使用含有更短或更長聚乙二 醇鏈的聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-co-NHS酯類化合物，例如平均分子量為 5000道爾頓(Dalton)的聚乙二醇鏈。
為了制備根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒，將要被結(jié)合的功能蛋白或肽片 段通過用2-亞氨基硫烷(2-iminothiolane)轉(zhuǎn)化而被硫醇化。使用蛋白 質(zhì)的或者肽片段的游離氨基用于這個轉(zhuǎn)化。
在每一個反應(yīng)步驟后，通過在含水溶液中重復(fù)進(jìn)行離心和重新分 散來純化顆粒系統(tǒng)。在轉(zhuǎn)化后，通常通過尺寸排阻色譜法將各自溶解 的蛋白質(zhì)與低分子反應(yīng)產(chǎn)物分離開。
用于制備基于一種親水性蛋白質(zhì)或者組合的多種親水性蛋白質(zhì)并 且用功能蛋白或者肽片段修飾的載有活性劑的納米顆粒的優(yōu)選方法的 特征在于包括下列步驟
-使一種親水性蛋白質(zhì)或者組合的多種親水性蛋白質(zhì)的含水溶液去 溶劑化，
-通過交聯(lián)使由去溶劑化制備的納米顆粒穩(wěn)定，
-用聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-co-NHS酯轉(zhuǎn)化穩(wěn)定的納米顆粒表面上 的氨基，-使功能蛋白或者肽片段硫醇化；和
-使硫醇化的蛋白質(zhì)或者肽片段與用聚乙二醇-a-馬來酰亞胺 -co-NHS酯轉(zhuǎn)化的納米顆粒共價結(jié)合。
為了調(diào)節(jié)藥理學(xué)效果，可以將藥物或者生物活性物質(zhì)(活性劑)摻 入顆粒里。在這種情況下，可以通過共價鍵、配位鍵以及吸附鍵來實 現(xiàn)活性劑的結(jié)合。
在共價結(jié)合硫醇化載脂蛋白或者另一個硫醇化功能蛋白或者肽片 段后，優(yōu)選用活性劑吸附負(fù)載PEG-修飾的納米顆粒。
在一個特別優(yōu)選的方法中，親水性蛋白質(zhì)或者至少 一種親水性蛋 白質(zhì)選自包括血清清蛋白、明膠A、明膠B和酪蛋白和類似蛋白質(zhì)、 或者這些蛋白質(zhì)組合的蛋白質(zhì)的組。最優(yōu)選地，將人類來源的親水性 蛋白質(zhì)用于制備。
在其上結(jié)合有載脂蛋白E的一種親水性蛋白質(zhì)或組合的者多種親 水性蛋白質(zhì)的本發(fā)明納米顆粒適于將用其它方法不能穿越血腦屏障的 藥物或生物活性劑，特別是親水性活性劑，穿越血腦屏障轉(zhuǎn)運并引起 藥理學(xué)效果。優(yōu)選的活性劑屬于下組細(xì)胞生長抑制劑；抗生素；和 例如包含鎮(zhèn)痛劑、促智藥、抗癲癇藥、鎮(zhèn)靜藥、精神治療藥物、垂體 激素、下丘腦激素、其它調(diào)節(jié)肽和其抑制劑的組的對神經(jīng)系統(tǒng)疾病有 效的藥物。這樣的活性劑的實例為達(dá)拉根，洛哌丁胺，筒箭毒堿，阿 霉素等。
因此，在這里描述的納米顆粒，其已經(jīng)負(fù)載了活性劑并用載脂蛋 白進(jìn)行修飾，適于治療許多腦病。為了這個目的，根據(jù)各自的治療目 標(biāo)選擇與載體系統(tǒng)結(jié)合的活性劑。載體系統(tǒng)主要用于那些不能或者不能足夠穿越血腦屏障通過的活性物質(zhì)。被認(rèn)為適于用作活性劑的物質(zhì) 為用于治療腦腫瘤的細(xì)胞抑制劑、用于治療例如HIV感染的腦部病毒 感染的活性劑、以及用與治療癡呆的活性劑，僅僅提及一些應(yīng)用領(lǐng)域。
因此，本發(fā)明的另 一個主題是根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒用于生產(chǎn)藥
劑的用途；更具體而言，由于這些納米顆粒可以用于將藥物或者生物 活性劑穿越血腦屏障轉(zhuǎn)運，所以本發(fā)明的另 一主題是其中功能蛋白為 載脂蛋白的根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒用于生產(chǎn)治療腦病的藥劑的用途， 以及這些蛋白質(zhì)各自用于治療腦病的的用途。


圖1為在靜脈內(nèi)施用經(jīng)由聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-co-NHS酯類化 合物用載脂蛋白修飾的負(fù)載洛哌丁胺的HSA納米顆粒后的鎮(zhèn)痛效應(yīng) (最大可能效應(yīng)MPE)的圖示。
具體實施例方式
實施例
為了通過去溶劑化作用制備HSA納米顆粒，將200 mg的人血清 清蛋白溶解在2.0 ml的10 mM NaCl溶液里，并將該溶液的pH值調(diào)整 到8.0。在攪拌下將80 ml的乙醇以1.0 ml/min的速度滴加到該溶液中。 這個去溶劑化步驟導(dǎo)致形成平均顆粒尺寸為200nm的HSA納米顆粒。
通過加入235 jul的8%戊二醛溶液使納米顆粒穩(wěn)定。在保溫12小 時后，通過首先在凈化水中隨后在PBS緩沖液(pH 8.0)中的三次離心和 再分散將納米顆粒純化。為了活化該納米顆粒，在攪拌下，將500 fil的交聯(lián)劑
NHS-PEG3400-Mal溶液(60 mg/ml在PBS緩沖液8.0中)加入2.0 ml
的納米顆粒混懸液(20 mg/ml在PBS緩沖液中)中并在室溫下保溫1小 時。在保溫階段后，如上所述，使用凈化水純化PEG修飾的納米顆粒。 這些步驟得到聚乙二醇化修飾的HSA納米顆粒，其經(jīng)由與表面結(jié)合的 PEG衍生物的馬來酰亞胺基團具有對游離硫醇基的反應(yīng)性。
為了共價結(jié)合載脂蛋白，首先將游離硫醇基引入其結(jié)構(gòu)中。為了 這個目的，將500 |ig的載脂蛋白溶解在1.0 ml的TEA緩沖液(pH 8.0) 中，并將2-亞氨基硫烷(Traut's試劑)以過量50倍摩爾的量加入。在 室溫下反應(yīng)12小時以后，通過尺寸排阻色譜法經(jīng)由葡聚糖脫鹽柱 (D-Saf柱)將硫醇化載脂蛋白純化，并且在這個過程中分離低分子 反應(yīng)產(chǎn)物。
為了將硫醇化載脂蛋白共價結(jié)合到HSA納米顆粒上，將500嗎 的硫醇化載脂蛋白加入到25 mg的PEG-修飾的HSA納米顆粒中，并 將該混合物在室溫下保溫12小時。在反應(yīng)后，未反應(yīng)的載脂蛋白經(jīng)過 離心和再分散納米顆粒而除掉。在最后的純化步驟中，載脂蛋白修飾 的HSA納米顆粒^皮提取在2.6體積°/。的乙醇中。
在另外的樣品中，將載脂蛋白E、載脂蛋白B和載脂蛋白Al硫醇 化并結(jié)合到HSA納米顆粒上。
為了將模型藥物洛哌丁胺負(fù)載在納米顆粒上，將在乙醇2.6體積％ 中的6.6 mg洛派丁胺加入到20 mg的ApoE-修飾的納米顆粒中并保溫 2小時。然后，未結(jié)合的藥物經(jīng)過離心和再分散而分離；出于注射目的 將所得到的負(fù)載有洛哌丁胺的載脂蛋白-修飾的HSA納米顆粒分散在水中，并通過用水稀釋將顆粒含量調(diào)整到10 mg/ml。將納米顆粒用于 動物試驗，以一企驗它們將活性劑穿越血腦屏障轉(zhuǎn)運的適用性。
其溶解形式不能夠穿越血腦屏障(BBB)的作為阿片樣物質(zhì)的洛哌 丁胺是一種特別適合用于穿越BBB的相應(yīng)載體系統(tǒng)的模型藥物。在施 用含有洛哌丁胺的制劑后產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛效果直接證明了所述物質(zhì)已經(jīng)積 聚在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，因此已經(jīng)穿越了BBB。
在動物試驗中使用的典型納米顆粒制劑含有10.0 mg/ml納米顆粒、 0.7 mg/ml洛艱丁胺和190 fig/ml ApoE。
用于動物試驗的成品納米顆粒制劑(總體積2.0ml)的組分如下
1、 10.0mg/ml載脂蛋白修飾的HSA納米顆粒
2、 190.0嗎/ml共價結(jié)合的載脂蛋白
3、 0.7mg/ml洛哌丁胺(吸附結(jié)合在納米顆粒上)
4、 注射用水。
以7.0mg/kg洛哌丁胺的劑量將制劑靜脈施用給小鼠?；谛∈蟮?平均體重20g，小鼠接受了施用量為200lil的上述制劑。
在這個系統(tǒng)的幫助下，在使用上述提到的活性劑洛哌丁胺靜脈注 射以后達(dá)到了圖1中所示的鎮(zhèn)痛效果。通過甩尾試驗檢測鎮(zhèn)痛(疼痛 性反應(yīng))，其中將一束熱光照射在小鼠的尾巴上并測量到小鼠甩動它的 尾巴為止所經(jīng)過的時間。在十秒鐘(100% MPE)后，停止試驗以便于不 引起對小鼠的傷害。在給予所述制劑之后在早于在進(jìn)行處理之前小鼠 甩動其尾巴的情況下，出現(xiàn)負(fù)MPE值。作為對比，使用在2.6體積％乙醇中的0.7 mg/ml洛哌丁胺溶液。 由于不能穿越血腦屏障轉(zhuǎn)運，游離物質(zhì)洛哌丁胺自身沒有表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛 效果。
權(quán)利要求
1、基于一種親水性蛋白質(zhì)或者組合的多種親水性蛋白質(zhì)的載有活性劑的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒包含至少一種功能蛋白或者肽片段，所述功能蛋白或者肽片段經(jīng)由聚乙二醇-α-馬來酰亞胺-ω-NHS酯類化合物與所述一種親水性蛋白質(zhì)或者多種親水性蛋白質(zhì)結(jié)合。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述一種親水 性蛋白質(zhì)或者至少一種親水性蛋白質(zhì)選自由血清清蛋白、明膠A、明 膠B和酪蛋白組成的組。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的納米顆粒，其特征在于，所述一 種親水性蛋白質(zhì)或者至少一種親水性蛋白質(zhì)是人類來源的。
4、 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米顆粒，其特征在于，所 述功能蛋白或者肽片段選自由載脂蛋白、抗體、酶、激素、細(xì)胞生長 抑制劑、抗生素及其片段組成的組。
5、 根據(jù)前述;f又利要求中任一項所述的納米顆粒，其特征在于，所 述功能蛋白選自由載脂蛋白Al、載脂蛋白B和載脂蛋白E組成的組。
6、 根據(jù)前述^又利要求中任一項所述的納米顆粒，其特征在于，所 述聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-oo-NHS酯類化合物選自包含平均分子量 為3400 Da或5000 Da的聚乙二醇鏈的聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-oo -NHS酯類化合物的組。
7、 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米顆粒，其特征在于，所 述納米顆粒通過吸附、摻入或者經(jīng)由反應(yīng)基通過共價鍵或配位鍵負(fù)載 有活性劑。
8、 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米顆粒，其特征在于，所 述活性劑選自包括細(xì)胞生長抑制劑、抗生素、抗病毒物質(zhì)、鎮(zhèn)痛劑、 促智藥、抗癲癇藥、鎮(zhèn)靜藥、精神治療藥物、垂體激素、下丘腦激素、 其它調(diào)節(jié)肽和其抑制劑的組。
9、 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米顆粒，其特征在于，所述活性劑選自包括達(dá)拉根、洛哌丁胺、筒箭毒堿和阿霉素的組。
10、 制備基于一種親水性蛋白質(zhì)或者組合的多種親水性蛋白質(zhì)并且用功能蛋白或者肽片段修飾的載有活性劑的納米顆粒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟-使一種親水性蛋白質(zhì)或者組合的多種親水性蛋白質(zhì)的含水溶液去 溶劑化，-通過交聯(lián)使通過去溶劑化制備的納米顆粒穩(wěn)定，匿用聚乙二醇-a -馬來酰亞胺-co -麗S酯類化合物轉(zhuǎn)化穩(wěn)定的納米 顆粒表面上的氨基，-使功能蛋白或者肽片段硫醇化；和-使硫醇化蛋白質(zhì)或者肽片段與用聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-co -NHS酯類化合物轉(zhuǎn)化的納米顆粒共價結(jié)合。
11、 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，在結(jié)合硫醇化蛋 白質(zhì)或者肽片段后，將活性劑吸附負(fù)載在納米顆粒上。
12、 根據(jù)權(quán)利要求10或者11所述的方法，其特征在于，所述親水性蛋白質(zhì)選自包括血清清蛋白、明膠A、明膠B、酪蛋白和類似蛋 白質(zhì)，或者這些蛋白質(zhì)組合的蛋白質(zhì)的組。
13、 根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項所述的方法，其特征在于，所述 親水性蛋白質(zhì)是人類來源的。
14、 根據(jù)權(quán)利要求10-13中任一項所述的方法，其特征在于，通過 攪拌和添加親水性蛋白質(zhì)的水混溶性非溶劑或者通過鹽析實現(xiàn)去溶劑 化。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述親水性蛋白 質(zhì)的水混溶性非溶劑選自包括乙醇、曱醇、異丙醇和丙酮的組。
16、 根據(jù)權(quán)利要求10-15中任一項所述的方法，其特征在于，使用 熱過程或者雙官能醛或者曱醛穩(wěn)定所述納米顆粒。
17、 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，使用戊二醛作為 雙官能醛。
18、 根據(jù)權(quán)利要求10-17中任一項所述的方法，其特征在于，所述 聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-co-NHS酯類化合物選自包含平均分子量為 3400 Da或者5000 Da的聚乙二醇鏈的聚乙二醇-oc-馬來酰亞胺-co -NHS酯類化合物的組。
19、 根據(jù)權(quán)利要求10-18中任一項所述的方法，其特征在于，使用 2-亞氨基硫烷作為修飾硫醇基的試劑。
20、 根據(jù)權(quán)利要求10-19中任一項所述的方法，其特征在于，所述 活性劑選自包括細(xì)胞生長抑制劑、抗生素、抗病毒物質(zhì)、鎮(zhèn)痛劑、促智藥、抗癲癇藥、鎮(zhèn)靜藥、精神治療藥物、垂體激素、下丘腦激素、 其它調(diào)節(jié)肽和其抑制劑的組。
21、 根據(jù)權(quán)利要求10-20中任一項所述的方法，其特征在于，所述 活性劑選自包括達(dá)拉才艮、洛哌丁胺、筒箭毒石威和阿霉素的組。
22、 包含經(jīng)由聚乙二醇-a-馬來酰亞胺-co-NHS酯類化合物與親水 性蛋白質(zhì)結(jié)合的載脂蛋白的載有活性劑的納米顆粒用于將藥物或者生 物活性劑穿越血腦屏障轉(zhuǎn)運的用途。
23、 根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，其特征在于，所述親水性蛋白 質(zhì)選自包括血清清蛋白、明膠A、明膠B、酪蛋白和類似蛋白質(zhì)，或 者這些蛋白質(zhì)組合的蛋白質(zhì)的組。
24、 根據(jù)權(quán)利要求22或者23所述的用途，其特征在于，至少一 種親水性蛋白質(zhì)是人類來源的。
25、 根據(jù)權(quán)利要求22-24中任一項所述的用途，其特征在于，所述 活性劑選自包括細(xì)胞生長抑制劑、抗生素、抗病毒物質(zhì)、鎮(zhèn)痛劑、促 智藥、抗癲癇藥、鎮(zhèn)靜藥、精神治療藥物、垂體激素、下丘腦激素、 其它調(diào)節(jié)肽和其抑制劑的組。
26、 根據(jù)權(quán)利要求22-25中任一項所述的用途，其特征在于，所述 活性劑選自包括達(dá)拉根、洛哌丁胺、筒箭毒堿和阿霉素的組。
27、 根據(jù)權(quán)利要求22-26中任一項所述的用途，其特征在于，所述 納米顆粒用于治療腦病。
28、 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的納米顆粒用于生產(chǎn)藥劑的用途。
29、 其中所述功能蛋白是載脂蛋白的根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的納米顆粒用于生產(chǎn)治療腦病的藥劑的用途。
30、 其中所述功能蛋白是載脂蛋白的根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所 述的納米顆粒用于治療腦病的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于一種親水性蛋白質(zhì)或者組合的多種親水性蛋白質(zhì)的載有活性劑的納米顆粒，其中功能蛋白或肽片段經(jīng)聚乙二醇-α-馬來酰亞胺-ω-NHS酯類化合物與納米顆粒結(jié)合。本發(fā)明同時公開了所述納米顆粒的制備方法及其用途。
文檔編號A61K47/48GK101443045SQ200780008509
公開日2009年5月27日 申請日期2007年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月14日
發(fā)明者克勞斯·朗熱, 克思廷·米夏埃利斯, 塞巴斯蒂安·德萊塞, 泰利·?？笋R特拉, 約爾格·克洛伊特爾 申請人:Lts羅曼治療方法有限公司