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      雙黃酮?錳配合物及其制備方法和應(yīng)用與流程

      文檔序號(hào):12776828閱讀:200來(lái)源:國(guó)知局
      雙黃酮?錳配合物及其制備方法和應(yīng)用與流程

      本發(fā)明屬于有機(jī)合成、醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種雙黃酮-錳配合物及其制備方法和應(yīng)用。



      背景技術(shù):

      雙黃酮類化合物是裸子植物特有的化學(xué)成分,例如銀杏、卷柏等,具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等生物活性。其中,穗花杉雙黃酮(Amentoflavone,Ame)是雙黃酮類化合物中較為常見(jiàn)的一種,其結(jié)構(gòu)式如下:

      Sun等研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮通過(guò)激活hPPARγ來(lái)提高抗癌基因的表達(dá),從而達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞的效果[Lee E.,Shin S.,Lee J.etal.Cytotoxic activities of amentoflavone against human breast and cervical cancers are mediated by increasing of pten expression levels due to peroxisome proliferator-activated receptorγactivation[J].Bulletin of the Korean Chemical Society,2012,33(7):2219-2223.]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮通過(guò)抑制因子NF-kappaB的活性,阻礙血管的生成和癌細(xì)胞的新陳代謝,達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的[Chen J.H.,Chen W.L.,Liu Y.C.Amentoflavone induces anti-angiogenic and anti-metastatic effects through suppression of NF-kappa B activation in MCF-7 cells[J].Anticancer Research,2015,35(12):6685-6693.]。Lee等研究發(fā)現(xiàn),穗花杉雙黃酮可以抑制由紫外輻射引起的金屬蛋白酶的表達(dá),從而起到抗氧化、防輻射的作用[Lee C.W.,Na Y.,Park N.,etal.Amentoflavone inhibits UVB-induced matrix metalloproteinase-1expression through the modulation of AP-1 Mnmponents in normal human fibroblasts[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2012,166:1137-1147.]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)穗花杉 雙黃酮和銀杏黃素具有一定的抗氧化活性,去除DPPH自由基的能力較強(qiáng)[Zhang Y.P.,Shi S.Y.,Wang Y.X.,etal.Target-guided isolation and purification of antioxidants from Selaginella sinensis by offline Mnupling of DPPH-HPLC and HSCCC experiments[J].Journal of Chromatography B,2011,879:191-196.]。Li等研究表明,穗花杉雙黃酮具有抗氧化活性,可有效清除OH-·,O2-·,DPPH·,ABTS+·等自由基,并可以保護(hù)DNA免受OH-·引起的氧化損傷[Li X.C.,Wang L.,Han W.J.,etal.Amentoflavone protects against hydroxyl radical-induced DNA damage via antioxidant mechanism[J].Turkish Journal of Biochemistry-Turk Biyokimya Dergisi,2014,39(1):30-36.]。

      中藥配位化學(xué)表明,微量元素和有機(jī)化合物反應(yīng)生成的配合物存在著配合平衡,所以可以呈現(xiàn)出原來(lái)成分的生物活性;又由于微量元素間、有機(jī)成分間、配合物間以及它們相互間的協(xié)同和拮抗作用可以減弱或增強(qiáng)原有各成分的生物活性,也可能產(chǎn)生新的生物活性[曹治權(quán).中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理研究新思路(一)-中藥中化學(xué)物種形態(tài)和生物活性關(guān)系的研究[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2000,14(1):36-39.]。例如,Zhou等研究發(fā)現(xiàn)槲皮素稀土配合物清除O2-·的能力均強(qiáng)于槲皮素,槲皮素稀土配合物可以抑制多種腫瘤,且抗腫瘤活性均強(qiáng)于槲皮素,其中配合物對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用,而槲皮素?zé)o此作用[Zhou J.,Wang L.F.,Wang J.Y.,etal.Synthesis,characterization,antioxidative and antitumor activities of solid quercetin rare earth(III)Mnmplexes[J].Journal of Inorganic Biochemistry,2001,83:41-48.]。

      到目前為止,有關(guān)雙黃酮配合物的合成及其生物活性的研究未見(jiàn)報(bào)道。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足,本發(fā)明的目的是提供一種穗花杉雙黃酮-錳配合物,滿足抗腫瘤和抗氧化藥物的使用需求。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述雙黃酮-錳配合物的制備方法。本發(fā)明還有一目的是提供雙黃酮-錳配合物的應(yīng)用。

      技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明的技術(shù)方案為:

      雙黃酮-錳配合物,結(jié)構(gòu)式如下:

      X為NO3-或Cl-

      一種制備所述雙黃酮-錳配合物的方法:將錳鹽用醇溶解后加入到雙黃酮的醇溶液中,控制pH為5-7,加熱攪拌,反應(yīng)2-5h,有沉淀產(chǎn)生,將沉淀過(guò)濾,用醇和水洗滌后用二甲亞砜作為溶劑重結(jié)晶,干燥,得雙黃酮-錳配合物。

      所述的雙黃酮-錳配合物在制備抗腫瘤藥物和/或抗氧化藥物中的應(yīng)用。

      所用雙黃酮為穗花杉雙黃酮,但不局限于穗花杉雙黃酮,泛指具有5-OH和4-C=O或5”-OH和4”-C=O的雙黃酮類化合物。

      所用錳鹽硝酸錳、氯化錳等醇溶性錳鹽。

      所用溶劑為乙醇、甲醇及不同濃度的甲醇、乙醇水溶液等。

      用堿的醇溶液調(diào)節(jié)pH值,所用堿包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、乙醇鈉、甲醇鈉等常用堿類。

      反應(yīng)時(shí),加熱溫度為30-50℃,反應(yīng)時(shí)間為2-5h。

      溶液中雙黃酮與錳離子的摩爾比為2-2.5:1。

      重結(jié)晶所用溶劑為二甲亞砜,干燥方法為冷凍干燥、低溫真空干燥等。

      有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明首次合成得到了穗花杉雙黃酮-錳配合物,采用MTT法研究了Ame-Mn配合物的抗腫瘤活性,結(jié)果表明,Ame-Mn配合物抑制肝癌細(xì)胞(HepG2)和宮頸癌細(xì)胞(HeLa)的能力強(qiáng)于Ame本身,紫外-可見(jiàn)吸收光譜、熒光光譜和粘度法表明Ame-Mn配合物抗腫瘤活性的機(jī)理可能是配合物與嵌入式插入DNA,引起細(xì)胞凋亡。鄰苯三酚自氧化法和ABTS法顯示Ame-Mn配合物清除自由基能力強(qiáng)于Ame本身,說(shuō)明配合物的抗氧化活性強(qiáng) 于Ame,有利于進(jìn)一步開發(fā)雙黃酮類化合物,為新藥研究提供依據(jù),有利于人類健康事業(yè)的發(fā)展。

      附圖說(shuō)明

      圖1是Ame和Ame-Mn配合物的紅外光譜譜圖;

      圖2是Ame和Ame-Mn配合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜譜圖;

      圖3是Ame質(zhì)譜圖;

      圖4是Ame-Mn配合物的質(zhì)譜圖;

      圖5是Ame和Ame-Mn配合物對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用結(jié)果圖;

      圖6是Ame和Ame-Mn配合物對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用結(jié)果圖;

      圖7是fDNA對(duì)Ame紫外-可見(jiàn)吸收光譜的影響結(jié)果圖;

      圖8是fDNA對(duì)Ame-Mn配合物紫外-可見(jiàn)吸收光譜的影響結(jié)果圖;

      圖9是Ame-Mn配合物對(duì)fDNA-EB體系熒光發(fā)射光譜的影響結(jié)果圖;

      圖10是Ame-Mn配合物對(duì)fDNA-EB體系熒光發(fā)射光譜的影響結(jié)果圖;

      圖11是Ame和Ame-Mn配合物對(duì)fDNA溶液粘度的影響結(jié)果圖;

      圖12是Ame對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響結(jié)果圖;

      圖13是Ame-Mn配合物對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響結(jié)果圖;

      圖14是Ame對(duì)ABTS+·自由清除能力結(jié)果圖;

      圖15是Ame-Mn配合物對(duì)ABTS+·自由清除能力結(jié)果圖。

      具體實(shí)施方式

      下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。

      實(shí)施例1

      精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中,用5mL乙醇溶解,精確稱量50%硝酸錳溶液17.9mg(含硝酸錳0.05mmol),加入到5mL乙醇中,將硝酸錳溶液滴加到Ame溶液中,向反應(yīng)溶液中滴加乙醇-氨水(V/V,3:1)溶液,調(diào)節(jié)pH為6,保持30℃反應(yīng)4-5h,產(chǎn)生沉淀,過(guò)濾,依次用乙醇、水洗滌,DMSO重結(jié)晶,冷凍干燥得Ame-Mn配合物。

      實(shí)施例2

      精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中,用5mL90%的乙醇溶解,精確稱量50%硝酸錳溶液17.9mg(含硝酸錳0.05mmol),加入到5mL90%的乙醇中,將硝酸 錳溶液滴加到Ame溶液中,向反應(yīng)溶液中滴加乙醇-乙醇鈉溶液,調(diào)節(jié)pH為5,保持30℃反應(yīng)4-5h,產(chǎn)生沉淀,過(guò)濾,依次用乙醇、水洗滌,DMSO重結(jié)晶,冷凍干燥得Ame-Mn配合物。

      實(shí)施例3

      精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中,用5mL甲醇溶解,精確稱量50%硝酸錳溶液17.9mg(含硝酸錳0.05mmol),加入到用5mL甲醇中,將硝酸錳溶液滴加到Ame溶液中,向反應(yīng)溶液中滴加甲醇-甲醇鈉溶液,調(diào)節(jié)pH為7,保持40℃反應(yīng)3-4h,產(chǎn)生沉淀,過(guò)濾,依次用甲醇、水洗滌,DMSO重結(jié)晶,冷凍干燥得Ame-Mn配合物。

      實(shí)施例4

      精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中,用5mL85%的甲醇溶解,精確稱量50%硝酸錳溶液17.9mg(含硝酸錳0.05mmol),加入到5mL85%的甲醇中,將硝酸錳溶液滴加到Ame溶液中,向反應(yīng)溶液中滴加甲醇-甲醇鈉溶液,調(diào)節(jié)pH為7,保持50℃反應(yīng)2-3h,產(chǎn)生沉淀,過(guò)濾,依次用甲醇、水洗滌,DMSO重結(jié)晶,冷凍干燥得Ame-Mn配合物。

      實(shí)施例5

      精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中,用5mL乙醇溶解,精確稱量四水合氯化錳9.9mg,用5mL乙醇溶解,將氯化錳溶液滴加到Ame溶液中,向反應(yīng)溶液中滴加乙醇-氨水(V/V,3:1)溶液,調(diào)節(jié)pH為6,保持30℃反應(yīng)4-5h,產(chǎn)生沉淀,過(guò)濾,依次用乙醇、水洗滌,DMSO重結(jié)晶,冷凍干燥得Ame-Mn配合物。

      實(shí)施例6

      精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中,用5mL90%的乙醇溶解,精確稱量四水合氯化錳9.9mg,用5mL90%的乙醇溶解,將氯化錳溶液滴加到Ame溶液中,向反應(yīng)溶液中滴加乙醇-乙醇鈉溶液,調(diào)節(jié)pH為5,保持30℃反應(yīng)4-5h,產(chǎn)生沉淀,過(guò)濾,依次用乙醇、水洗滌,DMSO重結(jié)晶,冷凍干燥得Ame-Mn配合物。

      實(shí)施例7

      精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中,用5mL甲醇溶解,精確稱量四水合氯化錳9.9mg,用5mL甲醇溶解,將氯化錳溶液滴加到Ame溶液中,向反應(yīng)溶液 中滴加甲醇-甲醇鈉溶液,調(diào)節(jié)pH為7,保持40℃反應(yīng)3-4h,產(chǎn)生沉淀,過(guò)濾,依次用甲醇、水洗滌,DMSO重結(jié)晶,冷凍干燥得Ame-Mn配合物。

      實(shí)施例8

      精確稱取53.8mg Ame于圓底燒瓶中,用5mL85%的甲醇溶解,精確稱量四水合氯化錳9.9mg,用5mL85%的甲醇溶解,將氯化錳溶液滴加到Ame溶液中,向反應(yīng)溶液中滴加甲醇-甲醇鈉溶液,調(diào)節(jié)pH為7,保持50℃反應(yīng)2-3h,產(chǎn)生沉淀,過(guò)濾,依次用甲醇、水洗滌,DMSO重結(jié)晶,冷凍干燥得Ame-Mn配合物。

      實(shí)施例9

      對(duì)實(shí)施例1-8制備的產(chǎn)物進(jìn)行表征,Ame和Ame-Mn配合物的紅外光譜圖如圖1所示。由圖可以看出,Ame在2800-3500cm-1有寬的吸收,這是締和羥基伸縮振動(dòng)峰,因?yàn)锳me分子中5-OH和4-C=O之間,5”-OH和4”-C=O之間形成了分子內(nèi)氫鍵。而Ame-Mn配合物中此處的吸收均變窄,且在3405cm-1左右的峰形變得尖銳,說(shuō)明形成配合物后,分子內(nèi)氫鍵遭到破壞;Ame中1657cm-1處的強(qiáng)峰為羰基的伸縮振動(dòng)引起的,是羰基的特征吸收峰,形成配合物后,此處吸收峰向低波數(shù)移動(dòng),移動(dòng)至1625cm-1,說(shuō)明羰基參與了配位;配合物在631cm-1之間產(chǎn)生一吸收峰,這是Mn-O伸縮振動(dòng)引起的,是氧原子參與配位的有力證明。因此,可以推測(cè),Ame中的羰基、羥基參與了配位,而最可能的配位點(diǎn)為5-OH,4-C=O,5”-OH和4”-C=O。

      Ame和Ame-Mn配合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜如圖2所示,Ame在337nm(帶I)和270nm(帶II)處有兩個(gè)特征吸收峰,這是黃酮類化合物的特征吸收,帶I和帶II分別對(duì)應(yīng)著桂皮酰系統(tǒng)和苯甲酰系統(tǒng)的紫外吸收,均為π-π*的躍遷引起的。Ame-Mn配合物在375-450nm之間產(chǎn)生吸收平臺(tái),為帶I紅移所致,說(shuō)明桂皮酰系統(tǒng)參與了配位,帶II雖然位置沒(méi)有明顯變化,但是吸收強(qiáng)度相對(duì)降低,且在298nm處還產(chǎn)生了新的吸收峰,這些現(xiàn)象表明共屬于桂皮酰系統(tǒng)和苯甲酰系統(tǒng)的羰基參與了配位,配位后,共軛體系增大,電子躍遷所需要能量降低,π-π*更易發(fā)生,故帶I發(fā)生紅移。而4-C=O更易發(fā)生n-π*躍遷,故在298nm處產(chǎn)生一新峰??梢酝茢啵琈n2+與Ame形成配合物的位點(diǎn)為5-OH,4-C=O,5”-OH,4”-C=O。

      在正離子模式下,分別對(duì)Ame及Ame-Mn配合物作了質(zhì)譜分析,并根據(jù)質(zhì)譜模擬得到譜圖上分子離子峰對(duì)應(yīng)的離子結(jié)構(gòu)式,并由此推斷出Ame-Mn的結(jié)構(gòu)。

      圖3為Ame在正離子模式的質(zhì)譜圖,準(zhǔn)分子離子峰m/z 539.0920歸屬為[Ame+H]+。圖4a為Ame-Mn配合物的質(zhì)譜圖,Ame-Mn配合物有兩個(gè)主要的準(zhǔn)分子離子峰,且均帶一個(gè)正電荷,分別為m/z 748.0492和m/z 826.0636。圖4b,為準(zhǔn)分子離子峰m/z 748.0492的同位素質(zhì)譜圖,可以看到準(zhǔn)分子離子峰m/z748.0492的同位素峰為m/z 749.0521,m/z 750.0523,m/z 751.0464,相鄰準(zhǔn)分子離子峰的分子量分別相差1.0029,1.0002和0.9941,從而證實(shí)該離子峰帶一個(gè)正電荷。由紅外和紫外光譜可知,Ame與Mn2+形成配合物的配位點(diǎn)為5-OH,4-C=O,5”-OH,4”-C=O。由于重結(jié)晶和溶解配合物的溶劑為DMSO,DMSO含有氧原子和硫原子,具有強(qiáng)的的配位能力,且較難電離,故配合物中可能含有DMSO,由此推測(cè)準(zhǔn)分子離子峰m/z 748.0492歸屬為[Mn(Ame-H)(DMSO)2]+,元素組成C34H29O12MnS3,與準(zhǔn)分子離子峰m/z 748.0492可能的元素組成一致(圖4c)。同時(shí),采用質(zhì)譜模擬軟件對(duì)[Mn(Ame-H)(DMSO)2]+進(jìn)行模擬,得到模擬質(zhì)譜圖,如圖4d所示。由圖可以看出[Mn(Ame-H)(DMSO)2]+的同位素離子峰有四個(gè),分別為m/z 748.0475,m/z 749.0509,m/z 750.0433,m/z 751.0467,與準(zhǔn)分子離子峰m/z 748.0492的同位素質(zhì)譜峰匹配度很高,因此,可以證實(shí)m/z 748.0492對(duì)應(yīng)的離子為[Mn(Ame-H)(DMSO)2]+。同理,準(zhǔn)分子離子峰m/z 826.0636(圖4e)對(duì)應(yīng)的離子為[Mn(Ame-H)(DMSO)3]+。綜上所述,Ame與Mn2+形成了1:1的配合物;紅外光譜和紫外-可見(jiàn)光譜證明Ame與Mn2+形成配合物的配位點(diǎn)為5-OH,4-C=O,5”-OH和4”-C=O;核磁數(shù)據(jù)顯示,Ame的5”-OH的化學(xué)位移比5-OH的化學(xué)位移大,說(shuō)明5”-OH的電子云密度較低,氫原子更易離去,酸性更強(qiáng),因此,Ame與Mn2+形成配合物的配位點(diǎn)為5”-OH和4”-C=O的可能最大。故[Mn(Ame-H)(DMSO)2]+和[Mn(Ame-H)(DMSO)3]+最有可能的結(jié)構(gòu)如下所示:

      可以發(fā)現(xiàn)離子[Mn(Ame-H)(DMSO)2]+和[Mn(Ame-H)(DMSO)3]+結(jié)構(gòu)相似,區(qū)別僅是含有不同數(shù)量的DMSO分子,其原因是離子[Mn(Ame-H)(DMSO)3]+在儀器電壓作用下失去一個(gè)DMSO,因此,配合物離子的結(jié)構(gòu)為[Mn(Ame-H)(DMSO)3]+。此外,由于試驗(yàn)中金屬鹽為硝酸鹽或鹽酸鹽,故配合物中含有硝酸根或氯離子,因此,Ame-Mn配合物的結(jié)構(gòu)式如下所示:

      X為NO3-或Cl-。

      實(shí)施例10

      采用MTT法研究了Ame和Ame-Mn配合物的抗腫瘤活性,過(guò)程如下:

      (1)將HepG2、HeLa細(xì)胞株懸浮液接種于96孔培養(yǎng)板,每孔加100μL,(1×105個(gè)/mL),37℃,于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;

      (2)培養(yǎng)24h后,棄上清液,加入100μL預(yù)先稀釋好的樣品,每個(gè)濃度設(shè)10個(gè)復(fù)孔,于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔(DMSO、細(xì)胞液、MTT)、調(diào)零孔(培養(yǎng)基、DMSO、MTT);

      (3)培養(yǎng)36h后,棄上清液,加入100μL含MTT(5mg/mL)的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)4h;

      (4)4h后小心去除上清,每孔加200μL DMSO,在恒溫振蕩器中充分振蕩15min,酶標(biāo)儀595nm處測(cè)定吸光度值,通過(guò)OD值計(jì)算樣品對(duì)HepG2、HeLa細(xì)胞的抑制率,運(yùn)用改良Karber公式算出半數(shù)抑制濃度IC50值。

      lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)(公式2)

      式中,IR為抑制率,OD0為對(duì)照組的吸光度,OD1為樣品組的吸光度,Xm為lg(最大劑量),I為lg(最大劑量/相鄰劑量),P為陽(yáng)性反應(yīng)率之和,Pm為最大陽(yáng)性反應(yīng)率,Pn為最小陽(yáng)性反應(yīng)率。

      結(jié)果如圖5-6所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ame-Mn配合物能有效抑制肝癌細(xì)胞HepG2和宮頸癌細(xì)胞HeLa的生長(zhǎng),IC50值分別為5.286和5.503μmol·L-1,比Ame的IC50值小(Ame的IC50值分別為13.633和8.040μmol·L-1),說(shuō)明Ame-Mn配合物抗腫瘤活性較好,且強(qiáng)于Ame。采用紫外-可見(jiàn)光譜法、熒光光譜法和粘度法研究了Ame和Ame-Mn配合物與鯡魚精DNA(fDNA)的相互作用,以進(jìn)一步揭示抗腫瘤活性的機(jī)理,所得圖譜如圖7-11所示,結(jié)果表明,Ame和Ame-Mn配合物與fDNA的相互作用為嵌插模式,且配合物與fDNA作用能力均強(qiáng)于Ame。由此可以推測(cè),Ame及其配合物的抗腫瘤活性的機(jī)理可能是Ame或其配合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,與DNA鏈發(fā)生嵌插作用,引起細(xì)胞凋亡。由于配合物與DNA的相互作用強(qiáng)于Ame,故其抗腫瘤活性也強(qiáng)于Ame。

      實(shí)施例11

      采用鄰苯三酚自氧化法、ABTS法研究了Ame和Ame-Mn配合物清除自由基能力,步驟如下:

      (1)鄰苯三酚自氧化法

      鄰苯三酚自氧化速率V0的測(cè)定:25℃下,在10mL樣品管中加入2mL的Tris-HCl緩沖液(pH=8.20),并加入100μL DMSO作為對(duì)照,加入0.8mL蒸餾水后,再加入濃度為2mmol·L-1的鄰苯三酚溶液0.2mL,混勻后倒入比色皿中,以純水為空白,測(cè)定322nm處的吸光度,每10s記錄一次A值,共反應(yīng)4min。以t為橫坐標(biāo),A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,其直線斜率為V0,測(cè)定三次,求平均 值。

      加入樣品后鄰苯三酚自氧化速率V1的測(cè)定:25℃下,在10mL樣品管中加入2mL的Tris-HCl緩沖液(pH=8.2),并加入100μL不同濃度的樣品DMSO溶液,加入0.8mL蒸餾水后,再加入濃度為2mmol·L-1的鄰苯三酚溶液0.2mL,混勻后倒入比色皿中,以雙蒸水為空白,測(cè)定322nm處的吸光度,每10s記錄一次A值,共反應(yīng)4min。以t為橫坐標(biāo),A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,其直線斜率為V1,測(cè)定三次,求平均值。根據(jù)公式3計(jì)算自由基清除率。

      SR(%)=(1-v1/v0)×100%(公式3)

      (2)ABTS法

      空白樣清除ABTS+·自由基離子能力測(cè)定:25℃下,在10mL樣品管中加入2.9mL的ABTS+·自由基離子工作液,并加入100μL DMSO,反應(yīng)5min后,測(cè)量紫外-可見(jiàn)光譜,并記錄730nm處的吸收強(qiáng)度A0。

      樣品清除ABTS+·自由基離子能力測(cè)定:25℃下,在10mL樣品管中加入2.9ml的ABTS+·自由基離子工作液,并加入100μL不同濃度的樣品DMSO溶液,反應(yīng)5min后,測(cè)量紫外-可見(jiàn)光譜,并記錄730nm處的吸收強(qiáng)度A1。根據(jù)公式4計(jì)算ABTS+·自由基離子清除率。

      SR(%)=(1-A1/A0)×100%(公式4)

      如圖12-15所示。鄰苯三酚自氧化法結(jié)果表明Ame和Ame-Mn配合物清除O2-·自由基IC50為23.273μmol·L-1和5.716μmol·L-1,可以發(fā)現(xiàn)Ame-Mn配合物清除O2-·自由基的能力明顯強(qiáng)于Ame。

      Ame和Ame-Mn配合物對(duì)ABTS+·自由基的清除能力具有濃度依賴性,在一定的范圍內(nèi),清除率與濃度呈線性關(guān)系。本發(fā)明繪制了清除率與濃度(c)的曲線,得到相應(yīng)的線性方程,并計(jì)算得到最大半抑制濃度(IC50值),Ame和Ame-Mn配合物清除ABTS+·自由基的IC50值分別為20.703和10.175μmol·L-1,可以看出,Ame-Mn配合物清除ABTS+·自由基的能力明顯強(qiáng)于Ame。

      本發(fā)明首次合成得到了穗花杉雙黃酮-錳配合物,并對(duì)其抗腫瘤和抗氧化活性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn),配合物的抗腫瘤、抗氧化活性均強(qiáng)于雙黃酮本身,開辟了雙黃酮類配合物的研究工作,為新藥研發(fā)提供了重要的參考價(jià)值。

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