本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和植物品種鑒別
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種豌豆SSR指紋圖譜的構(gòu)建方法以及利用構(gòu)建得到的豌豆SSR指紋圖譜鑒別豌豆品系或其野生近緣種的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豌豆(PisumsativumL.)屬豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionoideae)野豌豆族(Vicieae)豌豆屬(Pisum)中的一個(gè)栽培中，屬一年生(春播)或越年生(秋播)攀巖性草本自花授粉植物。豌豆是世界上第四大食用豆類作物，全球有60多個(gè)國家生產(chǎn)干豌豆；我國是世界豌豆主產(chǎn)國，總面積、總產(chǎn)均為世界第一。豌豆適用冷涼氣候、多種土地和干旱環(huán)境，具有高蛋白質(zhì)含量、維生素豐富、易消化吸收，糧、菜、飼、肥兼用以及深加工增值的諸多特點(diǎn)，是種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中重要的間、套、輪作和養(yǎng)地作物，在我國的可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展和我國人民食物結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生著重要影響。因此開展豌豆品種的有效甄別顯得尤為重要。目前我國對(duì)豌豆品種進(jìn)行鑒定主要方法是按照NY/T2436-2013《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南豌豆》進(jìn)行田間測(cè)定來鑒定的。該方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，但受限于許多形態(tài)學(xué)性狀鑒定周期長、易受環(huán)境影響等因素，因此不能精確、快捷地為新品種侵權(quán)案件提供鑒定依據(jù)，同時(shí)也常出現(xiàn)不同測(cè)試人員對(duì)某些性狀的認(rèn)識(shí)存在偏差，導(dǎo)致判定結(jié)果不一致的問題。當(dāng)前，隨著育種骨干親本的利用集中化，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)測(cè)試已經(jīng)不能適應(yīng)品種鑒定和純度分析的要求。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，基于分子標(biāo)記技術(shù)而建立起來的DNA指紋圖譜(fingerprint)在品種、品系鑒別方面發(fā)揮著重要作用。品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建在豌豆品種純度及真實(shí)性鑒定、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、品種審定及產(chǎn)權(quán)登記保護(hù)、真假種辨別、品種糾紛等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值，在探究我國豌豆種質(zhì)資源的親緣關(guān)系、雜種優(yōu)勢(shì)群劃分、種質(zhì)資源創(chuàng)新利用及新品種選育等方面發(fā)揮著顯著作用。當(dāng)前用于構(gòu)建作物DNA指紋圖譜的標(biāo)記技術(shù)主要有RFLP、RAPD、AFLP、EST、ISSR、SSR等。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simplesequencerepeat，SSR)，是第二代基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性豐富、遺傳信息多、操作便利、共顯性、高度可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物資源遺傳研究和分子輔助育種實(shí)踐中。DNA指紋圖譜能夠從DNA水平上鑒定出品種間的差異或遺傳相似性。微衛(wèi)星(又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列，SSR)是由1-6個(gè)核苷酸組成的短序列串聯(lián)重復(fù)多次而組成的一段DNA。由于微衛(wèi)星中重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)不同，因而擴(kuò)增出的微衛(wèi)星序列的長度呈現(xiàn)多態(tài)性。微衛(wèi)星序列具有多態(tài)性較高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，是十分有效的分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域。為了有效保護(hù)我國豌豆的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，有必要在我國開展豌豆開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)，并應(yīng)用于豌豆優(yōu)良品種“分子身份證”構(gòu)建的研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種豌豆SSR指紋圖譜的構(gòu)建方法，本發(fā)明的另一目的在于提供一種高效、準(zhǔn)確、低成本的利用豌豆SSR指紋圖譜鑒別豌豆品系或其野生近緣種的方法。本發(fā)明的目的還在于提供該方法的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以49份代表性豌豆品種和32份豌豆種質(zhì)資源基因組DNA為模板，通過分析豌豆基因組序列和EST序列，合成核心基因組SSR和EST-SSR引物。經(jīng)過篩選，分別有19對(duì)基因組SSR和12對(duì)EST-SSR引物組成的分子標(biāo)記組合可完全鑒別49份豌豆品種和32份豌豆種質(zhì)資源的差異。所述的81份代表性參試豌豆材料見表1。表1中，有49份豌豆育成品種(W7-W55，6份國外豌豆資源(W1-W6)，18份豌豆核心種質(zhì)資源(W56-W73)，共計(jì)73份豌豆材料，統(tǒng)稱“豌豆品系”，表1中另外8份野生豌豆資源(W74-W81)為豌豆野生近緣種。表181份豌豆品系或其野生近緣種經(jīng)過多次篩選，選擇在連鎖群上的均勻分布、多態(tài)性較高、PCR擴(kuò)增較穩(wěn)定，同時(shí)滿足常規(guī)非變性凝膠電泳檢測(cè)和毛細(xì)管熒光電泳檢測(cè)兩種技術(shù)平臺(tái)，最終篩選出在豌豆品系或其野生近緣種間多態(tài)性信息含量值最高、等位位點(diǎn)數(shù)最多、重復(fù)性好、擴(kuò)增帶型清晰度高、連鎖群分布均勻的SSR引物作為豌豆SSR指紋圖譜庫構(gòu)建的核心引物。基于上述篩選方法，本發(fā)明提供用于鑒別豌豆品系或其野生近緣種的分子標(biāo)記組合，其特征在于，含有19個(gè)基因組SSR分子標(biāo)記和12個(gè)EST-SSR分子標(biāo)記，分別為SSR4825、SSR4696、SSR28304、SSR24036、B83、EST671、SSR27844、SSR25888、SSR24882、SSR23759、SSR21491、EST619、SSR24112、EST599、SSR22754、P14、SSR24731、SSR25334、EST876、SSR28967、SSR21399、SSR21405、P282、EST643、SSR25799、SSR25965、P291、P292、SSR22052、P344、EST617；所述分子標(biāo)記分別通過以下引物對(duì)擴(kuò)增得到：SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10、SEQIDNO.11-12、SEQIDNO.13-14、SEQIDNO.15-16、SEQIDNO.17-18、SEQIDNO.19-20、SEQIDNO.21-22、SEQIDNO.23-24、SEQIDNO.25-26、SEQIDNO.27-28、SEQIDNO.29-30、SEQIDNO.31-32、SEQIDNO.33-34、SEQIDNO.35-36、SEQIDNO.37-38、SEQIDNO.39-40、SEQIDNO.41-42、SEQIDNO.43-44、SEQIDNO.45-46、SEQIDNO.47-48、SEQIDNO.49-50、SEQIDNO.51-52、SEQIDNO.53-54、SEQIDNO.55-56、SEQIDNO.57-58、SEQIDNO.59-60、SEQIDNO.61-62所示的引物。本發(fā)明提供一種引物組合，含有以下31對(duì)特異性引物對(duì)，其核苷酸序列分別如SEQIDNO.1-62所示。本發(fā)明提供含有上述引物組合的試劑盒。本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記組合或引物組合在鑒定豌豆品系或其野生近緣種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記組合或引物組合在豌豆種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記組合或引物組合在構(gòu)建豌豆SSR植物圖譜中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種豌豆SSR指紋圖譜的構(gòu)建方法，以本發(fā)明所述的含有上述31對(duì)引物的引物組合對(duì)不同豌豆品種和種質(zhì)資源的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)：純合位點(diǎn)的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該位點(diǎn)等位變異的大小；雜合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異；無效等位變異的大小記錄為0/0；上述“/”前為小片段，“/”后為大片段；通過對(duì)不同位點(diǎn)的數(shù)據(jù)整合，形成不同豌豆材料的SSR指紋圖譜。其中，PCR擴(kuò)增方法為：反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性35s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，10℃保溫5min；10μL擴(kuò)增體系為：2×TaqPCRMasterMix5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O2.5μL。其中，當(dāng)采用非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)時(shí)，是采用8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電壓300V，電流280mA，功率260W。當(dāng)采用熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)時(shí)，為引物加入熒光標(biāo)記，詳細(xì)情況見表2。本發(fā)明提供了利用上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的豌豆指紋圖譜。本發(fā)明構(gòu)建得到的豌豆指紋圖譜，如表5-表20所示。本發(fā)明進(jìn)而提供一種鑒定豌豆品系或其野生近緣種的方法，包括如下步驟：(1)提取待檢豌豆的DNA，以本發(fā)明所述的引物組合中的31對(duì)引物對(duì)分別對(duì)待檢豌豆的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)擴(kuò)增產(chǎn)物通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，銀染顯色，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳凝膠上的相對(duì)位置；或?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)位置：純合位點(diǎn)的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該位點(diǎn)等位變異的大??；雜合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異；無效等位變異的大小記錄為0/0；上述“/”前為小片段，“/”后為大片段；(3)結(jié)果對(duì)照表5-表20的豌豆品系或其野生近緣種指紋圖譜，材料間差異位點(diǎn)數(shù)≥3，則為不同豌豆品系或不同豌豆野生近緣種；材料間差異位點(diǎn)數(shù)<3，則為近似豌豆品系或其野生近緣種。本發(fā)明提供了上述方法在豌豆種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。本發(fā)明豌豆DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，利用了SSR引物組合對(duì)某一豌豆品系或其野生近緣種DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到一組特有的DNA指紋，于是本發(fā)明方法采用引物組合鑒別的方法對(duì)豌豆品系或其野生近緣種進(jìn)行分析和篩選，使每一個(gè)豌豆品系或其野生近緣種都找到了它特有的DNA指紋。本發(fā)明的基因組SSR和EST-SSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物帶型間大小差異明顯，能夠很好的區(qū)分不同的豌豆品種或豌豆材料。對(duì)同一品種內(nèi)的個(gè)體間的擴(kuò)增產(chǎn)物，其帶型一致。本發(fā)明的檢測(cè)方法在短時(shí)間內(nèi)即可完成豌豆品系或其野生近緣種鑒定與遺傳多樣性評(píng)價(jià)工作，具有高效、準(zhǔn)確、低成本、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)本發(fā)明的檢測(cè)方法可以有效的對(duì)豌豆種子真?zhèn)芜M(jìn)行監(jiān)控，從DNA水平揭示品種的遺傳變異與親緣關(guān)系，保護(hù)了作物品種，防止假冒偽劣品種進(jìn)入市場(chǎng)，也為豌豆品種選育過程中優(yōu)異種質(zhì)的合理利用提供了技術(shù)參考。附圖說明圖1為81份豌豆品系或其野生近緣種聚類分析結(jié)果圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；若未特別指明，實(shí)施例中所用試劑均為市售。本發(fā)明品種判定原則遵照以下國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，NY/T2594-2014植物品種鑒定DNA指紋方法總則；NY/T2436-2013《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南豌豆》；GB/T19557.1植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南總則。實(shí)施例1用于鑒定豌豆豌豆品系或其野生近緣種的基因組SSR和EST-EST引物的篩選本實(shí)施例以我國豌豆主產(chǎn)區(qū)代表性推廣的49個(gè)豌豆品種和32份豌豆種質(zhì)資源(見表1)基因組DNA為模板，通過分析豌豆基因組序列和EST序列，合成核心基因組SSR和EST-SSR引物。經(jīng)過篩選，分別有19對(duì)基因組SSR和12對(duì)EST-SSR引物組成的分子標(biāo)記組合可完全鑒別49份豌豆品種和32份豌豆種質(zhì)資源的差異。最終篩選得到19對(duì)基因組SSR分子標(biāo)記和12對(duì)EST-SSR分子標(biāo)記。表231對(duì)SSR核心引物上述表2的引物分別對(duì)應(yīng)序列表中的SEQIDNO.1-62。實(shí)施例2豌豆特征指紋圖譜的構(gòu)建與豌豆品系或其野生近緣種鑒定方法的建立1、豌豆總DNA提取采用改良CTAB法提取供試樣品DNA：取2g左右的新鮮幼嫩葉片，在液氮中研磨成粉末狀裝入2.0ml離心管中，放入-80℃冰箱保存待用；將預(yù)熱到65℃的2×CTAB提取液，按占溶液容量的1％的比例加入β-巰基乙醇，充分混勻；取出研磨好的葉片組織，每份樣品中加入800μL預(yù)熱后的CTAB提取液，渦旋1-2min，65℃水浴1h(每15min上下顛倒輕翻一次，充分混勻)；水浴加熱結(jié)束后，加入800μL氯仿/異戊醇(24：1)溶液于離心管中，混合15-20min，之后10000rpm離心15min；吸取600μL左右上清液移至新離心管(量可適當(dāng)減少，但切不可接觸蛋白質(zhì)層)，后加入95％等體積乙醇，搖勻后于-20℃冰箱放置2h或者4℃冰箱過夜，保證充分沉淀；12000rpm離心10min，倒掉上清，保留沉淀；用90％乙醇500μL清洗白色沉淀，10000rpm離心5min，小心倒掉上清；室溫風(fēng)干，加入100μLddH2O充分溶解沉淀。利用Nanodrop2000/2000C儀器檢測(cè)樣品DNA濃度，將DNA濃度稀釋到50ng/μL，4℃保存?zhèn)溆谩?、以實(shí)施例1所述81份豌豆參試材料，利用實(shí)施例1篩選得到的用于擴(kuò)增31個(gè)分子標(biāo)記的引物分別對(duì)實(shí)施例1所述的49個(gè)豌豆品種和32份豌豆種質(zhì)資源基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性35s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，10℃保溫5min；10μL擴(kuò)增體系為：2×TaqPCRMasterMix5μL，2μM/μL的上、下游引物各1μL，DNA模板1.5μL，ddH2O2.5μL。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳及銀染顯色：擴(kuò)增產(chǎn)物采用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電泳緩沖液為0.5×TBE，200V穩(wěn)壓電泳2-2.5h，至加樣緩沖液移到凝膠底部時(shí)電泳結(jié)束。銀染顯色，照相記錄。(1)玻璃板清洗用清水和洗滌劑將平、凹玻璃板充分清洗干凈，然后用蒸餾水沖洗，置于玻璃板架晾干；為防止灌膠時(shí)有氣泡產(chǎn)生，灌膠前用酒精擦洗玻璃板，晾干備用；將組裝好的玻璃板水平放齊，用夾子固定。(2)灌膠在45ml8％PAGE膠中加入TEMED45μL和10％過硫酸銨450μLTEMED(注：TEMED和過硫酸銨的使用量應(yīng)依據(jù)環(huán)境溫度做出相應(yīng)調(diào)整)，迅速混勻后灌膠。待膠液充滿玻璃板夾層時(shí)，在上部輕輕插入梳子，使其聚合25min左右(注：具體聚合時(shí)間應(yīng)隨不同環(huán)境溫度做出相應(yīng)調(diào)整)。在灌膠過程中，應(yīng)防止氣泡的產(chǎn)生。(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)處理在10μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2.5μL6×Loadingbuffer，混勻30s待用。(4)電泳用移液器吹吸加樣槽，清除雜質(zhì)和氣泡。每加樣孔點(diǎn)入1.5μL產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，電泳1-1.5小時(shí)(電壓300V，電流280mA，功率260W)，電泳時(shí)間長短可根據(jù)目標(biāo)片段大小和實(shí)際功率適度調(diào)節(jié)。待上部的指示帶(二甲苯青)到達(dá)膠板底部，電泳結(jié)束，小心剝離聚丙烯酰胺凝膠，待染色。(5)銀染漂洗：使用蒸餾水快速漂洗聚丙烯酰胺凝膠1次，時(shí)間不超過10s。銀染：按以下銀染液配比對(duì)凝膠進(jìn)行染色，然后平行震蕩染色10min。表3清洗：染色10min后，將染色液倒入廢液桶，繼續(xù)用蒸餾水漂洗2次，每次不超過15s。顯色：按以下顯色液配比，加入適當(dāng)?shù)娘@色液于塑料盒中，輕輕混勻后置于平行震蕩儀，使凝膠與顯色液充分作用，直至條帶清晰。表4洗滌：將顯影液倒掉并用蒸餾水清洗2-3次，每次不超過15s。保存：清洗干凈后，將凝膠平鋪在玻璃板上，用保鮮膜將其密封，讀出條帶結(jié)果并統(tǒng)計(jì)記錄，然后照相留存。結(jié)果記錄：純合位點(diǎn)的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該位點(diǎn)等位變異的大??；雜合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異(小片段在前，大片段在后)；無效等位變異的大小記錄為0/0。構(gòu)建的81份豌豆材料的指紋圖譜見表5-表20。表5表6SSR24112B83P291SSR24036SSR28304SSR22754SSR25799SSR21405W1195/199162/162220/220206/220133/133173/173104/104130/144W2195/195158/162220/220194/194127/127161/161102/102130/157W3187/187159/162210/219212/212125/134173/173102/102130/130W4199/199160/160201/201192/192125/125173/173102/102144/144W5205/205158/158219/219194/194127/127173/173102/102143/143W6223/225161/161219/219218/218128/128173/173102/102157/157W7195/195163/163201/201206/206127/127161/173144/144130/130W8195/195163/163219/219206/206127/127170/170134/134130/130W9189/189156/156208/208192/192134/134173/173108/108159/159W10199/199164/164219/219218/218133/133173/173104/104144/144W11187/187142/142208/208192/192134/134158/174102/108134/159W12199/199156/156201/201194/194133/133158/158100/102159/159W13188/188142/142219/219194/194133/133170/170108/108134/134W14189/225161/161219/219193/193128/128161/161151/151159/159W15195/195155/155219/219194/194134/134161/161102/102158/158W16195/195161/161219/219194/194127/127158/158134/134130/130W17195/195155/161219/219194/194127/127158/158134/134144/160W18199/199161/161207/207194/194127/127161/173134/151144/144W19186/186161/161219/219194/194127/127161/161132/132144/144W20195/195142/142208/219193/193127/127161/161151/151144/144表7表8EST643P344EST876P14SSR25965SSR27844SSR21491W1139/142138/145154/177181/187159/159113/113158/158W2157/157145/145154/189187/190167/167114/114172/172W3144/144145/157154/164187/190159/163113/113172/172W4142/142152/157154/177187/190165/165112/112175/175W5141/141157/157154/176190/190142/142115/115175/175W6139/139145/14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/172W53138/138145/157154/163187/190149/149112/112172/172W54157/157157/157154/163181/187146/146112/112169/169W55138/138138/157154/163187/196161/167113/115160/172W56157/157157/157154/176196/196146/146113/113169/169W57141/141145/145154/163190/190155/155113/114178/178W58142/142139/145154/177182/184166/166107/107178/178W59141/145138/144154/154187/197161/161113/113172/180W60142/144138/145154/154187/190161/161113/115172/172表17表18SSR24112B83P291SSR24036SSR28304SSR22754SSR25799SSR21405W61188/188157/157201/201192/192134/134158/158108/108134/134W62186/186161/161219/219194/194127/127173/173102/102130/144W63189/199155/155207/219193/193134/134170/170102/108134/134W64198/198158/158219/219191/191134/134158/158102/102143/143W65191/191155/155201/201191/191134/134158/161102/102158/158W66184/184142/142201/201192/192127/127158/158108/108134/134W67189/189142/159201/219192/193128/134158/176108/108130/144W68195/195159/159219/219197/197128/128173/173155/155130/130W69195/195155/155207/219192/192134/134170/170102/108143/143W70195/195156/156201/201194/194134/134171/171102/102144/144W71191/191167/167208/208192/192134/134158/158108/108134/134W72195/199164/179220/220206/218134/134170/170105/105130/130W73195/195159/159220/220194/194125/125177/177108/108144/144W74225/225159/159220/220194/194128/128161/161149/149130/130W75201/201140/140207/207210/210127/127173/173104/104156/156W76186/186161/161219/219194/194125/125173/173103/103144/144W77232/232155/155204/204192/192133/133158/158102/102144/144W78188/188159/159201/201212/212134/134173/173102/102144/144W79199/199161/161213/213198/198125/125173/173104/104144/144W80187/187160/160201/201206/206133/133158/158103/110144/144W81199/199147/147208/208187/187127/127167/167108/108134/134表19EST599SSR24882SSR24731EST619EST671SSR25888SSR22052SSR25334W61167/167152/152212/212112/115131/148163/163138/138141/141W62158/170150/150193/193123/127130/147163/163141/141137/137W63146/146152/171187/187115/124130/143166/166141/141137/137W64170/170171/171202/202123/123143/147162/162141/141136/136W65146/146152/152193/193124/124130/130166/166137/137137/137W66146/146152/152214/214124/124129/147178/178137/137137/137W67146/146152/152193/218115/124139/146163/166137/137135/137W68148/148152/156198/198126/126129/129173/173137/137136/136W69167/175150/150187/187126/126143/147166/166137/141136/136W70169/169152/152208/208115/115131/148166/166138/138136/136W71165/165168/168193/193124/124143/148166/166138/138128/128W72159/159152/152193/198115/115131/148166/166144/144136/136W73175/175150/150202/202126/126143/148166/166144/144139/139W74173/173150/150200/202126/126141/141166/166137/137136/136W75124/124150/150190/190115/115143/143166/166144/144127/127W76146/146154/154192/192115/115131/147166/166144/144136/136W77124/124152/152193/193115/115130/147176/176144/144130/130W78156/156151/151193/193124/124130/147163/163139/139128/128W79156/156150/150193/193126/126130/147165/165144/144137/137W80158/158154/154200/200126/126140/147177/177139/139132/132W81135/135152/152190/190132/132145/145168/168128/128165/165表204、與上述步驟3平行的檢測(cè)方法，還可采用對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)，具體如下：PCR產(chǎn)物樣品準(zhǔn)備及電泳分析結(jié)果將FAM(藍(lán)色)和HEX(綠色)熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物用超純水稀釋25倍，分別取等體積的上述2種稀釋后溶液混合形成混合液，吸取1μL混合液、0.1μLLIZ500分子量?jī)?nèi)標(biāo)和8.9μL去離子甲酰胺分別加入到DNA分析儀專用深孔板孔中；然后將其在PCR儀上95℃變性5min，取出后立即置于碎冰上，冷卻15min左右；瞬時(shí)離心10s，進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，用GENEMAPPER進(jìn)行圖像分析和數(shù)據(jù)采集。以DNAMarkerI為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，純合位點(diǎn)的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該位點(diǎn)等位變異的大??；雜合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異；無效等位變異的大小記錄為0/0(注：小片段在前，大片段在后)。通過對(duì)多個(gè)位點(diǎn)的數(shù)據(jù)整合，最終形成不同豌豆品系或其野生近緣種的SSR指紋圖譜(表5-表20)。除待測(cè)樣品外，每個(gè)SSR位點(diǎn)還應(yīng)同時(shí)包括3～5個(gè)參照材料的擴(kuò)增產(chǎn)物。不同熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物的最適稀釋倍數(shù)最好通過預(yù)試驗(yàn)確定。檢測(cè)結(jié)果判定：材料間差異位點(diǎn)數(shù)≥3，則為不同豌豆品系或不同豌豆野生近緣種；材料間差異位點(diǎn)數(shù)<3，則為近似豌豆品系或其野生近緣種。比較81份豌豆材料的指紋數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)任意兩個(gè)材料間的差異位點(diǎn)數(shù)都大于3，說明這31對(duì)核心引物可以有效的把這些豌豆品系或其野生近緣種鑒別開；利用PowerMarker和MEGA軟件進(jìn)行聚類，分析參試材料間的遺傳關(guān)系，從圖中可以發(fā)現(xiàn)在遺傳相似系數(shù)為0.075左右時(shí)可以把81份豌豆材料區(qū)分開(圖1)。實(shí)施例3本發(fā)明鑒定豌豆品系或其野生近緣種方法的應(yīng)用提取已知品種名稱的6個(gè)豌豆樣品的葉片DNA，以本發(fā)明實(shí)施例1篩選得到的分子標(biāo)記組合中的31對(duì)引物分別對(duì)待檢豌豆品種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；參照本發(fā)明實(shí)施例2的PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)程序，聚丙烯酰胺凝膠電泳和變異位點(diǎn)記錄方法(方法1)，同時(shí)重復(fù)實(shí)驗(yàn)采用熒光毛細(xì)管電泳法和變異位點(diǎn)記錄方法(方法2)，將得到的指紋代碼與本發(fā)明得到的豌豆品系或其野生近緣種的特征指紋圖譜(表5-表20)進(jìn)行比對(duì)，以驗(yàn)證本發(fā)明實(shí)施例2建立的鑒定方法準(zhǔn)確度。表21SSR4825SSR21399SSR23759P292SSR4696P282SSR28967EST617F1191/191141/141156/156210/210212/212184/184172/172125/125F2225/225141/141156/156225/225195/195184/184173/173125/125F3205/205158/158163/163225/225216/216201/203172/172134/134F4195/205141/141156/156200/200216/216184/184182/182128/128F5195/224154/154163/163216/216195/195186/186172/172127/127F6191/195154/154163/163216/216212/212186/186172/172128/128表22SSR24112B83P291SSR24036SSR28304SSR22754SSR25799SSR21405F1189/189156/156208/208192/192134/134173/173108/108159/159F2195/195155/155219/219194/194134/134161/161102/102158/158F3189/189161/161219/219194/194128/128161/161151/151144/144F4225/225161/161201/201220/220133/133173/173144/144130/130F5227/227159/159201/201204/204127/127161/161151/151144/144F6225/225159/159201/201194/204127/127161/161151/151144/144表23EST599SSR24882SSR24731EST619EST671SSR25888SSR22052SSR25334F1146/146152/152187/187115/115131/147163/166137/137137/137F2146/177150/150202/202124/124141/141166/166137/137137/137F3158/158153/153187/187126/126140/187163/163141/141137/137F4154/154150/150216/216123/123140/140177/177141/141136/136F5158/158150/150202/202126/126141/141177/177144/144152/152F6158/158150/150202/202126/126139/139177/177144/144150/150表24EST643P344EST876P14SSR25965SSR27844SSR21491F1141/141138/145154/154187/190159/161113/113169/169F2144/144138/138154/191187/196161/161113/113169/169F3157/157138/138154/176187/190146/146112/112172/172F4139/139158/158154/163190/190146/146115/115172/172F5157/157138/138154/176196/196146/146115/115160/160F6157/157145/145154/177187/190146/146115/115172/172結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用本發(fā)明實(shí)施例1的31對(duì)引物組合對(duì)6個(gè)豌豆品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上述兩種方法測(cè)得的6個(gè)豌豆樣品變異位點(diǎn)均一致，結(jié)果見表21-表24，且與本發(fā)明建立的豌豆指紋圖譜目標(biāo)品種的差異位點(diǎn)數(shù)＜3，F(xiàn)1-F6為待測(cè)6個(gè)豌豆品種，經(jīng)過對(duì)比鑒定得到F1-F6分別對(duì)應(yīng)海門白花豌豆(W9)，無須豆尖1號(hào)(W15)，草原276(W27)，科碗2號(hào)(W32)，成碗8號(hào)(W44)，食莢大菜碗6號(hào)(W49)，與已知品種名稱一致，準(zhǔn)確度100％。表明本發(fā)明實(shí)施例1篩選得到的31對(duì)引物組合可以較好的可以區(qū)分不同豌豆品種。應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例2提供的鑒別豌豆品種的方法準(zhǔn)確性較高，適合推廣使用。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。SEQUENCELISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所<120>一種豌豆SSR指紋圖譜的構(gòu)建方法<130>KHP161119131.4<160>62<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1gcatgtgcatttaatcgtgc20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2tgcacacgtacacacaaatca21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3tgcatgtgcatgtaatcgtg20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4tcacacgcacgtacaaatca20<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>5ttttcagctgatcggatatctaca24<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6ggcagcatcttgaaaatcgt20<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7gaaggaccaaatcaattctctaaa24<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8accgacgtcaacgactgata20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9ccctctcccatctcatctca20<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>10aaagaaagtagagatccagcactga25<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>11ttgcctcatttatcattctcttatg25<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>12caaaaggttatctagctacgacttga26<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>13gcttcaagctaccaagtgga20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14cctcacgggctctaccatac20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15aagggggagagaggtggtta20<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16tcgccttttctttcttcttca21<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>17tttctggaacctcgcaaaac20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>18ttgcctcaatttggagacct20<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>19ggggtgacagtgtagggtttt21<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>20taggcacacgctttcatgtt20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>21acacgggatcgagctttaga20<210>22<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>22tcctttcctctaacttcttccttct25<210>23<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>23aagtctctcatacctaaccaaccac25<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>24gcagccaaatttgaggaaga20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>25ttgatcatcctctcgctttt20<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>26tgttgtcgtcatcaaaacacag22<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>27gcaattttctcactccatctcc22<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28aaaggaaagcaactcggtga20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>29ggaacgacaacacgaacctc20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>30gacacgttatgcgcacactc20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>31tccgcaatgttctctcgaat20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>32ggaggtctccgcattatcaa20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>33agaaaatggcccacgaatta20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>34tgcattgcattgtgtttgtg20<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>35tgaagatgtgacaaacaacagaaa24<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>36tccttctctgttcccaccac20<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>37gcagattgactgctcatgatgt22<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>38agctgattattgggcacctg20<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>39ctcgtcctcatcgaaaagcta21<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>40gtgaacaacgcaagggtttc20<210>41<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>41tgattctagttcatttcacaaacaca26<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>42cgtcctgcacctagcttctt20<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>43tccaccatctaatcccctctt21<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>44agctgattattgggcacctg20<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>45ggcaagcataaaagggacac20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>46ttcatccaagaaccctcgac20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>47caccaccactctcacaccat20<210>48<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>48tgcattgcgagagtaagacaa21<210>49<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>49ctgcagaaggccctgttcta20<210>50<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>50gattcttcattctcaacacacattg25<210>51<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>51tgattcgtagaccccacaca20<210>52<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>52aaggttaatgtcttctttttgaagtt26<210>53<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>53caagcgtcgaagatgaacaa20<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>54gctggctgcaaaagtttacc20<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>55gcacatgaaaaatgccaaag20<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>56ctgttgctgttggtggtgag20<210>57<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>57gttaccgatggccatgaatc20<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>58agcgagtgaagagggaagtg20<210>59<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>59atgcaaccggcgcagtat18<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>60ccaccttttcctcgcttttt20<210>61<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>61gccaaacggctttaaaacttc21<210>62<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>62tcgctgttggaaagagaagaa21當(dāng)前第1頁1 2 3