本發(fā)明涉及藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種含生物堿的磷酸酯類化合物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，植物致病病原真菌和病毒嚴(yán)重威脅我國的糧食及農(nóng)作物的生產(chǎn)，為了控制病毒性病害和真菌性病害，迫切需要制備高效的抗致病病原真菌和病毒的活性小分子，是當(dāng)前新農(nóng)藥創(chuàng)制研發(fā)的重要環(huán)節(jié)。

而基于含生物堿的磷酸酯類化合物因具有廣泛的生物活性(如抗hivhcv)成為研究學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。同時(shí)，含磷類化合物在農(nóng)藥方面表現(xiàn)出廣譜的生物活性，如商品化的抗病毒藥劑毒氟磷(dufulin)。

為了尋找高效殺菌的活性化合物，本發(fā)明以磷酸酯類化合物為基礎(chǔ)，將可能增強(qiáng)目標(biāo)化合物生物活性的生物堿類基團(tuán)引入到此體系中，合成一系列含生物堿的磷酸酯類化合物，測試其生物活性，為新農(nóng)藥的研發(fā)和創(chuàng)制提供重要的科學(xué)基礎(chǔ)。

基于生物堿的磷酸酯類化合物的生物活性研究進(jìn)展如下：

2008年，hu等[hu,d.y.；wan,q.q.；yang,s.；song,b.a.；bhadury,p.s.；jin,l.h.；yan,k.；liu,f.；chen,z.；xue,w.synthesisandantiviralactivitiesofamidederivativescontainingtheα-aminophsphonatemoiety[j].j.agric.foodchem.,2008,56(3)：998-1001]在傳統(tǒng)氨基磷酸酯的基礎(chǔ)上，在氨基上引入羰基后形成酰胺鍵的結(jié)構(gòu)，由此設(shè)計(jì)了一系列含有酰胺結(jié)構(gòu)的α-氨基磷酸酯類化合物；采用半葉法測試目標(biāo)化合物的抗煙草花葉病毒活性發(fā)現(xiàn)，在500μg/ml的濃度下，化合物6a,6d的治療活性分別為53.6％和55.0％，與對照藥劑寧南霉素相當(dāng)(55.0％)。

2008年，long等[long,n.；cai,x.j.；song,b.a.；yang,s.；chen,z.；pinaki,s.b.；hu,d.y.；jin,l.h.；xue,w.synthesisandantiviralactivitiesofcyanoacrylatederivativescontaininganα-aminophsphonatemoiety.j.agric.foodchem.,2008,56(13)：5242-5246]設(shè)計(jì)合成了一系列硫氰酸酯的磷酸酯類化合物；生物活性測試表明，在500μg/ml的濃度下，化合物7對tmv具有較好的活性，其鈍化活性ec50值為55.5μg/ml，略高于寧南霉素(ec50＝50.9μg/ml)。

2011年，dimitri等[dimitri,t.；ugo,p.；robert,s.；staffan,e.；philippe,m.；jan,b.；luigi,a.novelantiviralc5-substitutedpyrimidineacyclicnucleosidephosphonatesselectedashumanthymidylatekinasesubstrates.j.med.chem.2011,54,222–232]以病毒的dna聚合酶為靶標(biāo)，通過開環(huán)核苷類藥物的合成來實(shí)現(xiàn)dna病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶療法；通過在尿嘧啶碳上的5號位引入不同的取代基進(jìn)行化合物的拓展，在e式構(gòu)型中，部分衍生物與單磷酸胞苷酶有很好的結(jié)合性，并能從復(fù)合物中結(jié)晶出來；在離體的條件下，比起相應(yīng)的z式結(jié)構(gòu)e-9d和e-9e展示出較好的抗皰疹病毒活性(ic50＝3μm)。

2012年，luo等[luo,h.；hu,d.y.；wu,j.；he,m.；jin,l.h.；yang,s.song,b.a.aapidsynthesisandantiviralactivityof(quinazolin-4-ylamino)methyl-phosphonatesthroughmicrowaveirradiation.int.j.mol.sci.,2012,13(6)：6730-6746]通過將喹唑啉引入磷酸酯的結(jié)構(gòu)中，采用微波輔助法設(shè)計(jì)合成了一系列含有喹唑啉結(jié)構(gòu)的磷酸酯類化合物；通過抗tmv活性測試，結(jié)果表明11a,11b,11c表現(xiàn)出較好的抗tmv活性，在500μg/ml的濃度下，其治療活性分別為52.0％，49.1％和51.7％略低于對照藥劑寧南霉素(55.9％)

2013年，hong等[hong,y.p.；shangguan,x.c.；li,d.m.；microwave-assistedsyntheses,structuresandbioactivitiesofα-aminophosphonatescontainingpyrazoleand2-hydroxybenzylunits.chin.j.struc.chem.,2013,32(11)：1639-1646]采用微波輔助，無溶劑無催化劑的條件下設(shè)計(jì)合成一系列含有吡唑結(jié)構(gòu)的磷酸酯類化合物；通過抗tmv活性測試表明，該類化合物在500μg/ml的濃度下具有一定的抗病毒活性。

2014年，zhang等[zhang,p.w.；tang,c.h.；chen,z.w.；wang,b.；yang,s.hu,d.y.；thedesign,synthesisandantiviralactivityofα-aminophosphonatesbearingabenzothiophenemoiety.phosphorus,sulfursiliconrelat.elem.,2014,189(4)：530-540]在抗病毒商品藥病毒星結(jié)構(gòu)上進(jìn)行改造，引入苯并噻吩結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成了一系列磷酸酯類化合物，并采用半葉枯斑法對其進(jìn)行抗tmv活性測試，測試結(jié)果表明部分化合物在500μg/ml的濃度下具有一定的抗病毒活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種含生物堿的磷酸酯類化合物及其制備方法及應(yīng)用，它對致病病原真菌和病毒具有良好的抑制效果，且其合成方法非常經(jīng)濟(jì)簡便。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種含生物堿的磷酸酯類化合物，其特征在于：該化合物具有如通式(ⅰ)所示的結(jié)構(gòu)：

式中，r1為含氮雜環(huán)或具有一個(gè)以上的取代基的含氮雜環(huán)，所述的取代基為氫、c1-4烷基、三氟甲基、羥基、c1-3烷氧基、三氟甲氧基、丙烯基、丙烯酰胺基、氨基、c1-3烷氨基、硝基或鹵素原子；r2為氫、c1-4烷基或苯基。

可為取代四氫喹啉、取代四氫異喹啉、取代嘌呤、取代嘧啶、取代嗎啉、取代咪唑等

2、一種如權(quán)利要求1所述的含生物堿的磷酸酯類化合物的制備方法，其特征在于：其合成路線如下；

式中，r1為含氮雜環(huán)或具有一個(gè)以上的取代基的含氮雜環(huán)，所述的取代基為氫、c1-4烷基、三氟甲基、羥基、c1-3烷氧基、三氟甲氧基、丙烯基、丙烯酰胺基、氨基、c1-3烷氨基、硝基或鹵素原子；r2為氫、c1-4烷基或苯基。

含生物堿的磷酸酯類化合物在制備抗致病病原真菌和病毒的藥物中的應(yīng)用。

通過采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明以磷酸酯類化合物為基礎(chǔ)，將可能增強(qiáng)目標(biāo)化合物生物活性的生物堿基引入到此體系中，合成一系列含磷酸酯的生物堿類化合物，且發(fā)現(xiàn)該化合物對致病病原真菌和病毒具有良好的抑制作用，針對病原真菌如馬鈴薯晚疫病菌(p.infestans)、水稻紋枯病菌(t.cucumeris)、黃瓜灰霉病菌(b.cinerea)、病毒如煙草花葉病毒(tobaccomosaicvirus)、黃瓜花葉病毒(cucumbermosaicvirus)等均具有良好的抑制效果，為新農(nóng)藥的研發(fā)和創(chuàng)制提供重要的科學(xué)基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施例1：目標(biāo)化合物4-(2-(2,4-二氧代-3,4-二氫嘧啶-1(2h)基乙酰氨基)苯甲酸-二乙氧磷?；柞サ闹苽?/p>

將0.11g(1.0mmol)2,4-二氧代-3,4-二氫嘧啶與0.20g(0.5mmol)4-(2-溴乙酰氨基)苯甲酸-二乙氧磷酰基甲酯裝入25ml圓底燒瓶中，再加入0.13g(1.0mmol)碳酸鉀與2mldmf，室溫下反應(yīng)4h后停止反應(yīng)，加入80ml乙酸乙酯，用飽和氯化銨溶液(20ml×3)洗滌，萃取，濃縮，柱色譜分離。得白色固體0.17g，收率78.0％，熔點(diǎn)：233-234℃。

合成的部分含生物堿的磷酸酯類化合物的結(jié)構(gòu)及核磁共振數(shù)據(jù)如表1所示，物化性質(zhì)如表2所示。

表1部分目標(biāo)化合物的核磁共振氫譜、碳譜和磷譜數(shù)據(jù)

表2部分目標(biāo)化合物的理化性質(zhì)

藥理實(shí)施例1：部分目標(biāo)化合物的抑真菌活性試驗(yàn)

在50μg/ml的濃度下，以多菌靈為對照藥劑，選用3種致病病原真菌為供試對象，采用生長速率法對部分化合物進(jìn)行了生物活性測試，其結(jié)果見表3。

表3含生物堿的磷酸酯類化合物對植物病原真菌的抑制活性

從表3可以看出，測試結(jié)果表明，該系列化合物具有抗真菌活性，其中化合物5和22在濃度為50μg/ml下，對黃瓜灰霉病菌的抑制率分別為70.4％和71.0％；可見本發(fā)明的化合物部分可用于制備抗植物致病病原真菌農(nóng)藥。

藥理實(shí)施例2：部分目標(biāo)化合物的抗病毒活性實(shí)驗(yàn)(抗煙草花葉病毒)

采用半葉斑法測定化合物的抗植物病毒活性。準(zhǔn)確稱取3mg供試化合物于稱量瓶中，加入溶劑dmso60ul使其充分溶解。用含1％tween20的二次蒸餾水將其配成500mg/l的化合物溶液。另取250ul2％寧南霉素水劑，加入溶劑dmso60ul，含1％tween20的二次蒸餾水10ml，配成500mg/l的寧南霉素溶液。

藥劑對tmv侵染的活體治療活性。選取長勢一致的心葉煙，先用排比蘸取病毒液(濃度為6×10^-3mg/ml)，在葉面(全葉)沿其支脈方向人工摩擦接種于撒有金剛砂的葉片上，左右葉片的接種力度盡量保持一致，葉片下方用平整木板支撐。待病毒液干后，用流水沖洗掉葉片上面的金剛砂。待葉片干后，在左半葉涂施藥劑，右半葉涂施滅菌水作對照。每藥劑處理設(shè)3株，每株3-4片葉，隨后將植株放在光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，控制溫度23℃，光照10000lux，2-4d后觀察并記錄產(chǎn)生枯斑的數(shù)目。按上述方法每藥劑進(jìn)行3次重復(fù)，計(jì)算抑制率。

藥劑對tmv侵染的活體保護(hù)活性。選取長勢一致的心葉煙，用毛筆輕輕在左半葉涂施藥劑，右半葉涂施滅菌水作對照，24小時(shí)后接種病毒。用排筆蘸取病毒汁液(濃度為6x10^-3mg/ml)，在葉面(全葉)沿其支脈方向人工摩擦接種于撒有金剛砂的葉片上，左右葉片的接種力度盡量保持一致，葉片下方用平整木板支撐。待病毒液干后，用流水沖洗掉葉片上面的金剛砂。每藥劑處理設(shè)3株，每株3-4片葉，隨后將植株放在光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，控制溫度23℃，光照10000lux，2-4d后觀察并記錄產(chǎn)生枯斑的數(shù)目。按上述方法每藥劑進(jìn)行3次重復(fù)，計(jì)算抑制率。y(％)＝(r-l)/r×100％

其中:y為化合物對對煙草花葉病毒的抑制率；r為對照組(右半葉)枯斑個(gè)數(shù)，；l為處理組(左半葉)枯斑個(gè)數(shù)。本發(fā)明實(shí)施例輔以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但實(shí)施例的內(nèi)容并不局限于此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4含生物堿的磷酸酯類化合物在濃度500μg/ml對煙草花葉病毒的活性

從表4可以看出，測試結(jié)果表明，該系列化合物具有的抗煙草花葉病毒保護(hù)和治療活性；在500μg/ml下，化合物2、16和22的治療活性分別為43.5、48.6和43.2％，略低于寧南霉素(54.2％)；化合物9和18的保護(hù)活性分別為60.7和59.3％，略低于寧南霉素(70.2％)，可見本發(fā)明的化合物部分可用于制備抗煙草花葉病毒的農(nóng)藥。

藥理實(shí)施例3：部分目標(biāo)化合物的抗病毒活性實(shí)驗(yàn)(抗黃瓜花葉病毒)

測試方法參照藥理實(shí)施例2，其測試結(jié)果表5所示：

表5含生物堿的磷酸酯類化合物在濃度500μg/ml對黃瓜花葉病毒的抑制活性

從表5可以看出，測試結(jié)果表明，該系列化合物具有的抗黃瓜花葉病毒保護(hù)和治療活性；在500μg/ml下，化合物9和14的保護(hù)活性分別為48.5和38.4％，與寧南霉素48.5％相當(dāng)，化合物2和12的治療活性分別為35.5％和36.1％，略低于寧南霉素。可見本發(fā)明的化合物部分可用于制備抗黃瓜花葉病毒的農(nóng)藥。